專利名稱：一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析化學領(lǐng)域，涉及一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)化合物都是小分子化合物，它們都具有相近的物理和化學性質(zhì)，它們的存在和豐度對于細胞代謝調(diào)控、能量控制、信號傳導等重要生理活動至關(guān)重要。通過研究從單細胞藻類中得到的總脂提取物，可以獲得脂代謝物組(Iipidome)的信息(脂代謝譜)，包括了細胞內(nèi)所有脂類物質(zhì)的組成、相互作用和功能信息，它反映了在特定生理狀態(tài)下單細胞藻類細胞內(nèi)脂代謝物的整體變化，能夠更詳細地了解細胞受外界干擾因素所引起的脂質(zhì)代謝通路和網(wǎng)絡(luò)的改變，發(fā)現(xiàn)和鑒定脂質(zhì)生物標志物，能夠確定具有關(guān)鍵作用的生物分析，并有助于推測關(guān)鍵代謝途徑的調(diào)控模式。脂代謝物譜的分析要求高靈敏度、高通量和無偏向性的分析方法。由于脂代謝物和生物體系的復雜性，至今為止，尚無一種能滿足上述所有要求的代謝組學分析技術(shù)。現(xiàn)有的核磁共振技術(shù)(NMR)具備快速和無偏向性的特點，但其靈敏度太低。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復雜混合物更準確的定性定量分析，也簡化了樣品的前處理過程。氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MQ靈敏度較高，但其研究范圍僅限于分析揮發(fā)性的物質(zhì)，無法分析熱不穩(wěn)定性和分子量較大的代謝產(chǎn)物。這一缺陷正好可由液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MQ技術(shù)來彌補。因此，LC-MS使得快速發(fā)現(xiàn)、靈敏檢測和證實新的和不尋常的脂族化合物和脂肪酸(包括生物膜主要組分、脂類信號分子)的效率明顯提高。超高效液相色譜(UPLC)耦合四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜Oi-TOF)，兩者的聯(lián)用適合于復雜體系的分離分析和未知物的結(jié)構(gòu)鑒定。樣品分型常用模式識別方法，即基于檢測到的代謝物信息來建立多變量統(tǒng)計模型，一方面表征樣品之間的關(guān)系，另一方面篩選對樣品分類有重要貢獻的潛在標志物?，F(xiàn)有的常用模式識別方法是主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。主成分分析 (PCA)是一種現(xiàn)有的常用無師監(jiān)督模式識別方法，可以直觀地在多維空間上描述樣品間的差異。在PCA模型中，兩組之間的區(qū)別不太明顯，模型僅能解釋部分原始數(shù)據(jù)。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)判別能力優(yōu)于PCA，而正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)是一種該進的偏最小二乘判別分析，其分析效果比常規(guī)的PLS-DA更有優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法，其特征包括下述步驟(1)單細胞藻類細胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護；( 超高效液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/Q-T0F-MS)分析脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx提取分析數(shù)據(jù)并導入到Simca-p軟件中進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) ； (4)對OPLS-DA模型進行驗證(5)由OPLS-DA模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標志物；(6)對潛在脂質(zhì)生物標志物進行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。上述的方法中，用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取單細胞藻細胞內(nèi)脂質(zhì)化合物，提取液中加入抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。其中提取液甲醇、三氯甲烷、水的體積比為1 1 0.5，抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)與提取液的質(zhì)量體積比為0.01% -0. 