專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備型多維液相色譜儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在線(xiàn)二維制備液相色譜體系，通過(guò)二位十通閥及軟件將中高壓系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合。一維系統(tǒng)既可以是中低壓系統(tǒng)，也可以是高壓系統(tǒng)；當(dāng)一維分離系統(tǒng)完成分離制備后，經(jīng)過(guò)二位十通閥切換，可以進(jìn)入到第二維色譜柱，進(jìn)行第二維分離；可以有兩根富集柱同時(shí)在線(xiàn)進(jìn)行富集。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是項(xiàng)目集合了最前沿的相關(guān)色譜技術(shù)并加以創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)高中低高壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動(dòng)流份收集器的結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。通過(guò)本系統(tǒng)，將省去成分分離過(guò)程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測(cè)等人工操作，大大提高成分分離的效率。其創(chuàng)新點(diǎn)如下
背景技術(shù)：
天然來(lái)源成分的分離與制備一直是中藥及天然藥物研究過(guò)程中的一大瓶頸。由于 天然產(chǎn)物是復(fù)雜體系，通常一個(gè)樣品中包含了幾十甚至幾百種組分，而各組分之間量的差別通常又很大。因此，為了達(dá)到成分分離的目的，往往要結(jié)合多種色譜填料，進(jìn)行反復(fù)的柱色譜分離操作。這一過(guò)程是繁瑣、漫長(zhǎng)而枯燥的首先用柱色譜對(duì)天然產(chǎn)物提取物進(jìn)行分離并對(duì)分離的流份進(jìn)行分段收集，通過(guò)TLC檢測(cè)確定所需合并的流份，濃縮后再根據(jù)情況進(jìn)行進(jìn)一步的色譜柱分離(有時(shí)可能需要多次重復(fù)上述過(guò)程)，最終，用制備型HPLC進(jìn)行分離，色譜峰收集后進(jìn)行濃縮，由于流動(dòng)相一般含有相當(dāng)比例的水，濃縮步驟也比較耗時(shí)。天然產(chǎn)物往往在冗長(zhǎng)、繁多的柱色譜分離、溶劑濃縮和樣品轉(zhuǎn)移操作中受到損失或者結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，研究者不得不加大投料量以求獲得理想的結(jié)果。因此，如何最大限度減少人工操作、實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分離，以提高效率、突破傳統(tǒng)方法所形成的瓶頸，顯得迫在眉睫。多維液相色譜技術(shù)近10年來(lái)，分析型的色譜儀器獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，UPLC、HPLC-DAD_MS已經(jīng)普及，MDLC(multidimensional liquid chromatography,多維液相色譜)的出現(xiàn)更為中藥及天然產(chǎn)物成分的分析提供了更強(qiáng)有力的工具。MDLC是在高效液相色譜(HPLC)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，它通過(guò)在技術(shù)上及設(shè)備上的改進(jìn)，組合不同的分離模式構(gòu)建多維系統(tǒng)，有效地解決了復(fù)雜體系樣品的分析問(wèn)題。與一維液相色譜系統(tǒng)相比，MDLC主要的優(yōu)勢(shì)在于提供了不同尋常的峰容量，這使得大多數(shù)目標(biāo)化合物和可實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。多維液相柱色譜的實(shí)現(xiàn)主要通過(guò)改變一定條件下特定樣品的選擇性，并在不同色譜柱間的切換來(lái)實(shí)現(xiàn)。在構(gòu)建多維液相色譜最關(guān)鍵的是固定相的選擇以及如何將樣品組分有效地導(dǎo)入第二維色譜柱中，即接口切換技術(shù)。接口切換技術(shù)是MDLC的核心技術(shù)之一。Jorgenson等人早在1990年在研究“中心切割”技術(shù)的基礎(chǔ)上第一次實(shí)現(xiàn)了“全二維切割”，他們用兩個(gè)定量管和一個(gè)八通閥實(shí)現(xiàn)了離子交換色譜(IE)和體積排阻色譜(SEC)的在線(xiàn)連接。自此，以四通閥、六通閥、八通閥、十通閥為代表的接口模式偶聯(lián)的全二維或多維色譜模式紛紛被設(shè)計(jì)運(yùn)用?，F(xiàn)有MDLC技術(shù)的不足由于蛋白質(zhì)組學(xué)的需要，MDLC技術(shù)得到快速發(fā)展，相關(guān)的技術(shù)方法也是為了適應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)大分子分析目的而建立的。在中藥研究上雖然有所應(yīng)用，但也僅局限于樣品的分析。