專利名稱：單個(gè)熒光探針的定位方法、裝置及超分辨成像方法、系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于顯微成像領(lǐng)域，尤其涉及一種單個(gè)熒光探針的定位方法、裝置及超分辨成像方法、系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
熒光顯微成像由于受光學(xué)衍射極限的限制，其空間分辨率只能達(dá)到橫向約200nm、 軸向約600nm。對于尺度小于衍射極限的單個(gè)熒光探針來說，探測到熒光圖像的大小是由顯微光學(xué)系統(tǒng)的艾里斑確定的，而該熒光探針的實(shí)際空間位置可由該彌散斑的質(zhì)心確定， 其定位精度可達(dá)納米級。單個(gè)熒光探針的定位和探測為監(jiān)測蛋白質(zhì)及生物大分子的動力學(xué)過程提供了強(qiáng)大的工具，成為細(xì)胞生物學(xué)最重要的研究領(lǐng)域之一，如在感染過程中的流感病毒的運(yùn)動，分子馬達(dá)的運(yùn)動等。超分辨熒光成像可以以納米級的空間分辨率直觀地顯示被標(biāo)記分子在被標(biāo)記物內(nèi)的空間分布，并能用來研究被標(biāo)記分子之間的相互作用過程，可用于生物領(lǐng)域研究細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和運(yùn)動規(guī)律。目前常用的熒光成像方法是利用熒光標(biāo)記物本身的開關(guān)效應(yīng)來進(jìn)行定位的顯微成像技術(shù)，通過時(shí)分復(fù)用、質(zhì)心定位以及圖像復(fù)合來進(jìn)行納米分辨成像。例如，光敏定位顯微(PALM)、隨機(jī)光學(xué)重建顯微(STORM)等等，它們在每個(gè)時(shí)刻獲取稀疏分布的熒光標(biāo)記物的定位信息，然后將不同時(shí)刻獲得的定位信息疊加，最終實(shí)現(xiàn)高橫向納米分辨。結(jié)合軸向分辨輔助元件或方法，可進(jìn)行三維納米顯微成像。根據(jù)基于單分子定位方法的超分辨熒光顯微的原理可知，單分子定位方法的優(yōu)劣對超分辨圖像質(zhì)量和數(shù)據(jù)處理速度都有重要的影響，提高熒光分子的定位速度是進(jìn)行實(shí)時(shí)成像的重要途經(jīng)。目前，單個(gè)熒光探針定位方法主要有質(zhì)心法、高斯擬合法、極大似然法，解線性方程組法，馬良算法等。在這些方法中，質(zhì)心法速度快，但定位精度較低。高斯擬合法在弱信號水平下能保持較高的定位精度，從而成為超分辨成像中應(yīng)用最廣泛的一種定位方法，然而該方法需要進(jìn)行迭代擬合運(yùn)算，收斂速度和精度對初始值的選取有很強(qiáng)的依賴性，并且非常耗時(shí)。極大似然法也是一個(gè)迭代優(yōu)化方法，與高斯擬合法存在同樣的問題。解線性方程組法是在知道熒光分子成像模型與背景噪聲強(qiáng)度的情況下，導(dǎo)出一個(gè)線性方程組，通過求解線性方程組獲得熒光分子的精確位置，該算法速度很快，但對噪聲評估有很強(qiáng)的依賴性。 馬良算法將極大似然估計(jì)和圖形處理單元(graphics processing unit, GPU)并行計(jì)算相組合，實(shí)現(xiàn)了單分子定位的快速運(yùn)算，但算法的本質(zhì)還是一種迭代優(yōu)化算法。并且，對厚樣品成像來說，精確估計(jì)噪聲是非常困難的，非焦面熒光在不同的獲取時(shí)刻在空間和時(shí)間上都是變化的，即使是在均勻光照明下，CCD中不同的像素也具有不同的噪聲和背景標(biāo)準(zhǔn)，因此該方法受噪聲的影響仍然很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種單個(gè)熒光探針的定位方法，旨在解決傳統(tǒng)定位方法定位速度慢及受噪聲影響大的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，ー種單個(gè)熒光探針的定位方法，所述方法包括下述步驟以所述單個(gè)熒光探針的熒光圖像的極大值點(diǎn)為中心，選取一矩形區(qū)域；對所述矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻 譜
權(quán)利要求
1. 一種單個(gè)熒光探針的定位方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟 以所述單個(gè)熒光探針的熒光圖像的極大值點(diǎn)為中心，選取一矩形區(qū)域； 對所述矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻譜
