一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源afp的方法
【專利摘要】一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容：(1)利用基因合成技術(shù)合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZ α A-AFP，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；(2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型AFP重組蛋白，并通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；(3)優(yōu)化硫酸銨分級沉淀,從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55％硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達(dá)98.844％；本發(fā)明將純化得到的分泌重組蛋白AFP用臨床檢測電化學(xué)發(fā)光法檢測其生物活性，其值達(dá)3500ng/mL。
【專利說明】—種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外重組高效表達(dá)制備具有生物活性AFP的方法，具體涉及利用分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的人源AFP重組蛋白的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]甲胎蛋白(&1口1^46如口1'(^6111，六--)01^全長183(^口，翻譯后蛋白含有609個(gè)氨基酸殘基，分子量約70kDa。AFP是一種腫瘤相關(guān)的單鏈糖蛋白，其糖鏈部分具有癌胚性變化的特征。AFP為胎兒時(shí)期肝臟合成的一種胚胎蛋白，出生后一周消失，以后完全被白蛋白替代。正常人不產(chǎn)生AFP，當(dāng)患肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎樣腫瘤及部分肝外腫瘤時(shí)機(jī)體可重新合成AFP，因此臨床上AFP被當(dāng)成一種肝癌及生殖細(xì)胞腫瘤的血清標(biāo)志物來使用。目前，肝癌檢查主要包括血清甲胎蛋白(AFP)和肝臟影像學(xué)檢查。檢測AFP是當(dāng)前診斷肝癌最簡便、靈敏、快捷的方法，現(xiàn)認(rèn)為它在發(fā)現(xiàn)早期肝癌方面有獨(dú)一無二的價(jià)值，在臨床上被認(rèn)為是肝癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物，因而被當(dāng)作診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是近幾年發(fā)展起來的較為完善的、被廣泛用來表達(dá)外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要有以下優(yōu)點(diǎn):1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase, A0X1)基因啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；3)營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；4)在P.pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化；5)糖基化程度低，與S.cerevisiae相比，P.pastoris不產(chǎn)生過度的糖基化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種能夠大規(guī)模制備具有生物活性且高純度的AFP的高效表達(dá)具有生物活性的AFP重組蛋白及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容:
[0006](I)利用基因合成技術(shù)合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZ a A-AFP，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0007](2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型AFP重組蛋白，并通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；
[0008](3)優(yōu)化硫酸銨分級沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達(dá)98.844%。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述三個(gè)方面的內(nèi)容中，分別包含有如下步驟:
[0010]第(I)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:
[0011]a.利用基因合成技術(shù)，合成人源AFP序列；
[0012]b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的AFP克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提取；
[0013]第(2)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:
[0014]c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過雙酶切克隆到PpICZ a A載體中，構(gòu)建PpICZ αA-AFP重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0015]d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GSl 15濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過PCR鑒定挑取陽性克?。?br> [0016]e.將d步驟中挑取的陽性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過對甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、菌密度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；
[0017]f.通過步驟e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大;
[0018]g.通過前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；
[0019]第(3)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:
[0020]h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；
[0021]1.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測其含量和純度得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下幾乎已全部析出，且經(jīng)HPLC檢測其純度高達(dá)98.844%。
[0022]本發(fā)明將純化得到的分泌重組蛋白AFP用臨床檢測電化學(xué)發(fā)光法檢測其生物活性，其值達(dá)3500ng/mL。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒PpICZ a A的質(zhì)粒圖譜，
[0024]圖2是重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A-AFP構(gòu)建的PCR鑒定圖，
[0025]圖3是酵母GSl 15重組菌株的菌落PCR鑒定圖，
[0026]圖4是Western blot分析經(jīng)硫酸銨沉淀后的AFP,
[0027]圖5是HPLC分析經(jīng)55 %硫酸銨沉淀后的AFP，
[0028]圖6是硫酸銨濃縮后AFP活力測定，
[0029]圖7是Western blot分析比較制備AFP與肝癌血清樣本的糖基化水平。
[0030]圖1中圖譜的具體信息為:
[0031]5，AOXl 啟動子(5，AOXlpromoter reg1n):basel_941
[0032]5，AOXl 引物綁定位點(diǎn)(5，AOXlpriming site):base855_875
[0033].因子信號序列(-factorsignal sequence):base941-1207
[0034].因子引物綁定位點(diǎn)(-factoe priming site):basell44_1164
[0035]多克隆位點(diǎn)(Multiplecloning site):basel208_1276
[0036]c_myc 抗原決定基(c_myc epitope):basel275_1304
[0037]6XHis 標(biāo)簽(Polyhistidine (6XHis) tag):basel320_1337
[0038]3，AOXl 引物綁定位點(diǎn)(3，AOXlpriming site):basel423_1443
[0039]AOXl 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(A0XI transcript 1n terminat1n reg1n):basel341_1682
[0040]TEFl 啟動子(TEFlpromoter):basel683-2093
[0041]EM7 啟動子(EM7Promoter):base2095-2162
[0042]Sh ble 開放閱讀框架(Sh ble ORF):base2163_2537
[0043]CYCl 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(CYCltranscript1n terminat1n reg1n):base2538_2855
[0044]pUC 復(fù)制起始位點(diǎn)(pUC origin):base2866-3539 (complementary strand)。

【具體實(shí)施方式】
[0045]下面將結(jié)合具體實(shí)施例以及附圖對本發(fā)明作詳細(xì)介紹，本發(fā)明在實(shí)施中選用的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0046]本發(fā)明所述一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容:
[0047](I)利用基因合成技術(shù)合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZ a A-AFP，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0048](2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型AFP重組蛋白，并通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；
[0049](3)優(yōu)化硫酸銨分級沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達(dá)98.844%。
