專利名稱：基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于熒光生物檢測的芯片結(jié)構(gòu)，特別涉及一種基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來全反射熒光顯微鏡由于適合單分子水平近表面分子動力學(xué)研究，因而受到了廣泛關(guān)注。全反射熒光顯微鏡的工作原理依賴于全反射產(chǎn)生的倏逝波。相對于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡來說，利用倏逝波激發(fā)熒光團(tuán)，可以使背景噪音降到很小，從而使顯微效果更加清晰。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Thomas Bruns等2005年發(fā)表的“I1R Fluorescence Reader for Selective Detection of Cell Membranes，，(用于選擇性探測細(xì)胞膜的全反射熒光讀取器)，該文中描述的讀取器實(shí)驗(yàn)探測了 T47D乳腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)如下 一個(gè)96井(8X 12)的無底平板，通過無細(xì)胞毒性的粘合劑與一塊2mm厚的具有較低吸收率的玻璃片黏結(jié)在一起，再在玻璃底座的兩端橫向黏結(jié)一個(gè)矩形截面的玻璃棒，用于入射光和出射光的耦合。具體檢測步驟如下首先，帶有單模光纖系統(tǒng)的氣冷式氬離子激光器發(fā)出波長為488nm的激光，光束通過3個(gè)分光鏡后便被均分成8束；接著該8束激光通過鏡面反射后再折射進(jìn)入玻璃棒，此時(shí)由玻璃棒進(jìn)入d=2mm的玻璃底板的入射光角度為66° (玻璃折射率為1. 525，細(xì)胞質(zhì)折射率為1. 37，兩個(gè)井之間的距離s為9mm，θ = arctan (s/2d)= 66° )，大于玻璃和細(xì)胞質(zhì)之間的臨界角64° ；最后，光束進(jìn)入玻璃底板之后經(jīng)過23次全反射后從另一個(gè)玻璃棒射出，同時(shí)通過電荷耦合攝像機(jī)(CCD攝像機(jī))進(jìn)行各個(gè)井的熒光亮度觀察。這種讀取器的尺寸較大不利于集成，生物材料消耗較大，每次使用都需要對準(zhǔn)，若在沒對準(zhǔn)的情況下光束經(jīng)折射進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)可能會對細(xì)胞產(chǎn)生某些影響，而且在用CCD攝像機(jī)觀察時(shí)需要用濾波裝置來減少背景噪音。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片及其制備方法，該芯片利于和微分析系統(tǒng)集成，不需要體激光源，生物材料消耗低，熒光背景噪音小，靈敏度高。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及的基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片，包括光纖支撐，光纖，光纖阻止，透鏡，棱鏡和樣品臺。其中，樣品臺由玻璃片和PDMS (聚二甲基硅氧烷)芯片鍵合而成， 位于整個(gè)芯片的最上面。樣品臺的正下方是棱鏡，在同一水平線上的是透鏡，光纖阻止，以及光纖支撐，這些部件都由PDMS —體制得，簡潔，緊湊。此外，光纖通過粘合劑粘在光纖支撐上。本發(fā)明所述的生物檢測芯片，當(dāng)激光經(jīng)耦合進(jìn)入單模光纖時(shí)，光束在光纖中傳播， 出射后由透鏡進(jìn)行校正，到達(dá)空氣/棱鏡界面(水平夾角為7°，空氣折射率為1，棱鏡折射率為1.46)時(shí)發(fā)生折射，入射角為35. 3°，折射角為23. 3°。折射光隨后到達(dá)棱鏡/玻璃界面進(jìn)一步折射，入射角為78°，折射角為69.97°，該折射角大于玻璃/水界面的全反射臨界角61°，因此折射光線定會在界面發(fā)生全反射，折射光進(jìn)入玻璃后在玻璃/水界面發(fā)生全反射。事實(shí)上，發(fā)生全反射時(shí)，并不是所有的光波都被反射回玻璃了，還是會有一部分波，即倏逝波會透出玻璃/水界面，穿透深度為100-300nm，該波能夠激發(fā)熒光團(tuán)駐留在介質(zhì)/液體附近，既促使樣品發(fā)出熒光又不至于照亮整個(gè)樣品，從而大大減小熒光成像的背景干擾。本發(fā)明涉及的基于全反射的熒光生物檢測芯片的制備方法，包括如下步驟 首先準(zhǔn)備一塊(100)硅片，然后熱氧化生長一層二氧化硅薄膜，在此基片上涂布一層光
刻膠，將制作好的掩模板放在基片正上方，曝光、顯影之后將掩模板的圖案轉(zhuǎn)移到基片上，
