專利名稱：溶菌酵素二聚體的新用途及其含有溶菌酵素二聚體的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶菌酵素二聚體新的醫(yī)療用途及其含有這樣的二聚體的制劑。所述的新用途涉及對自然防御機制的特定的機能變常的治療。
很久以來人們就知道，單節(jié)形酶對治療各種疾病有療效。
溶菌酵素是Fleming于1922年發(fā)現(xiàn)的，但在1950年以后，人們才剛剛發(fā)現(xiàn)它具有酶的機能。從那時起，這種化合物已成為人們致力研究的一個對象，并且其各種療效也被報道出來。其中有抗病毒、抗菌、消炎和抗組胺的效果。不過，由于發(fā)現(xiàn)單節(jié)形的溶菌酵素具有細(xì)胞毒副作用，其在治療方面的應(yīng)用受到很大的限制。
在80年代后期，當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)游離的二聚體型酶在保留了已知的單節(jié)型酶的所有有益的性能的同時并沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性副作用時，對溶菌酵素和其它具有療效活性酶實際使用的這方面的限制已經(jīng)得到克服。國際專利申請PCT/US88/01785中公開了包括作為活性組分的溶菌酵素二聚體或其它二聚體化的酶的抗病毒和抗菌制劑。根據(jù)該申請的報道，在體外試驗中，溶菌酵素二聚體抑制了從病人體采集的樣品中在5-20mg/ml的培養(yǎng)濃度下培養(yǎng)的多種菌株的增生。此外，按1-2mg/ml體重的劑量每天口服兩次二聚體，可以治療犬牙的細(xì)小病毒的感染。
隨著研究工作的繼續(xù)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)溶菌酵素二聚體還具有其它有吸引力的特性，同時也開發(fā)出該藥物的新的治療用途。
在為證實溶菌酵素二聚體的抗菌和抗病毒作用而進(jìn)行的臨床試驗中，令人鼓舞地發(fā)現(xiàn)該溶菌酵素二聚體對治療消化道和呼吸道的急性疾病有出人意料的效力。相應(yīng)地，選擇新的研究方向以確定溶菌酵素二聚體對天然防御機制失效的不同疾病的各個階段的病人的療效。
眾所周知，細(xì)菌毒素構(gòu)成了一大類多種互性反應(yīng)因子，細(xì)菌就是通過這些毒性反應(yīng)因子而致病。近來在細(xì)菌毒素方面認(rèn)識的進(jìn)展涉及到其與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。這種相互作用首先導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)，然后釋放出細(xì)胞毒素(cytokines)和其它間介，用這種相互作用可以解釋由毒素引起的許多生理紊亂。現(xiàn)已參照外毒素的作用而對后一種作用進(jìn)行了專門的研究，所述的外毒素對格蘭陰性膿毒癥的發(fā)病機制起了重要的作用(見Bayston，D.F.，Cohen，J.Bacterialendotoxinsandcurrentconceptsinthediagnosisandretreatmentofendotoxaemia;J.Med.Microbiol.1990，3173-83)。雖然長期以來外毒素對由葡萄球菌和釀膿鏈球菌所致的感染的作用已為人所知，現(xiàn)在人們已公認(rèn)，正是由于葡萄球菌中毒性休克綜合癥才導(dǎo)致了人們對這些機制所產(chǎn)生的外毒素有了越來越濃厚的興趣。
中毒性休克是一種嚴(yán)重的疾病，癥狀是高熱、高血壓、滲透壓下降(capillaryleak)、擴散性紅皮病、粘膜紅斑、腎缺損、低血鈣、血白蛋白減少以及紅皮疹所致的脫屑。許多中毒性休克綜合癥的病例與在月經(jīng)期使用陰道塞有關(guān)，但越來越多的報道表明，該綜合癥經(jīng)常發(fā)生在經(jīng)手術(shù)而把填充材料放置到位(如鼻成形術(shù)或嚴(yán)重的鼻出血后所進(jìn)行的鼻填充)之后，而與性別或是否處于月經(jīng)期無關(guān)?，F(xiàn)已證明從患中毒性休克綜合癥(TSS)的患者陰道中分離出的葡萄球菌株可產(chǎn)生中毒性休克綜合癥毒素1(TSST-1)，但是產(chǎn)生TSST-1的微生物源也可能是一種不顯性感染。初發(fā)的菌血癥可能是不顯性的，但幾周或幾個月以后可能發(fā)展成局部感染。在出現(xiàn)上述感染的同時，有證據(jù)表明出現(xiàn)了膿毒性綜合癥或膿毒性休克。較為罕見的但卻是更加嚴(yán)重的菌血癥可不發(fā)生在任何門戶或者可與局部感染有關(guān)，在這些情況下，休克、心內(nèi)膜炎、散布性血管凝血病和多組織衰竭會更加突出(見Stevens，D.L.等人Gram-positiveshock;CurrentOpinioninInfectiousDiseases1992，5355-363)。
與之類似的觀察還涉及到其它革蘭陽性菌。例如，釀膿鏈球菌感染與休克有關(guān)，并且死亡率達(dá)到30%。肺炎雙球菌是肺炎的一個病因，據(jù)文獻(xiàn)報道，它對青霉素有高度的抗性，并且易發(fā)展為休克綜合癥。此外，愛滋(AIDS)病人比總體人群發(fā)生肺炎球菌感染的可能性要高得多。