[0050]本發(fā)明的要點(diǎn)是首先構(gòu)建酵母表達(dá)的AFP重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115中，再通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白AFP，最后通過硫酸銨沉淀純化表達(dá)的AFP ;具體包括以下步驟:
[0051]a.利用基因合成技術(shù)，合成人源AFP序列；
[0052]b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的AFP克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提?。?br> [0053]c.將b中獲得的質(zhì)粒通過雙酶切克隆到PpICZ a A載體中，構(gòu)建PpICZ a A-AFP重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0054]d.將c中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GSl 15濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過PCR鑒定挑取陽性克??；
[0055]e.將d中挑取的陽性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過對甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、菌密度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；
[0056]f.通過e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大；
[0057]g.通過前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；
[0058]h.將g中獲得的發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；
[0059]1.將h中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測其含量和純度得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下幾乎已全部析出，且經(jīng)HPLC檢測其純度高達(dá)98.844%。
[0060]實(shí)施例1
[0061]1.研究材料:重組質(zhì)粒pReceiver-AFP由外包服務(wù)公司合成；表達(dá)載體pPICZ αA均購自復(fù)能基因；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑購自北京天根公司；ECL Western Blot檢測試劑盒購自Millipore公司；一抗購自 SC B1technology ;二抗購自 GE Healthcare。
[0062]2.工作流程
[0063](I)以原核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiver-AFP為模板，設(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I識別位點(diǎn)的PCR引物，PCR擴(kuò)增帶雙酶切識別位點(diǎn)的afp目的基因片段，再將畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ a A (結(jié)構(gòu)見圖1)和afp PCR擴(kuò)增基因片段同時(shí)用EcoR I和Xba I雙酶切后經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A-AFP。
[0064](2)制備E.Coli BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A-AFP,取10uL涂布在含zeocin抗性的低鹽LB即LLB平板上，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取3個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在2000bp左右的位置有特異性條帶，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖2所示。選取其中一個(gè)單克隆置于15mL含zeocin LLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，再用小提中量質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0065](3)在將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中之前，先將(3)中提取獲得的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行單酶切線性化、乙醇純化，制備新鮮的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GSl 15中，并均勻地將其涂布在含zeocin的YPD平板中。待長出單克隆后，挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在2000bp左右的位置有特異性條帶，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖3所示。
[0066](4)挑取(3)中鑒定為陽性單克隆的4株重組菌株接種于1mL BMGY培養(yǎng)基中。30°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)2?6，2500r/min離心5min，棄上清，用20mL BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30°C振蕩培養(yǎng)甲醇(0.5%)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)開始后每隔24h取樣，樣品經(jīng)SOOOr/min離心lmin，將上清和細(xì)胞沉淀分離并放置在4°C。同時(shí)，補(bǔ)加無菌的100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導(dǎo)。
[0067](5)發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心30min。將發(fā)酵上清液用硫酸銨分級沉淀(30^^55%和75% )進(jìn)行純化,并通過Western blot以及HPLC分析蛋白純度。結(jié)果Western blot檢測到70kDa處有AFP特異性免疫反應(yīng)條帶且55%硫酸銨沉淀后的AFP純度為98.844%，表明重組AFP蛋白表達(dá)成功如圖4和圖5所示。
[0068](6)將(5)中的經(jīng)硫酸銨沉淀后獲得的AFP和硫酸銨沉淀前的AFP用羅氏E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定其活力，結(jié)果表明成功表達(dá)的重組AFP具有生物活性如圖6所示。
[0069](7)將55%硫酸銨沉淀后手機(jī)的AFP與臨床肝癌血清樣本進(jìn)行Western blot比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備AFP與臨床肝癌血清樣本的分子量大小相當(dāng)，表明兩者的糖基化水平相近如圖7所示。
【權(quán)利要求】
1.一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，其特征在于該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容: (1)利用基因合成技術(shù)合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZ a A-AFP，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提； (2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型AFP重組蛋白，并通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件； (3)優(yōu)化硫酸銨分級沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達(dá)98.844%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，其特征在于所述三個(gè)方面的內(nèi)容中，分別包含有如下步驟: 第(I)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟: a.利用基因合成技術(shù)，合成人源AFP序列； b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的AFP克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提??； 第(2)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟: c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過雙酶切克隆到PpICZa A載體中，構(gòu)建PpICZ a A-AFP重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提； d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GSl 15濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過PCR鑒定挑取陽性克??； e.將d步驟中挑取的陽性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過對甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、菌密度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；f.通過步驟e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大； g.通過前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液； 第(3)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟: h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白； i.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測其含量和純度得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下幾乎已全部析出，且經(jīng)HPLC檢測其純度高達(dá)98.844%。
【文檔編號】C07K14/47GK104371017SQ201410320779
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】歐文斌, 孟凡國, 嚴(yán)子琴, 劉麗, 胡衛(wèi)江, 劉俊 申請人:嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司, 浙江清華長三角研究院