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的矩形區(qū)域的寬度為成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高全寬的2 5倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對所述矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻譜的步驟具體為采用補(bǔ)零快速傅里葉變換算法對所述矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻譜。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括下述步驟對單個(gè)熒光探針進(jìn)行軸向定位，獲取軸向位置坐標(biāo)；將所述軸向位置坐標(biāo)與所述二維位置坐標(biāo)相結(jié)合，獲得所述單個(gè)熒光探針的三維位置坐標(biāo)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述對單個(gè)熒光探針進(jìn)行軸向定位，獲取軸向位置坐標(biāo)的步驟具體為分別在成像系統(tǒng)的像焦平面的前方和后方相同距離處采集所述單個(gè)熒光探針的熒光圖像；將采集的兩幅熒光圖像的熒光強(qiáng)度信號差動相減，根據(jù)相減后得到的探測信號確定熒光標(biāo)記物的軸向位置。
6.一種超分辨熒光顯微成像方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟采集多幅熒光圖像；在每幅熒光圖像中搜索極大值點(diǎn)；采用權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的單個(gè)熒光探針的定位方法對每幅圖像的每個(gè)極大值點(diǎn)對應(yīng)的圖像區(qū)域進(jìn)行分析，獲取全部熒光探針的位置信息； 根據(jù)全部熒光探針的位置信息描繪出超分辨熒光圖像。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述在每幅熒光圖像中搜索極大值點(diǎn)的步驟具體為將每幅熒光圖像的強(qiáng)度與預(yù)設(shè)強(qiáng)度閾值進(jìn)行比較，選取所述強(qiáng)度大于所述閾值的點(diǎn)作為所述極大值點(diǎn)。
8.—種單個(gè)熒光探針的定位裝置，其特征在于，所述定位裝置包括區(qū)域選取單元，用于以單個(gè)熒光探針的熒光圖像的極大值點(diǎn)為中心，選取一矩形區(qū)域；傅里葉變換單元，用于對所述矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻譜
9.如權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括軸向定位單元，用于根據(jù)熒光圖像對單個(gè)熒光探針進(jìn)行軸向定位，獲取軸向位置坐標(biāo)；三維坐標(biāo)獲取單元，用于將所述軸向位置坐標(biāo)與所述二維位置坐標(biāo)相結(jié)合，獲得所述單個(gè)熒光探針的三維位置坐標(biāo)。
10.一種超分辨熒光顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括用于采集多幅熒光圖像的圖像采集器，以及與所述圖像采集器相連接、用于獲取超分辨熒光圖像的圖像處理器；所述圖像處理器包括權(quán)利要求8或9所述的單個(gè)熒光探針的定位裝置；以及輸入端與所述圖像采集器相連接、輸出端與所述定位裝置相連接的搜索裝置，用于搜索每幅熒光圖像的極大值點(diǎn)；與所述定位裝置相連接的重構(gòu)裝置，用于根據(jù)所述定位裝置輸出的每個(gè)熒光探針的位置信息重構(gòu)超分辨熒光圖像。
全文摘要
本發(fā)明適用于顯微成像領(lǐng)域，提供了一種單個(gè)熒光探針的定位方法、裝置及超分辨成像方法、系統(tǒng)，該定位方法包括下述步驟以單個(gè)熒光探針的熒光圖像的極大值點(diǎn)為中心，選取一矩形區(qū)域；對矩形區(qū)域內(nèi)的熒光圖像進(jìn)行傅里葉變換，獲得所述熒光圖像的傅里葉頻譜；獲得熒光圖像的傅里葉頻譜的相移；對相移進(jìn)行梯度運(yùn)算，獲得單個(gè)熒光探針的二維位置坐標(biāo)。該定位方法是一種噪聲自由的頻率域非迭代的定位方法，對運(yùn)算初始值的選取及噪聲的評估沒有依賴性，可實(shí)現(xiàn)快速、精確定位?；谠摱ㄎ环椒ǖ某直鏌晒怙@微成像方法可以對探測物品中的多個(gè)熒光探針進(jìn)行快速定位。該定位方法及成像方法在活體細(xì)胞三維納米成像和單分子追蹤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/64GK102288589SQ201110171648
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者于斌, 屈軍樂, 牛憨笨, 陳丹妮 申請人:深圳大學(xué)