革蘭陰性菌感染還可導(dǎo)致膿毒癥和膿毒性休克。革蘭陰性桿菌和弧菌是大多數(shù)重要的腸毒素的源。腸毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外膜的一種脂多糖類(LPS)。腸毒素主要影響消化道，通常引起腹瀉。在動物和人中發(fā)生的最多的革蘭陰性菌感染是大腸桿菌感染。伴隨這類感染的嚴(yán)重的脫水可使受感染的個體死亡。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報告，每年在發(fā)展中國家因急性腹瀉而死亡的兒童約為320萬。在所有的膿毒癥當(dāng)中，約有30%是由革蘭陰性菌引起的。
由革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染引起的膿毒癥在所有國家中都是一個嚴(yán)重的問題。美國每年發(fā)生約40000例，其中死亡率約為50%。
近年來，膿毒癥和膿毒性休克已成為許多出版物的主題。對膿毒性休克的病理生理學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒血癥和其它細(xì)菌性中毒間介器起了重要的作用。它們包括腫瘤壞死因子TNF、白細(xì)胞介素-1、干擾素血小板活性因子和eicosanoids(arachidomic酸的衍生物)，其中最重要的是TNF，它能作用于代謝以及免疫和噬細(xì)胞系統(tǒng)(見Berkowitz，F(xiàn).E.BacterialToxinsinphatogenesisofinfections;CurrentopinioninInfectiousDiseases，19914332-337)。文獻(xiàn)表明，膿毒性休克的死者體內(nèi)的TNF和白細(xì)胞介素-1的濃度很高。許多論文的作者都報道了在膿毒性休克患者的血漿和血液中的TNF-α含量有所升高，此外，TNF-α的毒性作用依賴于TNF濃度的程度不如依賴于其在體內(nèi)的持久性的程度大。
許多作者都研究了用膿毒癥和膿毒性休克中的細(xì)胞毒素級聯(lián)放大進(jìn)行高節(jié)的可能性。所報道的可行性作法涉及使用單克隆抗TNF抗體和用抗脂多糖類對脂多糖類進(jìn)行中和。不過，抗體并沒有提高細(xì)菌的清除率。當(dāng)使用試劑(如通過巨噬細(xì)胞而阻滯TNF產(chǎn)生的地塞米松和pentoxifylline)時，觀察到了局部的正向作用。
此外還已知，其它細(xì)胞毒素也是對膿毒性休克有貢獻(xiàn)的因素。在這種情形中，調(diào)節(jié)膿毒性休克中細(xì)胞毒素級聯(lián)的治療方法有希望用遏制感染的方式進(jìn)行干擾，這是因為宿主的防御依賴于這些同樣炎性的細(xì)胞毒素。由于對大量的患者有潛在的益處，找出預(yù)防膿毒性休克的手段是當(dāng)務(wù)之最急。而控制TNF的水平似乎又是為達(dá)到這些目的所必需。
同樣關(guān)鍵的是TNF在另一個防御機制“發(fā)熱”中的作用，發(fā)熱是通常所有高級動物和人類對感染的生理反應(yīng)。目前已確定有5個致熱細(xì)胞毒素(白細(xì)胞介素-1、TNF、干擾素、白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-6)是發(fā)熱反應(yīng)主要的內(nèi)生間介器，它們可抑制通常促進(jìn)熱量流失和抑制在人體中產(chǎn)生熱量的對熱敏感的視前葉神經(jīng)。發(fā)熱及其間介物能同時損害入侵的生物和宿主。近年來所積累的大量數(shù)據(jù)使人想到白細(xì)胞介素-1、TNF和白細(xì)胞介素-6間介了感染的病理生理學(xué)異常過程。由于內(nèi)生熱原對各類感染的病理過程有作用，間介物和發(fā)熱反應(yīng)二者都對宿主有潛在的損害。在這方面最為有力的證據(jù)來自對革蘭陰性膿毒癥的研究。還有證據(jù)表明，內(nèi)生熱原間介了革蘭陽性菌所致的膿毒癥、AIDS、螺旋體感染腦膜炎、成人呼吸痛苦綜合癥、suppurative化膿和分支桿菌病等病癥的系統(tǒng)的和局部的表現(xiàn)。雖然所引用的數(shù)據(jù)與所觀察到的發(fā)熱反應(yīng)本身提高了實驗動物感染的抵抗力，不過，種的保存、更多個體的存活才是進(jìn)化過程的實質(zhì)。令人信服的是，可以利用熱原細(xì)胞毒素對壓倒性的感染(如革蘭陰性膿毒癥)有害的系統(tǒng)性的作用作為暴發(fā)性較弱的感染中有益的局部發(fā)熱效應(yīng)。采用這種方式，種的總體可以免受流行病的傷害(見Mackowiak，P.A.MechanismofFever;CurrentOpinionsinInfectiousDiseases，1992，5348-354)。
有關(guān)發(fā)熱的病原體的一個基本概念是外原性熱原(不論其來源或結(jié)構(gòu))通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生內(nèi)生熱原而發(fā)熱。相應(yīng)于此，基于采用抗內(nèi)生熱原抗體和內(nèi)生熱原受體對抗劑的治療方法可能有效。一種可能性是阻滯TNF的生物合成。動物研究表明，TNF可以在對感染的反應(yīng)級聯(lián)中的IL-1和其它細(xì)胞毒素之前而產(chǎn)生。按照許多科學(xué)家的觀點，抑制TNF的生物合成還意味著阻滯某些暴發(fā)性和無希望的感染的有害的作用。