然而，在多數(shù)情況下，僅僅滿(mǎn)足分析需求是不夠的，如在關(guān)注天然產(chǎn)物中的未知及微量成分的時(shí)候，在需要更多的單體用于活性測(cè)定的時(shí)候，就需要對(duì)天然產(chǎn)物組分進(jìn)行分離和制備，現(xiàn)有的MDLC技術(shù)無(wú)法滿(mǎn)足需求，主要體現(xiàn)在I、大容量樣品、流動(dòng)相與現(xiàn)有接口切換技術(shù)不兼容現(xiàn)有的MDLC接口切換技術(shù)能夠滿(mǎn)足分析的需求，卻無(wú)法直接應(yīng)用于成分的分離制備。這是由于分離制備操作過(guò)程中需要處理的更大樣品量，接口要經(jīng)過(guò)體積更大的流動(dòng)相的緣故。分析操作時(shí)，通過(guò)降低一維色譜流速、減少二維色譜的進(jìn)樣量，由流動(dòng)相所帶來(lái)的溶劑效應(yīng)基本可以忽略。但在制備色譜中，溶劑效應(yīng)問(wèn)題是必須要解決的，這對(duì)接口切換技術(shù)提出更高的要求。II、固定相選擇的局限目前的MDLC更多采用的是SEC、RP、AC、IEC、HILIC之間的組合，這對(duì)大分子的分析更為有利。MDLC應(yīng)用于中藥成分分析時(shí)，常常以O(shè)DS(RP)作為二維，一維的色譜柱常常選·擇IEC、HILIC，CN柱、NH2柱或其它類(lèi)型的RP柱。IEC的使用范圍有限，多用于含生物堿樣品的分析；HILIC，CN柱、NH2柱等其它類(lèi)型的RP柱與ODS柱之間的正交性較差，聯(lián)用之后的峰容量提高有限。在天然產(chǎn)物成分研究中最常使用的色譜填料Sephadex LH20，聚酰胺(PA)，卻沒(méi)有得到應(yīng)有的重視。Sephadex LH20兼具分子篩和分配的色譜作用，特別適合天然產(chǎn)物成分的分離；聚酰胺(PA)所獨(dú)具的氫鍵作用力色譜行為使其在分離具有酚羥基或羰基的化合物時(shí)有特殊的效果。將Siiphadex LH20，聚酰胺的作用力特點(diǎn)與ODS的分配機(jī)理結(jié)合，能夠獲得更高的峰容量。

發(fā)明內(nèi)容
雖然MDLC技術(shù)在分析色譜中得到了較成功的應(yīng)用，但要將其應(yīng)用于天然產(chǎn)物成分分離的制備色譜中，需要對(duì)現(xiàn)有系統(tǒng)加以改造創(chuàng)新，也還有很多技術(shù)問(wèn)題需要解決。本項(xiàng)目將通過(guò)制備型MDLC的構(gòu)建，借以突破天然產(chǎn)物成分研究中的瓶頸，改觀目前成分分離技術(shù)水平低下、步驟繁瑣、周期漫長(zhǎng)的現(xiàn)狀。I.項(xiàng)目集合了最前沿的相關(guān)色譜技術(shù)并加以創(chuàng)新，以流動(dòng)相稀釋-富集柱捕集接口為關(guān)鍵的技術(shù)突破，實(shí)現(xiàn)高中低壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動(dòng)流份收集器的結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。通過(guò)本系統(tǒng)，將省去成分分離過(guò)程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測(cè)等人工操作，大大提高成分分離的效率。其創(chuàng)新點(diǎn)如下2.項(xiàng)目方案所設(shè)計(jì)的制備型MDLC儀器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高中低壓柱ID色譜，制備型RP-HPLC的2D色譜系統(tǒng)構(gòu)成。色譜柱間以基于二位十通閥的流動(dòng)相稀釋-富集柱捕集接口實(shí)現(xiàn)全二維切換。3.首次將MDLC應(yīng)用于成分分離制備，現(xiàn)有的MDLC系統(tǒng)均只能滿(mǎn)足分析的需求，卻無(wú)法直接應(yīng)用于成分的分離制備。這是由于分離制備操作要處理的樣品量更大，所要經(jīng)過(guò)的流動(dòng)相體積更大的緣故。MDLC系統(tǒng)進(jìn)行分析操作時(shí)，可以通過(guò)降低一維色譜流速、減少二維色譜的進(jìn)樣量等方式來(lái)消除由流動(dòng)相所帶來(lái)的溶劑效應(yīng)。但在制備色譜中，溶劑效應(yīng)問(wèn)題是必須要解決的，這對(duì)接口切換技術(shù)提出更高的要求，我們?yōu)榇藢?zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的流動(dòng)相稀釋-富集柱捕集接口能夠很好地解決上述問(wèn)題，可以很好的用于成分分離制備。這項(xiàng)工作在國(guó)內(nèi)外均屬首次嘗試。實(shí)施方式實(shí)施例I結(jié)合

圖1，圖2說(shuō)明本發(fā)明的制備二維色譜分離系統(tǒng)。步驟I :二位十通閥在圖I狀態(tài)下，將分離待純化的物質(zhì)提取液由泵2泵入到一維柱色譜進(jìn)行粗分。得到的化合物組分群經(jīng)由出口 3進(jìn)入到富集柱2，富集柱2將目標(biāo)化合物富集。步驟2 :將二位十通閥切換到圖2狀態(tài)，泵I將洗脫液泵入到富集柱2中，將步驟I富集得到的化合物洗脫到二維色譜柱中進(jìn)行精細(xì)分離，得到目標(biāo)化合物。與此同時(shí)，泵2繼續(xù)將一維柱色譜得到的組分經(jīng)出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I將目標(biāo)化合物富集。 反復(fù)進(jìn)行步驟I及步驟2，整個(gè)過(guò)程始終保持一維柱色譜粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，與此同時(shí)，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二維色譜柱進(jìn)行精細(xì)分離。
