專利名稱：用雙指示線免疫層析半定量診斷萊克多巴胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷萊克多巴胺的方法。
背景技術(shù)：
瘦肉精是一類動物用藥的統(tǒng)稱，任何能夠促進(jìn)動物瘦肉生長、抑制動物脂肪生長的化學(xué)藥物均可叫做“瘦肉精”，主要包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。將瘦肉精添加于飼料中，可以增加動物的瘦肉量，減少飼料使用量，促進(jìn)肉品提早上市， 降低成本。但因為考慮對人體會產(chǎn)生副作用，各國的開放使用標(biāo)準(zhǔn)不一。國內(nèi)由于雙匯瘦肉精事件，使得人們開始關(guān)注瘦肉精對于人體的危害。萊克多巴胺為一種醫(yī)藥原料，主要用于治療充血性心力衰竭癥的強(qiáng)心藥，亦可用于治療肌肉萎縮癥，增長肌肉，減少脂肪蓄積。萊克多巴胺為瘦肉精的一種，其瘦肉提高的效率非常高，動物實驗和小規(guī)模的人體試驗發(fā)現(xiàn)每公斤體重的攝入量在67微克之下時對于人體沒有明顯損害，屬于“培林”類瘦肉精之一。美國藥監(jiān)局允許使用“培林類”瘦肉精加入豬飼料中，培林殘留量為50ppb ；日本及新西蘭規(guī)定國內(nèi)嚴(yán)禁使用培林類瘦肉精，而進(jìn)口肉類的培林殘留量為IOppb ；加拿大及世界衛(wèi)生組織規(guī)定培林類殘留量為40ppb ；聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織規(guī)定肉類培林殘留量為IOppb ；中國禁止使用任何培林類瘦肉精。萊克多巴胺主要的檢測手段為液相色譜方法及ELISA方法。高效液相色譜方法 (HPLC)為我國檢測鹽酸克倫特羅的半確證性方法，坐地檢測限范圍為l-15ng/g，優(yōu)點為專屬性好、選擇性強(qiáng)、檢測精確度較高，假陽性率低，但缺點是樣本處理時間較長，檢測過程繁瑣、難于操作，需要貴重的儀器——高效液相色譜儀，需要有專門的儀器操作及結(jié)果分析人員，在實際應(yīng)用中受到很大的經(jīng)費(fèi)限制。采用間接競爭ELISA方法可用于檢測樣本中的萊克多巴胺，通過萊克多巴胺與偶聯(lián)抗原競爭抗萊克多巴胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，底物顯色，運(yùn)用酶標(biāo)儀檢測樣本的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得到樣本中的萊克多巴胺的殘留量。ELISA方法相較于高效液相色譜方法而言，其設(shè)備較為便宜、操作簡單。但對于肉聯(lián)廠等基層使用者而言，耗時較長(大約池)，且需要酶標(biāo)儀、37°C培養(yǎng)箱等設(shè)備。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個重要發(fā)展方向， 是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。免疫膠體金技術(shù)與ELISA技術(shù)同屬于免疫學(xué)診斷方法， 均是依賴于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，但不需要專門的儀器設(shè)備，更適于現(xiàn)場及床旁快速檢測。
利用競爭法免疫層析膠體金技術(shù)測定肉品中的萊克多巴胺的診斷試劑在市場上尚未有商品化的試劑盒，但已開發(fā)，但其僅為定性產(chǎn)品。針對于萊克多巴胺的用途及使用安全性，本研究采用雙指示線半定量檢測方式指示檢測結(jié)果，以方便大眾對其肉品進(jìn)行分別對待，因此，半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內(nèi)外均無相關(guān)的試紙條出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的開發(fā)簡單、快速的萊克多巴胺檢測方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。本實驗采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測萊克多巴胺的方法。并且能夠半定量檢測Ing/mL 2ng/mL這一萊克多巴胺灰區(qū)范圍。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗萊克多巴胺抗體并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物固定于兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線 (即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。本發(fā)明方法包括如下步驟一、膠體金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%檸檬酸三鈉溶液；3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；4.溶液由淺藍(lán)色，深藍(lán)，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。二、膠體金標(biāo)記物的制備1.取兩個1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為7. 5 ；3.加入10μ g/mL萊克多巴胺抗體，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；7.重復(fù)5.步操作；8.重復(fù)6.步操作；9.重復(fù)5.步操作；10.用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；11.玻璃纖維素膜點樣，形成膠金墊，真空凍干3小時。三、在硝酸纖維素膜上劃線1. Tl線用濃度為0. 5mg/mL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出Ing/mL的萊克多巴胺；2. T2線用濃度為0. 9mg/mL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出2ng/mL的萊克多巴胺；3. C線用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、膠體金試紙條的組裝1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見附圖1)；2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進(jìn)行檢測。五、檢測試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前， 與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與Tl線、T2線均出現(xiàn)紅色指示線表明樣本中萊克多巴胺水平小于 lng/mL(見附圖2)，C線與Tl線出現(xiàn)紅色指示線，T2線不顯色表明樣本中的萊克多巴胺水平在l-2ng/mL之間(見附圖3)。C線出現(xiàn)紅色指示線，T1、T2線均不顯色表明樣本中的萊克多巴胺大于2ng/mL(見附圖4)。本發(fā)明有益效果是提供一種用雙指示線免疫層析半定量檢測萊克多巴胺的新型試紙。檢測速度快，所需時間短，只需5min ；能半定量檢測樣本中的萊克多巴胺含量，給出樣本更多的信息，靈敏度更高。不需經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測動物組織樣本、尿液中萊克多巴胺(瘦肉精)的殘留量，并且便于基層推廣和運(yùn)用。