05% g/mi。樣品與提取液混合后，用振蕩器震蕩5-lOmin后，在4-10°C下離心后取下層溶液，用氮氣吹干，再用0. 5-lml色譜甲醇溶解；所述樣品為單細胞藻粉。上述的方法中，步驟(1)中單細胞藻中提取的脂質(zhì)化合物采用超高效液相色譜與四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀測定。上述的方法中，步驟O)中采用超高效液相色譜與四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物，超高效液相色譜方法中，流動相A為水、異丙醇和甲酸的混合液，其中水、 異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動相A的0.1% (ν/ν)；流動相B 為乙腈、異丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動相B的0. (ν/ν)；色譜柱溫為35°C -40°C，樣品室溫為4°C -10°C，流速為 0. 3-0. 4ml/min，進樣體積為 1-5 μ 1。上述的方法中，質(zhì)譜分析過程分別采用電噴霧(ESI)離子源正離子和負離子兩種模式進行檢測。正、負離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細管電壓為^00V-3000V，錐孔電壓為40-60V，離子源溫度為95-105°C，電噴霧氣(脫溶劑氣)溫度為340_360°C，電噴霧氣流量(脫溶劑氣流量)為580-6201/h，錐孔氣流量為58-621/h，數(shù)據(jù)采集范圍在IOO-IOOOmZo上述的方法中，用Markerlynx提取步驟O)由超高效液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀所采集到的數(shù)據(jù)，并將提取的數(shù)據(jù)進行歸一化處理，再導入到Simca-p軟件中進行Pareto標尺化處理，然后經(jīng)Pareto標尺化后的數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析。上述的方法中，對步驟C3)所建立的OPLS-DA模型進行驗證。驗證方法為隨機抽取80%由Markerlynx所提取的數(shù)據(jù)來建立OPLS-DA模型，由該模型來預(yù)測剩下20%數(shù)據(jù)的分類情況。上述的方法中，由步驟(3)正交偏最小二乘判別分析的結(jié)果，即變量重要因子(Variable Importance for the Pro jection，VIP)值和 s 載荷圖，篩選出潛在的脂質(zhì)生物標志物；其中，變量重要因子值(VIP)大于1，同時在s載荷圖中縱坐標的絕對值 (|p(COrr) I)，即變量投影置信水平，大于0. 6的化合物作為潛在的脂質(zhì)生物標志物。上述的方法中，對步驟(5)中潛在脂質(zhì)生物標志物進行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定，其依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、可能元素組成、一級質(zhì)譜母離子的保留時間以及二級質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子分析。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)勢如下1、本發(fā)明使用超高效液相色譜(UPLC)耦合四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀0MOF) 為分析檢測手段，兩者的聯(lián)用適合于復雜體系的分離分析和未知物的結(jié)構(gòu)鑒定。UPLC使用小顆粒色譜填料(< 2 μ m)和超高壓輸液單元(能達到15，OOOpsi)，與常規(guī)HPLC相比峰容
4量增加2倍，分離速度提高10倍，靈敏度提高3 5倍，反壓提高8倍，提高了樣品的分析通量，靈敏度、分離度和分析速度，再和質(zhì)譜聯(lián)用時有助于目標化合物與競爭性電離雜質(zhì)的分離，從而減弱離子抑制作用。Q-TOF檢測器靈敏度高、分辨率高，能夠達到20X10_6的質(zhì)量準確度，能夠區(qū)分分子質(zhì)量很接近的不同脂類分子的質(zhì)量峰。通過TOF-MS能獲取較高的質(zhì)量準確度的碎片離子信息，同時具有的MS/MS 二級碎片解析功能對于鑒定未知或者尚未鑒定的脂類代謝分子也非常有幫助。2、本發(fā)明采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的模式識別方法，是一種改進的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，橫坐標體現(xiàn)了樣品組間差異(外界干擾因素引起)，縱坐標體現(xiàn)了樣品組內(nèi)差異，其判別能力優(yōu)于常規(guī)的PCA和PLS-DA，其分析結(jié)果將與分類變量相關(guān)的變量和與分類變量正交(無關(guān))的變量分開，僅篩選出與分類變量相關(guān)的標志物，從而提高可靠性和準確性。3、本發(fā)明所建立的發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂類生物標志物的通用技術(shù)體系，可輻射應(yīng)用到植物和微生物代謝組學分析、食品安全代謝組學分析等領(lǐng)域。