TNF更加有名的作用在于對AIDS本身。AIDS的特征在于意義深奧的免疫缺損。AIDS的發(fā)病特征是CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)量持續(xù)減少。即使在AIDS患者的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)中，受HIV(AIDS的病因試劑)感染的細(xì)胞數(shù)也較小(100-1000中≤1)。在CD4+淋巴細(xì)胞被優(yōu)先感染的同時，這些細(xì)胞并不是HIV感染的排除性靶。最近的證據(jù)表明，HIV靶細(xì)胞的范圍很寬?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)HIV感染的情況有很大不同。T淋巴細(xì)胞易被摧毀，而單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞則允許持續(xù)地受感染。于是HIV可以象體內(nèi)的其它細(xì)胞一樣作為貯主而靠在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞附近這類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對HIV感染的反應(yīng)可以解釋所發(fā)現(xiàn)的其在宿主中的潛伏性;這種反應(yīng)還可通過受感染的細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性因子所致的病原體后遺癥(見ToshifumiMatsuyama等人CytokinesandHivinfectionIsAIDSaTumorNecrosisFactordisease？;AIDS1991，51405-1417)。據(jù)許多科學(xué)家報道，受HTLV-1感染的人類T細(xì)胞線極容易受HIV感染，表現(xiàn)出與HIV復(fù)制水平提高有關(guān)的驚人的細(xì)胞病理作用。此外，受HIV感染的細(xì)胞易于被這些細(xì)胞的上層清液所損傷。在用此上層清液處理后所進(jìn)行的病毒滴定測試表明，T細(xì)胞(MT-2)產(chǎn)生的因子促進(jìn)了HIV的復(fù)制。經(jīng)鑒定，該因子為TNF-β，并且這個發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞(MT-2)產(chǎn)生TNF-β的報道相一致。當(dāng)使用TNF-α?xí)r，觀察到了同樣的效應(yīng)。TNF-α和TNF-β選擇性地殺死受HIV感染的細(xì)胞，并且提高了HIV的復(fù)制水平。此外據(jù)報道，受HIV感染的T細(xì)胞線和剛從HIV感染的個體中分離出的新鮮的PBMC對TNF有反應(yīng)，含量有所提高。這使人想到HIV在活體中的表達(dá)也可能同樣地提高。實際上TNF活性的提高可以被抗TNF抗體中和。用TNF-α和TNF-β處理后HIV復(fù)制的提高高達(dá)10±1倍(見Yakarnam，A.等人Tumornecrosisfactors(α，β)inducedbyHIV-1inperipheralbloodmonocellularcellspotentatevirusreplication;AIDS1990，421-427)。
另外，現(xiàn)已證實，有很多種細(xì)胞毒素可以影響HIV的產(chǎn)生。通過采用從正常的外周血液中提純的單核噬細(xì)胞，當(dāng)暴露在HIV病毒兒小時內(nèi)都觀察到了IL-6和TNF-α誘導(dǎo)。基于許多觀察和ToshifumiMatsuyama等人(op.cit.)的觀點，可以肯定，AIDS代表了一種細(xì)胞毒素或TNF疾病。在AIDS的細(xì)胞毒素網(wǎng)絡(luò)中，TNF-α和TNF-β似乎是提高HIV的復(fù)制和誘導(dǎo)它們本身及其它細(xì)胞毒素表達(dá)的一個關(guān)鍵分子。TNF-α已被證明可刺激各種類型的細(xì)胞中釋放出其它細(xì)胞毒素，因此它是第一防御機制中細(xì)胞毒素級聯(lián)中的一個關(guān)鍵數(shù)。
