專利名稱：弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種弓形蟲總抗體檢測(cè)試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫層析技術(shù)(immimochromatography)進(jìn)行的弓形蟲總抗體快速檢測(cè)試劑條。
背景技術(shù)：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)，人群及動(dòng)物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機(jī)理，毒力及基因型研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2009,4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國(guó)分布很廣泛，全國(guó)各省、市、自治區(qū)均有弓形蟲感染的報(bào)道，我國(guó)正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國(guó)人群弓形蟲病的流行特征分析[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2010，17(3) :131-134.),特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數(shù)免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無(wú)癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預(yù)后極為嚴(yán)重。是造成艾滋病患者死亡的一個(gè)重要并發(fā)病。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者約有20% 80% 合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產(chǎn)的重要病原體之一。弓形蟲病的的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進(jìn)行病原學(xué)診斷，需要幾天甚至幾周時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在實(shí)際應(yīng)用中價(jià)值不大。臨床上常規(guī)檢測(cè)主要是應(yīng)用各種血清學(xué)方法，檢測(cè)其特異IgG和IgM ([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲IgG和 IgM抗體雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2010,33(010) :957-959.),血清學(xué)方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數(shù)免疫缺陷的人或動(dòng)物其抗弓形蟲的IgG滴度不會(huì)上升或不會(huì)出現(xiàn)高的IgM滴度，所以不能有效地用血清學(xué)方法對(duì)患有免疫缺陷的人或動(dòng)物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后血清抗體滴度才會(huì)逐步下降，所以也不能應(yīng)用于治療效果評(píng)價(jià)。目前檢測(cè)IgG抗體存在較高的假陽(yáng)性，而IgM抗體檢測(cè)普遍靈敏度差等問(wèn)題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實(shí)驗(yàn)室診斷的技術(shù)進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，M (5) :393-395.)。因此，對(duì)疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價(jià)廉、快速、操作簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備， 更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，蟲體大量繁殖，侵入除紅細(xì)胞外的各組織細(xì)胞內(nèi)寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現(xiàn)臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個(gè)月后逐漸消失，在感染1個(gè)月后出現(xiàn)高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitros eciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin gand immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168.)。因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。早期的血清學(xué)方法使用弓形蟲循環(huán)抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環(huán)抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費(fèi)大、獲得的抗原量少且不純(?；煊兴拗鞯鞍?， 因此假陽(yáng)性也時(shí)有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于弓形蟲實(shí)驗(yàn)已經(jīng)越來(lái)越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].中國(guó)寄生蟲病防治雜志，2001，14(3) :237-238.)。采用重組DNA技術(shù)制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點(diǎn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地制備無(wú)限量特異重組弓形蟲抗原。弓形蟲抗體檢測(cè)方法包括ELISA、Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對(duì)嚴(yán)峻的防制形式，不但需要特異準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，還需要一種更簡(jiǎn)便快捷的試劑來(lái)篩查，以便為臨床和疾病防控提供對(duì)策。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條。本實(shí)用新型設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)、弓形蟲總抗體檢測(cè)線、對(duì)照線和吸收墊；所述加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上。在弓形蟲總抗體檢測(cè)線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。所述載體板可采用PVC板。以下給出本實(shí)用新型的制備方法1)制備弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜總檢測(cè)線上包被抗人Ig單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，晾干；所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1 ％ig/mL，羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和 GRA7的IgG抗體由抗SAGl (P30)抗體、抗SAG2 (P22)抗體、抗R0P2抗體和GRA7抗體按體積比1 1 1 1混合，其終濃度為l ^ig/mL;二者點(diǎn)樣量為lyL/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫凰鰴幟仕崛c的百分比濃度為2%。4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標(biāo)記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標(biāo)記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標(biāo)記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原、膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、膠體金標(biāo)記的 R0P2抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；所述將膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原、膠體金標(biāo)記的SAG2(P2》、膠體金標(biāo)記的R0P2 抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原混合，最適膠體金標(biāo)記的膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原、膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、膠體金標(biāo)記的R0P2抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原混合體積比為 1 (0.2 5) (0.2 5) (0.2 5)混合；所述烘干的溫度可為37°C。5)制備免疫層析檢測(cè)條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測(cè)線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條。本實(shí)用新型提供了一種采用膠體金免疫層析技術(shù)建立弓形蟲總抗體快速檢測(cè)試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中弓形蟲總抗體的檢測(cè)。該檢測(cè)方法所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高， 準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。

圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果模式示意圖。在圖2中，A為使用前的示意圖，B為無(wú)效試驗(yàn)(產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題)，C為陰性結(jié)果，D為弓形蟲總抗體陽(yáng)性結(jié)果；6為弓形蟲總抗體檢測(cè)線，7為對(duì)昭線。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的說(shuō)明。參見(jiàn)圖1，本實(shí)用新型實(shí)施例設(shè)有載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC 膜)4、弓形蟲總抗體檢測(cè)線6、對(duì)照線7和吸收墊8。加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面，加樣墊2的一端設(shè)在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設(shè)在硝酸纖維膜4的一端上，吸收墊8的一端設(shè)在硝酸纖維膜4的另一端上，弓形蟲總抗體檢測(cè)線6和對(duì)照線7依次設(shè)在硝酸纖維膜4上；在弓形蟲總抗體檢測(cè)線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。所述載體板采用PVC板。以下給出本實(shí)用新型的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7。2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜總檢測(cè)線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7IgG抗體，晾干；所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體由抗 SAGl (P30) -IgG抗體、抗SAG2 (P22) -IgG抗體、抗R0P2_IgG抗體和抗GRA7_IgG抗體按體積比1 1 1 1混合，其終濃度為1 ％ig/mL ；二者點(diǎn)樣量為1 μ L/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆?；所述檸檬酸三鈉的濃度為2%。4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標(biāo)記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標(biāo)記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標(biāo)記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原、膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、膠體金標(biāo)記的 R0P2抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；將膠體金標(biāo)記的SAGl (P30)抗原、膠體金標(biāo)記的SAG2 (P22)、膠體金標(biāo)記的R0P2抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原以體積比(0 5) (0 5) (0 5) (0 5)混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，在37°C烘干，制備成膠體金墊，密封備用。5)制備免疫層析檢測(cè)條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測(cè)線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條。以下給出采用本實(shí)用新型檢測(cè)患者的臨床標(biāo)本
6[0046]取待檢標(biāo)本(全血、血清、血漿、腦脊液)5 40yL，加樣于弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條樣品處，滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在檢測(cè)條對(duì)照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測(cè)區(qū)(T)及對(duì)照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽(yáng)性；加樣檢測(cè)后，檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無(wú)效結(jié)果(見(jiàn)圖2)。以下給出本實(shí)用新型的性能檢定1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無(wú)污染斑點(diǎn)、無(wú)裂縫，膠帶無(wú)開膠，無(wú)切斜現(xiàn)象。2)陽(yáng)性標(biāo)本符合率用弓形蟲總抗體陽(yáng)性的不同滴度的陽(yáng)性參比血清各50份采用弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條檢定，計(jì)算陽(yáng)性符合率。陽(yáng)性參比血清的確定采用ELISA(進(jìn)口試劑)法確定的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陽(yáng)性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進(jìn)口試劑)法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，用特征性血清檢測(cè)，要求陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，用特征性血清檢測(cè)，要求陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。血清(或血漿)來(lái)自本申請(qǐng)人的臨床標(biāo)本。7)交叉反應(yīng)采用本弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，進(jìn)行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來(lái)自本申請(qǐng)人的臨床確診患者。8)穩(wěn)定性檢測(cè)應(yīng)用Arrhenius法則，將弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條放置37°C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個(gè)月。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例1在硝酸纖維素膜(NC膜)總檢測(cè)線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7)抗體，室溫晾干，密封室溫保存?zhèn)溆谩?其中，抗人Ig單克隆抗體的濃度為lmg/mL，羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和GRA7) IgG抗體由羊抗弓形蟲抗原(SAG1(P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7) IgG抗體由抗 SAGl (P30) -IgG抗體、抗SAG2 (P22) -IgG抗體、抗R0P2_IgG抗體和抗GRA7_IgG抗體按體積比1 1 1 1混合，其終濃度為lmg/mL;二者點(diǎn)樣量為lyL/cm。將已純化的金標(biāo)記的弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7以體積比1 1 1 1混合后，均勻地涂于玻璃纖維紙上，在37°c烘干，制備成金膠體墊，密封備用。將固相化的纖維膜與膠體金結(jié)合的玻璃纖維、吸水紙等按一定順序，通過(guò)PVC不干膠底板組合在一起，用切條機(jī)切成一定寬度檢測(cè)條。把弓形蟲IgG抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條與干燥劑一起裝入鋁箔袋中，機(jī)器封口，密封保存。取待檢標(biāo)本血清IOY L，加樣于弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條加樣區(qū)， 同時(shí)滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條對(duì)照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測(cè)區(qū)及對(duì)照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽(yáng)性；加樣檢測(cè)后，檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無(wú)效結(jié)果。(見(jiàn)圖2)實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由SAGl (P30)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAG2 (P22)。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由SAG2 (P22)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAGl (P30)。結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于待檢標(biāo)本為腦脊液標(biāo)本，結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例1的方案制備弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，然后進(jìn)行性能驗(yàn)證。1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無(wú)污染斑點(diǎn)、無(wú)裂縫，膠帶無(wú)開膠，弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條寬度在3 士0. 1mm，無(wú)切斜現(xiàn)象。2)陽(yáng)性標(biāo)本符合率50份經(jīng)ELISA(進(jìn)口試劑)檢測(cè)確定的弓形蟲總抗體陽(yáng)性參比血清，采用發(fā)明的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條檢出弓形蟲總抗體陽(yáng)性50 份，陽(yáng)性標(biāo)本符合率100%。3)陰性標(biāo)本符合率50份ELISA(進(jìn)口試劑)確定的陰性參比血清，采用弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條檢測(cè)未檢出陽(yáng)性標(biāo)本，陰性標(biāo)本符合率100%。4)批內(nèi)差異同一批次弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，用特征性陽(yáng)性血清(ELISA(進(jìn)口試劑))檢測(cè)確定的臨床標(biāo)本陽(yáng)性弓形蟲-總抗體參比高、中、低血清) 檢測(cè)，相同滴度檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，用特征性陽(yáng)性血清(ELISA(進(jìn)口試劑))檢測(cè)確定的臨床標(biāo)本陽(yáng)性弓形蟲-總抗體參比高、中、低血清) 檢測(cè)，相同滴度檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，進(jìn)行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 38)、免疫性肝炎(n = 40)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測(cè)將弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條放置37°C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著變化。
權(quán)利要求1.弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，其特征在于設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測(cè)線、對(duì)照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上。
2.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，其特征在于所述載體板為PVC板。
專利摘要弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，涉及一種弓形蟲總抗體檢測(cè)試劑。提供一種弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條。設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測(cè)線、對(duì)照線和吸收墊。制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣；制備膠體金；膠體金與SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標(biāo)記；制備免疫層析檢測(cè)條。檢測(cè)時(shí)所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/532GK202230086SQ20112035114
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 張長(zhǎng)弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院