圖1是0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl培養(yǎng)的雪地衣藻對照的OPLS-DA 模型，其中圖Ia為ESI正離子模式的OPLS-DA模型，圖Ib為ESI負離子模式的OPLS-DA模型。三角形為0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪藻，方塊為無NaCl培養(yǎng)的對照雪藻，每個點表示一個樣品。圖2是0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl培養(yǎng)的雪地衣藻對照的OPLS-DA 模型驗證圖，圖加為ESI正離子模式的OPLS-DA模型驗證圖，圖2b為ESI負離子模式的 OPLS-DA模型驗證圖。黑色圓點表示用來塑造OPLS-DA的80%已知樣品；+符號表示用 OPLS-DA來預(yù)測的20%未知樣品，每個點表示一個樣品。圖3是s載荷圖和VIP值的結(jié)合圖，其中圖3a為ESI正離子模式下圖，圖北為 ESI負離子模式下圖。每個點表示一個質(zhì)譜檢測到的離子，空白三角形表示變量載荷投影值的置信水平，黑色三角形表示變量投影的重要因子(VIP)值。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1發(fā)現(xiàn)和鑒定雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)適應(yīng)NaCl脅迫環(huán)境的脂質(zhì)生物標志物1、雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)培養(yǎng)和收獲雪地衣藻在培養(yǎng)6天后，添加已滅菌的NaCl溶液，使終濃度達到0.5% (w/v) 0繼續(xù)培養(yǎng)Oh、IhJhU^i即取樣，每個時刻設(shè)置四個平行樣。藻液離心(5000r/min，5min)，去上清，藻泥用純凈水洗滌三次后置于超低溫冰箱中預(yù)凍后，冷凍干燥得藻粉。2、細胞脂質(zhì)化合物的提取藻粉用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取。先在2.5ml的甲醇-三氯甲烷-水 (1/1/0.5, ν/ν/ν)提取溶液中加入0.025 % (w/v, g/ml)抗氧化劑BHT，然后準確稱取 10. Omg的藻粉，加入提取液，用振蕩器震5min后，在10°C和5500rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin后，取下層溶液，用氮氣吹干，再用0. 8ml色譜甲醇溶解后用于UPLC-Q-T0F/MS分析。3、脂代謝譜的UPLC-Q-T0F/MS分析液相分析采用美國Waters公司Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)(UPLC)；色譜柱采用BEH C18柱(2. ImmX 50mm, 1.7 μ m)；流動相A為水/異丙醇70/30 (含0· 甲酸)；流動相B為乙腈/異丙醇70/30 (含0. 1 %甲酸)；流速為0. 4ml/min ；進樣量為1 μ 1 ；柱溫 40°C，樣品室溫度4°C。正離子模式下，流動相洗脫程序為初始A B比例為(50 50)， IminA B 比例為(15 85)，l_5min A B 比例為(15 85)，9min A B 比例為(0 100)， 9-14min A B 比例為(0 100)，15minA B 比例為(50 50)，15_17minA B 比例為 (50 50)；負離子模式下，流動相洗脫程序為初始A B比例為(60 40), 2min A B比例為(20 80)，2-7min A B 比例為(20 80)，9min A B 比例為(0 100)，9_14min A B 比例為(0 100)，15min A B 比例為(50 50)，15_17min A B 比例為(50 50)。質(zhì)譜分析采用美國Waters公司Micromass Q-TOF串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀， 配有電噴霧離子源(ESI)。質(zhì)譜分析過程分別采用ESI源正離子和負離子兩種模式進行檢測。