現(xiàn)有人提出，與AIDS有關(guān)的許多癥狀可以用具有不同的生物功能的細(xì)胞毒素的釋放來解釋。用IL-1和TNF-α這兩個有名的熱原的誘導(dǎo)產(chǎn)生可以解釋AIDS病人中所見的高熱。TNF-α和-β的作用都是單細(xì)胞間介的細(xì)胞毒性中的免疫調(diào)節(jié)器和效應(yīng)器分子。此外，TNF激活了免疫反應(yīng)，并可直接殺滅被HIV感染的細(xì)胞，并因此提高了HIV的復(fù)制。還有人提出了免疫機制來解釋CD4-T細(xì)胞在AIDS病人中的排除(Matsuyama等人，op.cit.)。還有人報道，與AIDS有關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤也是由TNF-α誘導(dǎo)出的TNF-α可以通過生理學(xué)刺激(如紫外光)而從角質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生，它有助于在皮膚中誘導(dǎo)出IL-6，并促進(jìn)AIDS中卡波濟(jì)氏肉瘤的生長。在體外試驗中，TNF-α可以損害髓磷脂和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且一些神經(jīng)膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的細(xì)胞線被證明易受TNF-α的抗增生作用，因此可以得出結(jié)論，AIDS病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機能變常是TNF-α介入的結(jié)果。有幾份報告表明，TNF-α和IL-1的血清水平隨AIDS和ARC(與AIDS有關(guān)的綜合癥)病情的發(fā)展而顯著提高，而在HIV的無癥狀載體的血清試驗中，它們回落到健康的對照值范圍內(nèi)。根據(jù)Matsuyama等人(op.cit.)的觀點，AIDS作為TNF疾病程度與HIV疾病的程度相同?，F(xiàn)已證明，提高對TNF誘導(dǎo)的控制水平有助于有效地治療AIDS病人。
下列基本的發(fā)現(xiàn)使我們可以解決上述問題，并為溶菌酵素二聚體在上述病理狀況中找到新的治療用途提供新的思路1.溶菌酵素二聚體抑制TNF的合成，2.溶菌酵素二聚體刺激TNF-α的合成，3.溶菌酵素二聚體提高了噬細(xì)胞的活性。
于是，本發(fā)明的一個目的是提供多種用于治療與上述的TNF(腫瘤壞死因子)水平過高有關(guān)的疾病的新的藥物配方。
本發(fā)明的另一個目的是提供多種用于與上述TNF水平過量有關(guān)的profilaxis疾病的新的藥物配方。
本發(fā)明的又一個目的是提供用于治療和預(yù)防與TNF水平升高和過高有關(guān)的疾病的配方和衛(wèi)生用品。
根據(jù)本發(fā)明，上述目的可以通過下列二聚體型溶菌酵素新用途和含有溶菌酵素二聚體活性成份的新的藥物制劑來實現(xiàn)用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于抑制動物體和人體中腫瘤壞死因子的生物合成的藥物。
用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于治療與腫瘤壞死因子水平過高有關(guān)的疾病的制劑。
用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于預(yù)防與腫瘤壞死因子水平過高有關(guān)的疾病的制劑。
用二聚體型溶菌酵素來制造用于控制無癥狀載體和與AIDS有關(guān)的綜合癥患者中腫瘤壞死因子受HIV誘導(dǎo)而釋放的藥物。
用二聚體型溶菌酵素來制造用于治療AIDS的藥物組合物。
用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療膿毒癥和膿毒性休克的藥物制劑。
用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療惡病質(zhì)的藥物制劑。
用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療發(fā)熱的藥物制劑。
注射二聚體型溶菌酵素含量在0.01-10mg/ml(最好在0.1-1.0mg/ml)的一種不致熱的無菌制劑，所述的制劑含有生理相容的溶劑和已被批準(zhǔn)使用于藥物的保存劑。
注射上述藥物，方式是靜泳注射一次或多次，劑量為0.02mg/kg體重。
使用浸漬了有效劑量的二聚體型溶菌酵素的塞和繃帶來預(yù)防膿毒癥和膿毒性休克。
在月經(jīng)期使用浸漬了有效劑量的二聚體型溶菌酵素的陰道塞。
對二聚體型溶菌酵素，最好使用分離純化的溶菌酵素二聚體。對某些用途而言，也可能采用的是除溶菌酵素二聚體以外還含有少量的溶菌酵素的三聚體或更高的低聚體的酶。
根據(jù)本發(fā)明，也可以進(jìn)行肌肉內(nèi)和皮下注射。在某些用途中，適宜的投藥方式也可能是同時(或自主性地)在子宮內(nèi)和乳房內(nèi)給予同樣的液體制劑或局部給予其它局部制劑。
包括生理接受的溶劑和批準(zhǔn)使用于藥物的保存劑的優(yōu)選的不致熱無菌制劑由作為一種溶劑的不致熱無菌水或PBS水溶液和作為批準(zhǔn)用于蛋白質(zhì)藥物制劑的保存劑的硫柳汞組成。
二聚體型溶菌酵素是經(jīng)下面的工藝獲得的受控聚合酶單體，然后從反應(yīng)后混合物中仔細(xì)提純，特別要分離開具有所報道的毒副作用的溶菌酵素的單體以及三聚體或更高的低聚體部分?？梢圆捎萌魏我阎?、可用于獲得二聚體型酶的方法。國際專利申請PCT/US90/PP00140中公開了包括提純步驟在內(nèi)的復(fù)合生產(chǎn)工藝。
