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替加環(huán)素用于治療癌癥的用途的制作方法

文檔序號(hào):5937937閱讀:607來源:國(guó)知局
專利名稱:替加環(huán)素用于治療癌癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于治療癌癥的方法和組合物,尤其涉及包含替加環(huán)素以用于治療白血病的方法和組合物,所述白血病例如急性髓性白血病(AML )。
背景技術(shù)
癌癥干細(xì)胞目前癌癥治療最有挑戰(zhàn)性的方法可能即癌癥干細(xì)胞(CSC)。在1961年首次由Till和McCulloch1描述了干細(xì)胞,通常通過干細(xì)胞自我更新和分化成各種細(xì)胞類型的能力的潛力對(duì)其進(jìn)行定義。據(jù)信,包括少部分腫瘤的癌癥干細(xì)胞具有開始和支持腫瘤發(fā)生過程的能力。在治療過程中難以根除它們,因此它們已經(jīng)成為癌癥治療的引人興趣的目標(biāo)。用于癌癥干細(xì)胞假說的很多證據(jù)來自惡性血液病的研究。Dick和同事進(jìn)行的研究2在來自急性髓性白血病(AML)患者的外周血的小隔室(compartment)中發(fā)現(xiàn)了白血病干細(xì)胞(LSC)。然后他們得以將這些LSC成功地移植到非肥胖糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠的骨髓,在該處,這些人細(xì)胞增殖并且所散布的表型類似于原患者中的表型。因此,LSC的當(dāng)前功能標(biāo)準(zhǔn)為向NOD-SCID小鼠中的成功移植。盡管LSC具有自我更新和分化的能力,證據(jù)表明,在靜止GO期中發(fā)現(xiàn)大量LSC3。這可能是化學(xué)療法無法去除LSC的原因,因?yàn)榛瘜W(xué)療法通常靶向處于快速周期中的細(xì)胞群。LSC抗藥物和毒素的其它原因可能是ATP相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)4和對(duì)細(xì)胞凋亡刺激的抗性5。因此,發(fā)現(xiàn)將直接作用于白血病干細(xì)胞存活力的新的治療性化合物,可能是有益的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面包括在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的方法,所述方法包括使所述細(xì)胞接觸甘氨酰環(huán)素。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括治療癌癥的方法,所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的甘氨酰環(huán)素,例如替加環(huán)素。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括甘氨酰環(huán)素用于治療癌癥的用途,所述甘氨酰環(huán)素例如替加環(huán)素。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述甘氨酰環(huán)素包括替加環(huán)素。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述癌癥為血液癌癥或?qū)嶓w癌。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述血液癌癥為白血病。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述白血病為急性髓性白血病(AML)。出于下述詳細(xì)表述,本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。然而,應(yīng)該理解,所述詳細(xì)描述和具體實(shí)施例盡管指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,但是其僅通過示例的方式給出,其原因在于,出于此詳細(xì)描述,在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。附圖
簡(jiǎn)沭現(xiàn)將關(guān)于附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方式,其中圖I. TEX和M9-ENL-1細(xì)胞中的篩選鑒定了具有新的抗白血病活性的替加環(huán)素。(A)將TEX和(B)M9-ENL1細(xì)胞鋪板于96孔板中,然后將藥物加入孔中(5 μ I /孔),最終濃度為10 μ M (示出)和I μΜ。在48小時(shí)(M9-ENL-1)和72小時(shí)(TEX)通過MTS測(cè)定測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力。以占單獨(dú)用DMSO治療的細(xì)胞的百分比示出了每種化合物的細(xì)胞存活力。將(C)白血病、(D)骨髓瘤、和(E)實(shí)體瘤細(xì)胞系接種于96孔板中,然后用濃度漸增的替加環(huán)素處理。在72小時(shí)通過MTS測(cè)定測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力。將細(xì)胞存活力表示為相對(duì)于經(jīng)溶媒處理的細(xì)胞的百分比平均值加或減SD (η = 3)。