圖1為本發(fā)明實施例試紙條的圖示圖2為本發(fā)明實施例試紙條的陽性結(jié)果(萊克多巴胺水平小于Ing/mL)圖3為本發(fā)明實施例試紙條的陽性結(jié)果(萊克多巴胺水平為l-2ng/mL)圖4為本發(fā)明實施例試紙條的陰性結(jié)果(萊克多巴胺水平大于2ng/mL)
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本實例先用2 %的檸檬酸三鈉溶液制備20nm的金水，并標(biāo)記萊克多巴胺抗體噴金標(biāo)墊，萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物、羊抗鼠多克隆抗體分別包被至檢測線(T線)、質(zhì)控線O 線)，然后組裝成試紙條，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/條，室溫干燥保存?zhèn)溆谩嵤├?.準(zhǔn)備萊克多巴胺抗體和萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物。并清洗實驗所需的玻璃器皿。2.膠體金的制備先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。這樣就制備了 20nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢，確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。3.膠體金標(biāo)記物的制備取兩個1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH 調(diào)整為7. 5 ；加入10 μ g/mL萊克多巴胺抗體，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20μ L的10% BSA，混勻，振蕩30min ；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min， 輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm， 離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為 0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；在玻璃纖維素膜上點樣，形成膠金墊，真空凍干3小時。4.膠體金試紙條的組裝分別將0. 5mg/mL和0. 9mg/mL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物劃在硝酸纖維素膜的檢測線(T線)上，將2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質(zhì)控線(C線)上。然后將硝酸纖維素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后將各個部分按附圖1組裝成試紙條。5.膠體金試紙條的使用及結(jié)果判讀檢測前，先提取被檢者的血清樣本。然后把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與Tl線、T2線均出現(xiàn)紅色指示線表明樣本中萊克多巴胺水平小于lng/mL(見附圖2)，C線與Tl線出現(xiàn)紅色指示線，T2線不顯色表明樣本中的萊克多巴胺水平在l-2ng/mL之間(見附圖3)。C線出現(xiàn)紅色指示線，T1、T2線均不顯色表明樣本中的萊克多巴胺大于2ng/mL(見附圖4)。實施例可直接檢測樣品中的萊克多巴胺，使用方法不需要專業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速，5min即可獲得結(jié)果，可達(dá)到快速、簡便、及時地檢測萊克多巴胺的目的。
權(quán)利要求
1.一種用雙指示線免疫層析半定量診斷萊克多巴胺的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗萊克多巴胺抗體并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物固定于兩個檢測線 (即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷萊克多巴胺的方法，其特征在于，抗體劃線濃度為Tl線用濃度為0. 5mg/mL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出Ing/mL的萊克多巴胺；T2線用濃度為0. 9mg/mL的萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出2ng/mL的萊克多巴胺；C線用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量萊克多巴胺的方法，其特征在于，運(yùn)用不同濃度的抗體溶液在相同的基質(zhì)上劃線，以膠體金方法檢測多個不同濃度水平物質(zhì)的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷萊克多巴胺的方法。萊克多巴胺為瘦肉精“培林”類的一種，較常規(guī)瘦肉精而言，毒性較低，世界衛(wèi)生組織與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織及部分國家(美國、新西蘭、日本等)允許使用，但國家之間允許的肉品殘留量不同。我國目前禁用任何類型的瘦肉精。目前，臨床檢測萊克多巴胺主要通過高效液相色譜方法及ELISA方法，操作方法繁瑣、耗時較長，并且需要昂貴的檢測儀器設(shè)備及專門的檢測操作人員。免疫膠體金技術(shù)近年來發(fā)展迅速，得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測萊克多巴胺的方法。并且能夠通過兩種T線以初步定量肉品中的萊克多巴胺的含量，滿足市場需求。
文檔編號G01N33/558GK102565384SQ20111043372
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司