然后利用BHF對基片進(jìn)行刻蝕，去除二氧化硅。而后對此結(jié)構(gòu)進(jìn)行硅濕法刻蝕，使用的刻蝕液為TMAH (四甲基氫氧化銨)，主要對硅進(jìn)行各向異性刻蝕，(111)晶面的刻蝕速率比較慢，因此側(cè)面能形成54. 7°的傾角，從而形成了光纖支撐和棱鏡結(jié)構(gòu)。再通過微細(xì)加工工藝形成透鏡窗口，具體步驟為首先沉積金屬鋁(Al)層并形成透鏡窗口，接著進(jìn)行DRIE (深度反應(yīng)離子刻蝕)刻穿硅片。最后去除Al層，SiO2層，再用環(huán)氧膠將Si芯片與玻璃襯底結(jié)合在一起，便制成完整模具，采用PDMS進(jìn)行轉(zhuǎn)寫，就得到該芯片的核心部件，光纖支撐，光纖阻止(Mopper)，透鏡和棱鏡。本發(fā)明與現(xiàn)有的熒光生物檢測技術(shù)相比，將光纖支撐，光纖阻止，聚光透鏡，棱鏡四部分集成在一起，芯片體積小，利于和微分析系統(tǒng)集成；在MEMS技術(shù)領(lǐng)域來說，制作成本低，制得的硅模具可重復(fù)使用，只需用PDMS進(jìn)行轉(zhuǎn)寫；不需要體激光源；生物材料消耗低， 熒光背景噪音小，靈敏度高，可用于分子水平的探測；可同時(shí)并行檢測三個(gè)樣品(可根據(jù)具體需要在模板制作時(shí)增減并行的光纖支撐)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中樣品臺部分的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中樣品臺下方結(jié)構(gòu)示意圖3為本發(fā)明實(shí)施例的截面圖； 圖4為本發(fā)明實(shí)施例的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。如圖1-3所示，本實(shí)施例中的熒光生物檢測芯片是由全反射產(chǎn)生的倏逝波來激發(fā)熒光反應(yīng)的。具體結(jié)構(gòu)包括光纖1，光纖支撐2，光纖阻止3，透鏡4，棱鏡5，樣品臺6。所述樣品臺6由玻璃片和PDMS芯片鍵合而成；樣品臺6位于整個(gè)芯片的最上面，樣品臺6的下面是位于同一水平面的棱鏡5，透鏡4，光纖阻止3，光纖支撐2，光纖1。其中，光纖1由粘合劑黏在光纖支撐2上，棱鏡5，透鏡4，光纖阻止3以及光纖支撐2材質(zhì)都為PDMS，經(jīng)由微加工工藝制得Si模，再由PDMS轉(zhuǎn)寫。整個(gè)芯片集成度高，結(jié)構(gòu)緊湊，Si?？捎糜谥貜?fù)制
PDMS經(jīng)轉(zhuǎn)寫復(fù)制了硅模具上的結(jié)構(gòu)，接著鍵合兩片100//m厚的玻璃片通過范德瓦耳斯力與其結(jié)合在一起，加強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度并作為樣品臺6，如圖1所示。單模光纖嵌入外徑為250//m的玻璃管并用膠粘在光纖支撐內(nèi)，這樣就避免了后續(xù)的對準(zhǔn)工作。光纖阻止的寬度為115//m，便于光纖定位安裝，如圖2所示。圖3為本實(shí)施例的截面圖。本實(shí)施例完成的主要過程激光經(jīng)分光器件分成三束耦合進(jìn)入單模光纖，射出的光束由透鏡校準(zhǔn)，到達(dá)空氣/棱鏡界面發(fā)生折射，折射光到達(dá)棱鏡/玻璃界面再次折射，折射光在玻璃/水(樣品在水中)界面的入射角大于臨界角，因此發(fā)生全反射，在全反射區(qū)域產(chǎn)生倏逝波激發(fā)水中的樣品發(fā)生熒光反應(yīng)，再由CCD攝像機(jī)7同時(shí)觀察三個(gè)樣品的熒光現(xiàn)象， 其中一個(gè)可以作為參照，對比觀察另外兩個(gè)。上述基于全反射的熒光生物檢測芯片核心在制備芯片的PDMS中間層，另外包括兩個(gè)步驟，玻璃片鍵合，光纖粘合。如圖4所示，本實(shí)施例的PDMS中間層制備包括以下幾個(gè)步驟
第一步準(zhǔn)備一塊(IOO)Si片，厚度為300//m。然后放入氧化爐中對硅片進(jìn)行熱氧化， 氧化爐的溫度為1100攝氏度，氧化時(shí)間為5分鐘，生成的二氧化硅薄膜厚度為600nm，如圖 4(a)。第二步旋涂光刻膠3 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，厚度為l//m，利用事先做好的掩模板，采用電子束對基片進(jìn)行曝光，電子束的電流為ΙΟρΑ，曝光時(shí)間為30sec，這樣就把掩模板上的方腔圖案(光纖對準(zhǔn)和棱鏡窗口)轉(zhuǎn)移到基片上，再用BHF將窗口中的SiO2去除。 采用TMAH溶液(20%wt，90° C，電磁攪拌速率為250rpm)進(jìn)行各向異性濕法刻蝕6小時(shí)，刻蝕深度為270// m?？涛g速率約為0. 75// m Hiinm,較低的刻蝕速率使得<111>晶面非常平滑。清洗，去除刻蝕液和光刻膠，如圖4(b，c)。光纖支撐即圖中四個(gè)并排的槽長，寬分別為4mm，1mm，槽間距為115//m。棱鏡長， 寬分另1J為8mm, 9mm。