(F)通過流式細(xì)胞術(shù)以膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記的細(xì)胞的百分比進(jìn)行測(cè)定,替加環(huán)素在TEX細(xì)胞中顯示了細(xì)胞凋亡的時(shí)間 依賴性的增加。(G)將TEX細(xì)胞接種于96孔板中,然后用濃度漸增的替加環(huán)素、米諾環(huán)素和四環(huán)素處理。在72小時(shí)通過MTS測(cè)定測(cè)量細(xì)胞存活力。將細(xì)胞存活力表示為相對(duì)于經(jīng)溶媒處理的細(xì)胞的百分比平均值加或減SD (η = 3)。圖2.替加環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并且優(yōu)先于正常造血細(xì)胞抑制原代AML細(xì)胞的族群性生長(zhǎng)。用濃度漸增的替加環(huán)素處理來自白血病患者外周血的單核細(xì)胞(母細(xì)胞計(jì)數(shù)>80%)和正常G-CSF發(fā)展供體48小時(shí)。通過膜聯(lián)蛋白-PI流式細(xì)胞術(shù)染色測(cè)量細(xì)胞存活力。將細(xì)胞存活力表示為相對(duì)于經(jīng)DMSO處理的細(xì)胞的百分比平均值加或減SD (η = 3)。將來自原代AML患者樣品的單核細(xì)胞(Α、B)和正常外周血細(xì)胞(C)鋪板于具有5 μ M替加環(huán)素的甲基纖維素中。(D)在鋪板后7天(AML)和14天(正常)對(duì)集落形成單元進(jìn)行計(jì)數(shù)。相比于經(jīng)DMSO處理的所鋪細(xì)胞表示集落形成百分比。圖3.替加環(huán)素具有體內(nèi)抗白血病活性。(Α、Β)將人白血病(0CI-AML2)皮下注射到SCID小鼠的側(cè)腹中。注射后7天,當(dāng)可摸出腫瘤時(shí),用替加環(huán)素(每天2次腹膜內(nèi)注射50mg/kg或100 mg/kg)或溶媒對(duì)照治療小鼠(n = 10只/組)。細(xì)胞注射后14天,處死小鼠,切除腫瘤,測(cè)量腫瘤的體積和質(zhì)量。示出了腫瘤質(zhì)量和體積平均值+ SD0通過非成對(duì)t檢驗(yàn)* p〈0. 001分析腫瘤體積和質(zhì)量的差異。(C)治療5天后,從2只對(duì)照小鼠和3只經(jīng)替加環(huán)素處理的小鼠中切出腫瘤,提取總蛋白,然后通過蛋白質(zhì)印記分析Cox-1、Cox-2、Cox-4、和微管蛋白。(D)將來自3位AML患者的原代細(xì)胞經(jīng)股內(nèi)注射到經(jīng)亞致死劑量輻照的雌性N0D/SCID小鼠的右側(cè)股骨中。注射后3周,用替加環(huán)素(通過每天腹膜內(nèi)注射100 mg/kg)或溶媒對(duì)照(η = 10 /組)治療小鼠3周。治療之后,通過FACS分析測(cè)量經(jīng)注射的右側(cè)股骨中的人白血病細(xì)胞移植的人CD45+CD19 —CD33+細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示被移植的人細(xì)胞的平均值土 SD。將來自一個(gè)患者實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞用于評(píng)估第二代N0D/SCID小鼠的第二次移植。將相等數(shù)量的來自對(duì)照和經(jīng)替加環(huán)素處理小鼠的骨髓的活白血病細(xì)胞注射到經(jīng)輻照的N0D/SCID小鼠中,所述小鼠未用替加環(huán)素處理。6周之后,通過FACS分析測(cè)量經(jīng)注射的右側(cè)股骨中的人白血病細(xì)胞移植的人CD45+CD19 —CD33+細(xì)胞。(氺ρ〈 O. 005, Student t檢驗(yàn))。圖4.替加環(huán)素降低TEX細(xì)胞中的線粒體Cox-I蛋白水平。(A)用濃度漸增(2. 5μ M和5 μ Μ)的替加環(huán)素處理來自TEX、0CI-AML2和2位原代AML患者的細(xì)胞,并進(jìn)行替加環(huán)素的36和48小時(shí)。提取總蛋白,然后通過蛋白質(zhì)印記分析Cox-1、Cox-2、Cox-4>grp78、XIAP、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白。(B)用濃度漸增(2. 5 μ M和5 μ Μ)的替加環(huán)素處理TEX和AML患者細(xì)胞。通過定量RT-PCR測(cè)定相對(duì)18S的Cox-l、Cox_2、和Cox_4 mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值土 SD表示。(C)用濃度漸增的替加環(huán)素和氯四環(huán)素(CAP)處理TEX細(xì)胞72小時(shí)。如“材料和方法”中所述測(cè)定相對(duì)于檸檬酸合酶活性的復(fù)合物Ι、Π和IV酶活性。(D)用濃度漸增的替加環(huán)素處理來自ΤΕΧ、原代AML患者、和正常供體的細(xì)胞。通過用JC-染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和流式細(xì)胞術(shù)分析(紅/綠比率)測(cè)定線粒體膜電勢(shì)(Λ ψ )。通過用h2-DCFDA和Dihydroethidium (DHE)染色測(cè)定活性氧物質(zhì)產(chǎn)生(R0S)。圖5.急性髓性白血病細(xì)胞的線粒體特征。(A)測(cè)定來自原代AML和正常的經(jīng)G-CSF動(dòng)員供體的外周血的單核細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)。從細(xì)胞中提取DNA,以及進(jìn)行線粒體NDl相對(duì)于人球蛋白(HGB)的實(shí)時(shí)PCR。