以前的溶菌酵素二聚體的臨床前試驗表明，沒有出現(xiàn)誘變電位，沒有畸形形成效應(yīng)，沒有耐受性效應(yīng)或該效應(yīng)很弱小，口服或皮下投藥時的一次劑量毒性LD50無法測量(＞2000mg/kg)，靜脈內(nèi)注射時LD50＞1000mg/kg。
這里所公開的溶菌酵素二聚體的新用途經(jīng)活體外試驗證明有堅實的基礎(chǔ)，用于活體內(nèi)臨床場合也有效果。另外還進(jìn)行了一些比較研究。
據(jù)信溶菌酵素二聚體對TNF釋放的抑制作用如此之強是因為它的活性范圍(即其誘導(dǎo)IFN釋放)很寬并且它增強了對吞噬作用的作用的緣幫。上面剛剛提到的兩個性質(zhì)是天然防御機制中的重要因素。相應(yīng)于此，溶菌酵素二聚體的上述新用途的治療和預(yù)防作用因其同時增強了自然防御機制而又反過來得到自然防御機制的支持。
在下面的例子中對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，其中在附圖中用參考例圖示了特別關(guān)心的內(nèi)容之外的一些試驗結(jié)果。

圖1示出了在不同的稀釋物中存在溶菌酵素二聚體的情況下用ConA最適度下地刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物TNF的釋放在活體外受到抑制的情況。圖2示出了實驗測定的TNF在顱蓋血液中的IFN水平，并且圖3示出了在一個根據(jù)本發(fā)明的藥物的療效的比較試驗中，實驗測出的顱蓋血液中的IFN水平。
例1為確定溶菌酵素二聚體的免疫活性，采用了用FACS分析人類外周血液淋巴細(xì)胞的測定法。
在人類外周淋巴細(xì)胞中進(jìn)行致有絲分裂的刺激是一種試驗免疫系統(tǒng)中大多數(shù)重要細(xì)胞的反應(yīng)性的較完善的方法。為試驗治療物質(zhì)對從健康血液捐獻(xiàn)者采集的淋巴細(xì)胞的活性和增生的影響，以最適度下的劑量加入致有絲分裂物，最后定量測量淋巴細(xì)胞反應(yīng)的免疫相關(guān)參數(shù)。將結(jié)果與不加入藥物的對照值進(jìn)行比較。
為刺激淋巴細(xì)胞，使用了濃度為每毫升介質(zhì)20μg/ml的ConA。初始細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/ml。在1天(淋巴細(xì)胞和HLA-Dr上的IL-2受體試驗)或2天(所有其它的試驗)中在一個CO2保溫器中進(jìn)行短期培養(yǎng)。作為細(xì)胞活性的判據(jù)，測量下列參數(shù)-Neopterin(免疫活性的標(biāo)志)
-β-2小球蛋白(同樣是一種活性標(biāo)志)-白細(xì)胞介素-2(從autocrine和paracrine物質(zhì)中衍生的T輔助淋巴細(xì)胞)-白細(xì)胞介素-6(細(xì)胞分化激素)-腫瘤壞死因子-TNF(作用于血管的多效力白細(xì)胞介素)-干擾素-α(特別作用于B淋巴細(xì)胞的分化因子)-TymidineKinase(酶，在增生細(xì)胞中被向上調(diào)節(jié))-淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-2感受器(用于autocrine和paracrine受體分子)-淋巴細(xì)胞Ki-67(在被激活的細(xì)胞和增生細(xì)胞中表達(dá)的抗原)-淋巴細(xì)胞HLA-Dr(在免疫反應(yīng)中被向上調(diào)節(jié)的第二類組織適合性抗原)。
在培養(yǎng)上層清液的過程中，觀察到了下列有關(guān)細(xì)胞產(chǎn)物的現(xiàn)象在免疫反應(yīng)過程中和刺激培養(yǎng)中被淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的neopterin在本實驗中沒有被溶菌酵素二聚體顯著提高到從不加試驗的二聚體的ConA刺激細(xì)胞中所得到的對照值的水平之上。隨著所試驗的二聚體濃度的加大，neopterin值也略微增高。與此相似，在溶菌酵素二聚體所有的濃度情形中，β-2小球蛋白值在對照值上下波動。在培養(yǎng)過程中從淋巴細(xì)胞表面散布出并給出了整個IL-2受體更新情況的IL-2受體與淋巴細(xì)胞表面上的IL-2受體(下面列出)處于一個相當(dāng)?shù)乃剑砻髟谒囼灥亩垠w濃度上的最高處出現(xiàn)了明顯的抑制現(xiàn)象。白細(xì)胞介素-6清楚地表明，在較高的濃度下，依賴于劑量的值也較高。此分子在hematopoiesis細(xì)胞分化和免疫反應(yīng)中起著重要的作用。在試驗中，前三個值不得不外推，這是因為最高的標(biāo)準(zhǔn)僅為2000pg/ml。與剩下的分子有關(guān)的結(jié)果示于下面的表1中。與白細(xì)胞介素-6不同，TNF-α在培養(yǎng)的上層清液中的濃度出人意料地急劇降低，只有最后的兩個稀釋步驟除外，在這兩個步驟中，它對TNF濃度沒有抑制作用。在對細(xì)胞小丸進(jìn)行冷凍和解冷后，測量淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中的thymidinekinaze。在分裂細(xì)胞中，thymidinekinase的數(shù)據(jù)上升，使之成為細(xì)胞增生的一個良好的標(biāo)志。