實(shí)施例粉碎的大黃藥材500g，水提取3次，每次3000ml水，合并濾液，HP20樹(shù)脂洗脫，得到待分類(lèi)樣品。待分離的樣品的HPLC檢測(cè)條件儀器型號(hào)Agilent 1100型HPLC，色譜柱=Cosmosil 卩八0-(18，4.6\250臟，洗脫條件5%^ 100% MeOH，lml. min-1，40min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。HPLC分析圖譜見(jiàn)圖3樣品的多維制備分離第一維中低壓液相色譜參數(shù)中低壓輸液泵，流速lml. min- ;色譜柱Φ 2. 2cmX30cm,以粒徑75 μ M的ODS填充；流動(dòng)相30 % — 60 %的甲醇/水梯度洗脫，共洗脫700ml ;稀釋液參數(shù)稀釋液為水，流速為lml. min-1 (I I混合)。富集柱0DS，粒徑5 μ Μ, Φ 2cmX 5cm(柱體積15· 7ml)。第二維制備型高效液相色譜參數(shù)流速8ml. min-1 ;色譜柱Cosmosil PAQ-C18,5 μ Μ, Φ2ο Χ 25cm(柱體積78.5ml);流動(dòng)相20%— 80 %的甲醇/水梯度洗脫，50min ；254nm檢測(cè)。多維液相圖譜見(jiàn)圖4。圖4與圖3相比，經(jīng)過(guò)多維制備分離的樣品，已經(jīng)有效的將化合物組分群按照極性大小分離開(kāi)，與普通的I維色譜相比，節(jié)約時(shí)間和使用的溶劑。
權(quán)利要求
1.一種制備型多維液相色譜儀，包括一維柱色譜，二維柱色譜，富集柱1，富集柱2，泵1，泵2，特征在于，泵2將待分離組分經(jīng)過(guò)一維柱色譜粗分的化合物群組分不斷的分配給富集柱I和富集柱2。當(dāng)泵2將化合物組分群分配給富集柱I時(shí)，泵I將富集柱2富集到的有效組分洗脫到二維柱色譜進(jìn)行精細(xì)分離。當(dāng)泵2將化合物組分群分配給富集柱2時(shí)，泵I將富集柱I富集到的有效組分洗脫到二維柱色譜進(jìn)行精細(xì)分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的制備型多維液相色譜系統(tǒng)，特征在于一維色譜柱可以使用高中低壓色譜柱。
3.權(quán)利要求I所述的制備型多維液相色譜儀的使用方法，特征在于包括如下操作步驟 a)二位十通閥在圖I狀態(tài)下，將分離待純化的物質(zhì)提取液由泵2泵入到一維柱色譜進(jìn)行粗分。得到的化合物組分群經(jīng)由出口 3進(jìn)入到富集柱2，富集柱2將目標(biāo)化合物富集。
b)步驟2:將二位十通閥切換到圖2狀態(tài)，泵I將洗脫液泵入到富集柱2中，將步驟I富集得到的化合物洗脫到二維色譜柱中進(jìn)行精細(xì)分離，得到目標(biāo)化合物。與此同時(shí)，泵2繼續(xù)將一維柱色譜得到的組分經(jīng)出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I將目標(biāo)化合物富集。
c)反復(fù)進(jìn)行步驟I及步驟2，整個(gè)過(guò)程始終保持一維柱色譜粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，與此同時(shí)，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二維色譜柱進(jìn)行精細(xì)分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多維液相色譜聯(lián)用分離裝置。項(xiàng)目方案所設(shè)計(jì)的制備型多維液相色譜儀器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高中低壓柱1D色譜，制備型RP-HPLC的2D色譜系統(tǒng)構(gòu)成。色譜柱間以基于二位十通閥的流動(dòng)相稀釋-富集柱捕集接口實(shí)現(xiàn)全二維切換。該系統(tǒng)集中高低壓柱色譜大容量的樣品處理能力，制備型RP-HPLC的高效分離能力于一體，實(shí)現(xiàn)高中低壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動(dòng)流份收集器的結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。通過(guò)本系統(tǒng)，將省去成分分離過(guò)程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測(cè)等人工操作，大大提高成分分離的效率。
文檔編號(hào)G01N30/08GK102961892SQ20111025630
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者李賀然, 丘鷹昆 申請(qǐng)人:李賀然, 丘鷹昆