示出了相對(duì)于來自一個(gè)正常的經(jīng)G-CSF動(dòng)員供體的細(xì)胞的ND1/HGB比率。(B)評(píng)估AML大量母細(xì)胞和⑶45+/⑶34+細(xì)胞中的線粒 體質(zhì)量,并與來自正常的經(jīng)G-CSF動(dòng)員個(gè)體的⑶45+/⑶34+細(xì)胞進(jìn)行比較。通過將細(xì)胞與Mitotracker Green FM染料一起孵育、以及進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)量線粒體質(zhì)量。示出了相對(duì)于一個(gè)正常的經(jīng)G-CSF動(dòng)員供體的中位熒光強(qiáng)度。(C)使用Mitotracker Green FM方法測(cè)量來自11位AML患者的母細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量。然后將細(xì)胞與濃度漸增的替加環(huán)素一起孵育48小時(shí)。通過膜聯(lián)蛋白-V/PI染色和之后的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估存活力。示出了基線線粒體質(zhì)量與對(duì)劑量為5 μ M和10 μ M的替加環(huán)素的敏感性之間的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式I.定義如本文使用的術(shù)語“甘氨酰環(huán)素”表示任何四環(huán)素的任何甘氨?;苌?,例如叔-丁基-甘氨?;0坊苌?,并包括任何鹽形式,例如它們的任何藥學(xué)上可接受的鹽、對(duì)映體、立體異構(gòu)體、溶劑化物、前藥或混合物。例如,參見6’7。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述甘氨酰基衍生物為四環(huán)素,其中甘氨酰基連接在四環(huán)結(jié)構(gòu)的第9位處。如本文使用的“甘氨酰基”表示下式的基團(tuán)
O R'其中R’和R〃獨(dú)立地選自基團(tuán)H、C1,烷基、C6,芳基和C3_1(l環(huán)烷基,或R’和R〃相連接從而與它們連接的氮在一起形成3至10元環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中,R’和R"中的一者為H,R’和R"中的另一者為CV6烷基(分支的或不分支的)。如本文使用的術(shù)語“替加環(huán)素”表示具有以下結(jié)構(gòu)的化合物
權(quán)利要求
1.一種在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的方法,所述方法包括使所述癌細(xì)胞接觸甘氨酰環(huán)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其用于治療癌癥,其中所述癌細(xì)胞在受試者中,并且給所述受試者施用有效量的甘氨酰環(huán)素。
3.甘氨酰環(huán)素用于治療癌癥的用途。
4.一種甘氨酰環(huán)素化合物,其用于治療癌癥。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療癌癥的方法,所述方法包括a)從受試者獲得測(cè)試樣品山)測(cè)定所述測(cè)試樣品的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量;c)將所述測(cè)試樣品的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量與對(duì)照的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量比較,以及d)當(dāng)與所述對(duì)照的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量相比,所述測(cè)試樣品的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量增加至少2倍時(shí),給所述受試者施用甘氨酰環(huán)素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘氨酰環(huán)素用于治療癌癥的用途,與對(duì)照相比,所述癌癥的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量增加至少2倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途或根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物,其中所述甘氨酰環(huán)素為替加環(huán)素。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法、用途或化合物,其中所述癌細(xì)胞在體內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法、用途或化合物,其中所述癌癥為血液癌癥,或者所述癌細(xì)胞為血液癌細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法、用途或化合物,其中所述血液癌癥為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤,或者所述癌細(xì)胞為白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法、用途或化合物,其中所述白血病為AML、ALL、CLL或CML,或者