從表1的數(shù)據(jù)中可見，在所試驗的溶菌酵索二聚體的最高濃度處數(shù)據(jù)出現(xiàn)下凹，而在其它稀釋步驟中沒有看見這種趨勢。反過來，干擾素-α在同樣的條件下的數(shù)值高于ConA單獨處于較高濃度時的對照值。從第二值到第三次稀釋之間可以看到數(shù)值在增加。關(guān)于淋巴細(xì)胞標(biāo)專，所觀察到的情況如下在免疫反應(yīng)其間，作為組織適合性標(biāo)志的HLA-Dr/CD3表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞表面。獲得的結(jié)果表明，在對照培養(yǎng)物中有一定百分比分比的活化的T細(xì)胞，并且在帶有不同濃度的溶菌酵素二聚體的培養(yǎng)液中，數(shù)值在此對照值上下波動。IL-2接受在淋巴細(xì)胞表面。眾所周知，白細(xì)胞介素-2是通過IL-1活化后由T輔助淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞激素。T輔助淋巴細(xì)胞不但產(chǎn)生IL-2，而且還受此分子刺激而增生。T輔助淋巴細(xì)胞表面的IL-2受體在激活時會向上調(diào)節(jié)。從表1中可見，在溶菌酵素二聚體的濃度最高處淋巴細(xì)胞上的IL-2受體受到顯著的遏制，而其余的值在生物帶寬范圍內(nèi)并沒有顯著的差別。表1中還含有一個與Ki-67/CD8、Ki-67/CD4有關(guān)的數(shù)據(jù)。Ki-67是一種出現(xiàn)在正在進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞中的增生細(xì)胞。Ki-667是評價受刺激的細(xì)胞和進(jìn)行腫瘤診斷的一個重要參數(shù)。在所報告的結(jié)果中，細(xì)胞增生在帶有最高的兩個劑量的溶菌酵素二聚體的Ki-67+抑制因子(CD8)細(xì)胞中受到輕微的抑制。在帶有最大劑量的輔助(CD4)淋巴細(xì)胞中，陽性細(xì)胞的百分比顯著增加。劑量較低時，表達(dá)Ki-67/CD4的細(xì)胞的百分比略高于對照值。
表1溶菌酵素二聚體對人類外周血液淋巴細(xì)胞的影響樣品號HLA-Dr/CD3IL-2受體Ki-67/CD8Ki-67/CD4對照3.38.96.02.71.1mg/ml2.22.64.85.32.0.3mg/ml1.96.34.13.03.0.1mg/ml3.06.16.5(6.9)4.33μg/ml3.05.96.33.05.10μg/ml3.46.07.73.76.3.3μg/ml2.45.07.53.77.1μg/ml2.54.97.04.18.0.3μg/ml3.35.87.53.99.0.1μg/ml2.84.07.93.810.33ng/ml3.14.68.04.1表1(繼續(xù))溶菌酵素二聚體對人類外周血液淋巴細(xì)胞的影響樣品號TNFThym.-KinaseIFN-α對照205.1192424.971.1mg/ml38.079238.812.0.3mg/ml17.19109149.443.0.1mg/ml13.75725417.964.33μg/ml36.1195253.675.10μg/ml22.2254927.546.3.3μg/ml54.9151986.267.1μg/ml18.47584033.918.0.3μg/ml14.47683910.079.0.1μg/ml94.1636724.9710.33ng/ml172.46731210.07為示意起見，圖1中示出了TNF受到的顯著抑制。
用以測量被測物對最適度下的ConA刺激的人類外周淋巴細(xì)胞的影響為基礎(chǔ)的方法分析上面所列出并且根據(jù)其在免疫反應(yīng)中的電位重要性所選擇的免疫參數(shù)，該方法如此完備和靈敏，以致可以用來評價許多不同的參數(shù)。在某些溶菌酵素二聚體濃度處，試驗結(jié)果與只用ConA刺激的淋巴細(xì)胞值相比有很大的區(qū)別，對于如TNF和IFN-α而言，所觀察到的作用的趨勢明顯地處于所有試驗的稀釋物的范圍之中。
例2進(jìn)行實驗室試驗以確定溶菌酵素二聚體對體外的乳和血液細(xì)胞的噬細(xì)胞活性影響。
以前就已確定，在標(biāo)準(zhǔn)的試驗中，體外的溶菌酵素二聚體不會抑制從感染的母牛乳腺中分離出的微生物的增生。由于臨床上使用乳腺內(nèi)并且同時靜脈內(nèi)給予溶菌酵素二聚體的方法有效地消除了母牛乳腺的感染，顯然在母牛乳腺中的主要的抗菌機制是吞噬作用。為進(jìn)行比較，采用同樣濃度的試驗物質(zhì)以及同樣的培養(yǎng)時間，并采用從健康的以及受感染的母牛(或者甚至采用從乳腺受感染的部分以及同一母牛的一個健康部分)中分離出來的細(xì)胞進(jìn)行實驗，以消除個體反應(yīng)差異。
在所進(jìn)行的試驗中，將試驗的物質(zhì)(提純?yōu)槎垠w型的溶菌酵素并且還有二聚體和少量的三聚體和更高的低聚物型溶菌酵素)以25-0.25μg/ml的濃度加入到健康的和受感染的母牛的血液或乳中，并且將混合物在37DU下培養(yǎng)0.5-24小時。確定每個樣品的噬細(xì)胞的百分比、吞噬作用指數(shù)(按照Wisniewski等人的方法)以及NBT陽性粒細(xì)胞的百分比(按照Park的方法)。