第三步沉積一層Al，光刻形成光纖阻止和透鏡窗口，用BHF去除窗口中的Al和 Si02，如圖 4(d)。光纖阻止部分前端開口 115" m，內(nèi)部開口 50°，圓弧曲率半徑為450//m。透鏡部分曲率半徑為450// m,厚度為436// m，透鏡中心距光纖支撐463// m,即透鏡的焦距。第四步采用DRIE垂直刻穿微透鏡和光纖阻止窗口。去除Al層和SiO2層，硅模具便制作完成，如圖4(e)。第五步對模具進(jìn)行PDMS轉(zhuǎn)寫，底板厚度為0. 5mm,固化劑和預(yù)聚物的重量比為 1:10，加熱使PDMS變硬，脫模，便得到本發(fā)明的核心部件，光纖支撐，光纖阻止，透鏡和棱鏡如圖4(f)。盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實(shí)施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1.一種基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片，其特征在于包括光纖支撐，光纖，光纖阻止，透鏡，棱鏡和樣品臺；其中所述樣品臺由玻璃片和PDMS芯片鍵合而成，位于整個(gè)芯片的最上面，樣品臺的下面是位于同一水平面的棱鏡，透鏡，光纖阻止，光纖支撐以及光纖，所述棱鏡，透鏡，光纖阻止以及光纖支撐都由PDMS —體制得；當(dāng)激光經(jīng)耦合進(jìn)入單模光纖時(shí)，光束在光纖中傳播，出射后由透鏡進(jìn)行校正，到達(dá)空氣/棱鏡界面時(shí)發(fā)生折射，折射光隨后到達(dá)棱鏡/玻璃界面進(jìn)一步折射，折射光進(jìn)入玻璃后在玻璃/水界面發(fā)生全反射，在全反射區(qū)域產(chǎn)生倏逝波激發(fā)水中的樣品發(fā)生熒光反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片，其特征在于，所述光纖由粘合劑黏在光纖支撐上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片，其特征在于， 所述光束到達(dá)空氣/棱鏡界面時(shí)，其中水平夾角為54. 7°，棱鏡折射率為1. 46，入射角為 35.3°，折射角為23.3°。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片，其特征在于，所述光束到達(dá)棱鏡/玻璃界面進(jìn)一步折射，入射角為78°，折射角為69. 97°。
5.一種基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟首先準(zhǔn)備一塊(100)硅片，然后熱氧化生長一層二氧化硅薄膜，在此基片上涂布一層光刻膠，將制作好的掩模板放在基片正上方，曝光、顯影之后將掩模板的圖案轉(zhuǎn)移到基片上；然后利用BHF對基片進(jìn)行刻蝕，去除二氧化硅，而后對此結(jié)構(gòu)進(jìn)行硅濕法刻蝕，從而形成了光纖支撐和棱鏡結(jié)構(gòu)；再通過微細(xì)加工工藝形成透鏡窗口，首先沉積金屬鋁Al層并形成透鏡窗口，接著進(jìn)行 DRIE刻穿硅片；最后去除Al層，SiO2層，再用環(huán)氧膠將Si芯片與玻璃襯底結(jié)合在一起，便制成完整模具，用PDMS進(jìn)行轉(zhuǎn)寫，得到該芯片的光纖支撐，光纖阻止，透鏡和棱鏡。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片的制備方法，其特征在于，所述硅濕法刻蝕，是指使用的刻蝕液為四甲基氫氧化銨TMAH，對硅進(jìn)行各向異性刻蝕，(111)晶面的刻蝕速率比較慢，側(cè)面形成54. V的傾角。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于全反射的平面并行熒光生物檢測芯片及其制備方法，該芯片中樣品臺由玻璃片和PDMS芯片鍵合而成，位于整個(gè)芯片的最上面，樣品臺的下面是位于同一水平面的棱鏡，透鏡，光纖阻止，光纖支撐以及光纖，所述棱鏡，透鏡，光纖阻止以及光纖支撐都由PDM一體制得；當(dāng)激光經(jīng)耦合進(jìn)入單模光纖時(shí)，光束在光纖中傳播，出射后由透鏡進(jìn)行校正，到達(dá)空氣/棱鏡界面時(shí)發(fā)生折射，折射光隨后到達(dá)棱鏡/玻璃界面進(jìn)一步折射，折射光進(jìn)入玻璃后在玻璃/水界面發(fā)生全反射，在全反射區(qū)域產(chǎn)生倏逝波激發(fā)水中的樣品發(fā)生熒光反應(yīng)。該芯片利于和微分析系統(tǒng)集成，不需要體激光源，生物材料消耗低，熒光背景噪音小，靈敏度高。
文檔編號G01N21/64GK102410996SQ201110248090
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者廖哲勛, 李以貴, 羅晨晨, 羅江波 申請人:上海交通大學(xué)