所述白血病細(xì)胞為AML細(xì)胞、ALL細(xì)胞、CLL細(xì)胞或CML細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項(xiàng)所述的方法、用途或化合物,其中所述癌癥為實(shí)體瘤癌癥,或者所述癌細(xì)胞為實(shí)體瘤癌細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法、用途或化合物,其中所述實(shí)體瘤癌癥為肺癌、卵巢癌或前列腺癌,或者所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項(xiàng)所述的方法、用途或化合物,其中所述施用的甘氨酰環(huán)素被包含在組合物、劑量或劑型中,所述甘氨酰環(huán)素例如替加環(huán)素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法、用途或化合物,其中所述組合物包含有效量的甘氨酰環(huán)素和任選的合適的載體或介質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法、用途或化合物,其中所述組合物為藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法、用途或化合物,其中所述藥物組合物的劑型選自固體劑型和液體劑型。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法、用途或化合物,其中所述組合物通過胃腸外、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、顱骨內(nèi)、眶內(nèi)、眼內(nèi)、心室內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、噴霧或口服給藥施用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法、用途或化合物,其中所述組合物包括可注射劑型。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法、用途或化合物,其中所述組合物通過腫瘤內(nèi)注射或腫瘤內(nèi)血管系統(tǒng)注射施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法、用途或化合物,其中每個(gè)單位劑型包含約100mg至約 2000 mg、約 100 mg 至約 1500 mg、約 100 mg 至約 1000 mg、約 100 mg 至約 700 mg、約100 mg 至約 500 mg、約 100 mg 至約 350 mg、約 100 mg 至約 300 mg 或約 100 mg 至約 250mg的甘氨酰環(huán)素,例如替加環(huán)素。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法、用途或化合物,其中每個(gè)單位劑型包含約20至約100mg的甘氨酰環(huán)素/kg受試者體重、約30至約100 mg的甘氨酰環(huán)素/kg受試者體重、約40至約100 mg的甘氨酰環(huán)素/kg受試者體重、或約50至約100 mg的甘氨酰環(huán)素/kg受試者體重,所述受試者需要配制成固體口服劑型、液體口服劑型或可注射劑型的此治療劑。
23.一種鑒別可能受益于甘氨酰環(huán)素給藥的受試者的方法,所述方法包括 從受試者獲得測(cè)試樣品; 測(cè)定所述測(cè)試樣品的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量;和 將所述測(cè)試樣品的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量與對(duì)照的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量比較, 其中當(dāng)與所述對(duì)照相比,所述癌細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)和/或線粒體質(zhì)量增加至少2倍時(shí),所述受試者被鑒別為可能受益于甘氨酰環(huán)素給藥。
24.一種試劑盒,其包括用于根據(jù)權(quán)利要求I至23中任一項(xiàng)所述的方法、用途或化合物的甘氨酰環(huán)素和說明和/或包裝物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒,其中所述甘氨酰環(huán)素為替加環(huán)素。
全文摘要
癌癥干細(xì)胞顯示出與其它癌細(xì)胞不同的代謝譜,使得它們不易于對(duì)使用常規(guī)化學(xué)治療劑的治療反應(yīng)。本文公開的研究現(xiàn)在證明,甘氨酰環(huán)素抗生素替加環(huán)素(四環(huán)素衍生物)顯示出抗癌活性,包括抗癌癥干細(xì)胞的活性。這種抗瘤活性看起來是由抑制癌細(xì)胞中的線粒體蛋白合成導(dǎo)致的。在優(yōu)選實(shí)施方案中,待治療癌癥是血液癌癥,例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102821769SQ201180013184
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者A·D·希梅爾, M·斯克提克 申請(qǐng)人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)
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