在體外試驗中，溶菌酵素二聚體提高了淋巴細(xì)胞的噬細(xì)胞活性。此作用的強弱依賴于劑量和孵化時間。需要更高濃度的溶菌酵素二聚體來活化乳淋巴細(xì)胞，然后才是血液淋巴細(xì)胞。過高濃度的二聚體會略微降低噬細(xì)胞的體外活性。為示意起見，在下面的表2和表3中有選擇地給出了一些結(jié)果(主要是為了表明只要后聚合反應(yīng)混合物不含有細(xì)胞互性的單體型的二聚體，從高度提純的及純度不高的二聚體型溶菌酵素得出的結(jié)果可與之相比)。
表2溶菌酵素二聚體對健康母牛的乳淋巴細(xì)胞的噬細(xì)胞活性的影響(二聚體濃度為20μg/ml，孵化時間為3小時)指示劑制劑健康母牛乳淋巴細(xì)胞第477號母牛第463號母牛對照77.880.0%吞噬作用溶菌酵素二聚體100100溶菌酵素二聚體92.6100對照2.74.1%吞噬作用指數(shù)溶菌酵素二聚體4.46.4溶菌酵素二聚體4.88.4對照3.42.5%NBT減少溶菌酵素二聚體5.73.8溶菌酵素二聚體3.46.8
表3溶菌酵素二聚體對健康母牛的乳淋巴細(xì)胞的噬細(xì)胞活性的影響(二聚體濃度為20μg/ml，孵化時間為3小時)指示劑制劑感染母牛(第490號)的乳淋巴細(xì)胞感染部分*/健康部分對照9858%吞噬作用溶菌酵素二聚體9890溶菌酵素二聚體100100對照10.92.7%吞噬作用指數(shù)溶菌酵素二聚體8.714.9溶菌酵素二聚體10.98.9對照4.24.2%NBT減少溶菌酵素二聚體5.98.4溶菌酵素二聚體5.57.0＊/＝剛出現(xiàn)發(fā)炎;母牛不經(jīng)治療在上述的表2和表3中，用“溶菌酵素二聚體+”來表示含有如在說明書的前面所提到的少量的溶菌酵素的三聚體及更高的低聚體。
很顯然，溶菌酵素二聚體的提純程度對所觀察到的乳淋巴細(xì)胞的噬細(xì)胞活性沒有顯然的影響。此外還可看出，效應(yīng)器細(xì)胞可以是粒細(xì)胞。
在后面的進(jìn)一步的例子中報告了體內(nèi)研究的結(jié)果。為進(jìn)行臨床試驗，使用了10ml的PBS溶液中含有2mg溶菌酵素二聚體的制劑。這種制劑稱為KLP-602。
例3當(dāng)靜脈注射時，KLP-602表現(xiàn)出刺激健康和有病的小牛以及健康的駒和剛進(jìn)行乳房內(nèi)投藥的母牛中血液粒細(xì)胞的噬細(xì)胞活性。這個作用是通過中性白細(xì)胞數(shù)增加和吸收葡萄球菌的能力增強以及降低了NBT而表現(xiàn)出來的。這種現(xiàn)象主要發(fā)生在注射制劑后的前12-24小時中。KLP-602對乳房中噬細(xì)胞活性的作用依賴于藥物的劑量和劑型以及動物個體的反應(yīng)。
用溶菌酵素二聚體來治療母牛、豬、馬和狗的感染性疾病。在不同的劑量的投藥中，在不同的時間間隔處，進(jìn)行靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、乳房內(nèi)和子宮內(nèi)投藥。對346只母牛、274只小牛、110只母豬和食用豬、294只小豬、709只乳豬、35個駒及107只狗進(jìn)行投藥。作用對照，進(jìn)行了另外的處理。由于試驗動物所處狀態(tài)的原因，未進(jìn)行針對死亡原因的治療處理，這些動物的任何一個都不留下。不過，與獸醫(yī)文獻(xiàn)中所知的治療疾病的臨床圖象進(jìn)行比較可以得出結(jié)論。
例4在所進(jìn)行的對小牛的試驗中，測定一組健康的動物和受感染、然后進(jìn)行治療(先進(jìn)行12小時的感染，再進(jìn)行抗菌治療，并且用高度
化的劑型溶菌酵素二聚體治愈)的動物的INF和TNF在血液中的水平。在圖2和3中圖示了所獲得的結(jié)果，結(jié)果分別表明了TNF和IFN的水平。這兩個圖代表從4只經(jīng)個體鑒別的母牛的血樣中獲得的真實結(jié)果。在這兩個圖上，線1表示從健康的母牛血液中獲得的結(jié)果，線2表示從感染過但未經(jīng)治療的母牛處獲得的結(jié)果(在12小時時IFN水平為45U/ml在圖上未示出，但一條線指示了線2方向的值);對動物進(jìn)行方式已知的治療，在12小時處，線3表示用抗菌素治療的母牛的結(jié)果并且線4表示從用KLP-602治療的母牛獲得的結(jié)果。
在用溶菌酵素二聚體治療的組中，一次或兩次KLP-602注射治愈了90%以上的患胃腸炎的母牛和85%以上的患支氣管肺炎的母牛。發(fā)熱和腹瀉之類的癥狀突然消失顯得非常突出。用這種藥物進(jìn)行治療不需要對動物補充流體。與用抗菌素治療的對照組相比，恢復(fù)時間和恢復(fù)率的結(jié)果更好。
例5KLP-602對豬的疾病的療效最好。100%或接近100%的動物從下列疾病中恢復(fù)過來產(chǎn)后無乳(MMA綜合癥)、痢疾、膿性子宮炎、流感和大腸桿菌病。此藥物用于水腫病和支氣管肺炎的結(jié)果比上面的結(jié)果略差，但仍顯著好于用其它方法治療所獲得的結(jié)果。需要強調(diào)的是，腹瀉(通常在前24小時內(nèi))和發(fā)熱迅速退縮并且重新出現(xiàn)乳汁分泌，這對患產(chǎn)后乳房和子宮發(fā)炎的病例特別重要(解救了豬的生命)。下面的表4中示出了與其它治療制劑相比KLP-602的療效