正、負離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細管電壓為3000V，錐孔電壓為50V，離子源溫度為100°C，電噴霧氣(脫溶劑氣)溫度為350°C，電噴霧氣流量(脫溶劑氣流量)為6001/h， 錐孔氣流量為601/h，數(shù)據(jù)采集范圍在lOO-lOOOm/z。4、OPLS-DA 分析用Markerlynx將得到的總離子流圖進行峰提取、峰匹配。提取后的數(shù)據(jù)，進行歸一化處理，再將數(shù)據(jù)導入到Simca-p中進行Pareto標尺化處理，然后再進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。用OPLS-DA方法對0. 5% NaCl脅迫培養(yǎng)的雪地衣藻和無NaCl脅迫的對照雪地衣藻的數(shù)據(jù)進行建模，結(jié)果如圖1所示。據(jù)此建立的ESI正離子模式的OPLS-DA 模型(圖la)可以解釋98. 2%的分類信息，并且模型的預(yù)測能力達到91. 2%;ESI負離子模式的OPLS-DA模型(圖lb)可以解釋99. 4%的分類信息，并且模型的預(yù)測能力達到86. 2%0 圖1中，X軸方向(線性第一主成分)體現(xiàn)了組間差異，即鹽濃度對雪藻脂代謝譜的差異性影響；Y軸方向(正交第一主成分)體現(xiàn)了組內(nèi)差異，即同一鹽濃度，不同脅迫時間(lh，7h， 15h)對雪藻脂代謝譜的差異性影響。從圖1中可以看出，0. 5% NaCl脅迫的雪地衣藻和無 NaCl脅迫的對照雪地衣藻的脂代謝譜有比較顯著的區(qū)別，在圖中橫坐標方向上有明顯的分類；對同一鹽濃度、不同脅迫時間的樣品無明顯的分類。5、OPLS-DA 模型驗證隨機抽取由Markerlynx提取的80 %數(shù)據(jù)作為訓練集建立OPLS-DA模型，剩下 20%數(shù)據(jù)作為預(yù)測集導入到所建立的模型中來評價模型的準確性。由圖加和圖2b，可以看出，兩種模式所建立的模型都能正確預(yù)測未知數(shù)據(jù)的分類，故表明所建的模型未發(fā)生過擬合，是穩(wěn)健的。6、潛在脂質(zhì)生物標志物的篩選圖3a和圖北分別表示了正、負離子模式下變量的s載荷圖和VIP值的結(jié)合圖。分別在兩個圖中篩選出變量重要因子(VIP)值> 1，同時在S載荷圖中載荷投影值置信水平 (|p(corr) ) > 0.6的化合物作為雪地衣藻適應(yīng)0. 5% NaCl的潛在脂質(zhì)生物標志物，并對潛在標志物進行結(jié)構(gòu)鑒定。7、標志物的結(jié)構(gòu)鑒定
結(jié)構(gòu)鑒定的主要依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、可能元素組成 (< IOppm)、一級質(zhì)譜母離子的保留時間以及二級質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子片斷的分析而得到。表1給出了正離子模式下鑒定的14種脂質(zhì)生物標志物，表2給出了負離子模式下鑒定的7種脂質(zhì)生物標志物。它們是甜菜堿-1，2-二?；视?0-4 ‘ -(N，N，N-三甲基)高絲氨酸(DGTS，1， 2-diacylglyceryl-3-0-4‘ - (N, N, N-trimethyl)-homoserine)；單半乳糖二酰甘油酯(MGDG，Monogalactosyl-diacylglycerol)；雙半乳糖二酰甘油酯(DGDG，Digalactosyl-diacylglycerol)；磷脂酰乙醇胺(PE，Phosphatidylethanolamine)；磺酸基異鼠李糖基二脂酰基甘油(SQDG，sulfoquinovosyldiacylglycerol)；磷脂酰甘油(PG,Phosphatidylglycerol)；磷脂酰肌醇(PI，Phosphatidylinositiol)。表1正離子模式下鑒定的14種脂質(zhì)生物標志物
權(quán)利要求
1.發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法，其特征包括下述步驟(1)單細胞藻類細胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護；(2)用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx軟件提取分析數(shù)據(jù)并導入到 Simca-p軟件中進行正交偏最小二乘判別分析；(4)對正交偏最小二乘判別模型進行驗證； (5)由正交偏最小二乘判別模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標志物；(6)對潛在脂質(zhì)生物標志物進行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(1)用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取單細胞藻類細胞內(nèi)脂質(zhì)化合物，提取液中加入抗氧化劑2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚，提取液中甲醇、三氯甲烷、水的體積比為1:1:0.5，抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚與提取液的質(zhì)量體積比為0.01%-0.05% g/ml ；樣品與提取液混合后，用振蕩器震蕩5-lOmin后，在 4-10°C下離心后取下層溶液，用氮氣吹干，再用0. 