表4溶菌酵素二聚體與其它制劑治療的療效對比用KLP-602治療的動物用其它制劑治療的動物病例數(shù)持續(xù)時間恢復(fù)數(shù)%未恢復(fù)數(shù)%病例數(shù)所用的制劑(天)(天)I.豬的大腸桿菌病434 1-2 421 97 13 3 400x抗菌素 3-5 75-80x葡萄糖維生素BII.痢疾291-229100--219抗菌素5-957STOLMEDRIDOWETIII.產(chǎn)后無乳30 12 30 100 40x抗菌素 3-5 80X可的松硫酰胺VI.豬流感38 1-5 38 100 - - 200X抗菌素 3-9 60-80x(潛伏制劑)V.膿性子宮炎82 1-3 78 95 4 5 120x抗菌素 3-6 60x青霉素四環(huán)素維生素B流體+葡萄糖例6當(dāng)用KLP-602治療時，100%患腸炎的駒和83.3%患支氣管肺炎的駒恢復(fù)得比用已知的制劑治療的對照組快。
例7測試KLP-602對治療某些狗的疾病的治療效果，如毛囊炎(100%有效)、上呼吸道和下呼吸道感染和通過腹瀉表現(xiàn)出的胃腸道感染。在此組中流行的是微小病毒癥(parvovirosis)，這是一種目前很難治的疾病。不過，在微小病毒癥病例中，約75%得到恢復(fù)。
在對自然發(fā)病的動物所進(jìn)行的試驗中，如上所述，得到一些重要的發(fā)現(xiàn)1.證明此療法非常容易施行，并且對多因子病因和發(fā)病機理的疾病有療效(這些疾病在動物種群中非常流行，并且在飼養(yǎng)農(nóng)場中很難治療，因為這些流行疾病在那里擴散得非?？?。這些發(fā)現(xiàn)證明溶菌酵素二聚體對自然防御機制有調(diào)節(jié)作用。
2.證明此療法對處于自然病程的疾病有效。內(nèi)毒素休克或其它失調(diào)癥(如高熱和長期持續(xù)的高熱)的出現(xiàn)會在恢復(fù)后的長時間內(nèi)影響動物的狀態(tài)，并且因此對極度損害這些動物，例如作為種畜或競賽而飼養(yǎng)的馬(駒)，以及主要供應(yīng)食品工業(yè)所飼養(yǎng)的動物，在這種情況下生產(chǎn)成本是關(guān)鍵因素?？焖倩謴?fù)將顯著降低治療這些疾病的成本。
體內(nèi)試驗所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果證明，用溶菌酵素二聚體治療各種自然發(fā)生的感染可以降低TNF的水平，因此支持了本發(fā)明的權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1.用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于抑制動物體和人體中腫瘤壞死因子的生物合成的藥物。
2.用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于治療與腫瘤壞死因子水平過高有關(guān)的疾病的制劑。
3.用二聚體型溶菌酵素來制造一種用于預(yù)防與腫瘤壞死因子水平過高有關(guān)的疾病的制劑。
4.用二聚體型溶菌酵素來制造用于控制無癥狀載體和與AIDS有關(guān)的綜合癥患者中腫瘤壞死因子受HIV誘導(dǎo)而釋放的藥物。
5.用二聚體型溶菌酵素來制造用于治療AIDS的藥物組合物。
6.用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療膿毒癥和膿毒性休克的藥物制劑。
7.用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療惡病質(zhì)的藥物制劑。
8.用二聚體型溶菌酵素來制造用于預(yù)防和治療發(fā)熱的藥物制劑。
9.注射二聚體型溶菌酵素含量在0.01-10mg/ml(最好在0.1-1.0mg/ml)的一種不致熱的無菌制劑，所述的制劑含有生理相容的溶劑和已被批準(zhǔn)使用于藥物的保存劑。
10.注射上述藥物，方式是靜泳注射一次或多次，劑量為0.02mg/kg體重。
11.使用浸漬了有效劑量的二聚體型溶菌酵素的塞和抗膿毒衣和的來預(yù)防膿毒癥和膿毒性休克。
12.在月經(jīng)期使用浸漬了有效劑量的二聚體型溶菌酵素的陰道塞。
全文摘要
本發(fā)明公開了二聚體型溶菌酵素用于生產(chǎn)一種藥物的一種新用途，該藥物用于抑制在動物和人體中腫瘤壞死因子的生物合成，特別是用于與腫瘤壞死因子水平過高有關(guān)的治療和預(yù)防。根據(jù)本發(fā)明所述藥物的藥物制劑可以是包括含量為該不致熱的無菌制劑重量的0.01—10％的二聚體型的溶菌酵素二聚體的注射液(所述的無菌制劑還包括生理上可接受的溶劑和被批準(zhǔn)使用于藥物的保存劑)，也可以是浸漬了有效劑量的二聚體型溶菌酵素以用于預(yù)防膿毒癥和膿毒性休克的塞和繃帶。
文檔編號A61K38/47GK1087278SQ9311677
公開日1994年6月1日 申請日期1993年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月13日
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