5-lml色譜甲醇溶解；所述樣品為單細胞藻粉。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)中采用超高效液相色譜與四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀分析脂質(zhì)化合物，超高效液相色譜方法中，流動相A為水、異丙醇和甲酸的混合液，其中水、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動相A的0. 1% (ν/ v);流動相B為乙腈、異丙醇和甲酸的混合液，其中乙腈、異丙醇的體積比為95/5 70/30，甲酸的含量始終為流動相B的0. 1% (ν/ν)；色譜柱溫為35°C -40°C，樣品室溫為4°C -10°C, 流速為0. 3-0. 4 ml/min,進樣體積為1-5 μ 1。
4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于質(zhì)譜分析過程分別采用電噴霧離子源正離子和負離子兩種模式進行檢測；正、負離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)如下毛細管電壓為 ^00V-3000V，錐孔電壓為40-60V，離子源溫度為95_105°C，電噴霧氣溫度為340_360°C，電噴霧氣流量為580-6201/h，錐孔氣流量為58-621/h，數(shù)據(jù)采集范圍在lOO-lOOOm/z。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(3)用Markerlynx提取步驟(2)由超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀所采集到的數(shù)據(jù)，并將提取的數(shù)據(jù)進行歸一化處理，再導入到Simca-p軟件中進行Pareto標尺化處理，然后經(jīng)Pareto標尺化后的數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析。
6.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(4)對正交偏最小二乘判別模型進行驗證， 驗證方法為隨機抽取80%由Markerlynx所提取的數(shù)據(jù)建立正交偏最小二乘判別模型，由該模型來預(yù)測剩下20%數(shù)據(jù)的分類情況。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于由步驟(5)正交偏最小二乘判別分析的結(jié)果即變量重要因子值和s載荷圖，篩選出潛在的脂質(zhì)生物標志物；其中，變量重要因子值大于1， 同時在s載荷圖中縱坐標的絕對值即變量投影置信水平大于0. 6的化合物作為潛在的脂質(zhì)生物標志物。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(6)對潛在脂質(zhì)生物標志物進行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定，其依據(jù)是Masslynx軟件給出的精確分子量、元素組成、一級質(zhì)譜母離子的保留時間以及二級質(zhì)譜特征碎片離子分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的方法，包括下述步驟(1)細胞內(nèi)脂質(zhì)化合物的提取和抗氧化保護；(2)超高效液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)分析提取脂質(zhì)化合物；(3)用Markerlynx提取分析數(shù)據(jù)并導入到Simca-p軟件中進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)；(4)對OPLS-DA模型進行驗證(5)由OPLS-DA模型的結(jié)果篩選出潛在脂質(zhì)生物標志物；(6)對潛在脂質(zhì)生物標志物進行結(jié)構(gòu)推斷和鑒定。本發(fā)明所建立的發(fā)現(xiàn)和鑒定單細胞藻類脂質(zhì)生物標志物的通用技術(shù)體系，可輻射應(yīng)用到植物和微生物代謝組學分析、食品安全代謝組學分析等領(lǐng)域。
文檔編號G01N30/72GK102262139SQ20111010859
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者呂娜, 魏東 申請人:華南理工大學