專利名稱：一種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)ii傳能的sgb緩沖液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藻類生物技術領域，涉及ー種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II反應中心傳能的SGB緩沖液。
背景技術：
藍藻是一類能進行光合放氧的原核生物，也是研究光合作用的模式生物之一。電子顯微鏡的觀察結果顯示在藍藻細胞類囊體膜上排列著數量眾多的小顆?！迥戵w， 其主要功能是捕獲光能。因此，藻膽體是藍藻細胞吸收光能，并傳遞至光系統(tǒng)反應中心的主要入口。正常條件下，藍藻藻膽體與光系統(tǒng)II連結，把吸收的光能傳遞到光系統(tǒng)II反應中心。由于藻膽體具有親水的屬性，因此在分離藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體時常常導致藻膽體從光系統(tǒng)II反應中心表面上脫落下來；即使部分保留的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體，也幾乎失去了能量傳遞(從藻膽體向光系統(tǒng)II)的生物學功能。盡管人們能夠單獨地在體外分離出完整的藻膽體(中國專利CN1654629A—種完整藻膽體的制備方法)和光系統(tǒng)II復合體，然而至今尚未見有分離出完整的、且具備高效能量傳遞功能的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體。眾所周知，合適的緩沖液是體外有效分離功能蛋白復合體所必須。目前，常規(guī)用于分離藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的緩沖液是SPC (Sucrose/phosphate/citrate) 但遺憾的是該緩沖液分離出的藻膽體_光系統(tǒng)II超分子復合體不具備高效傳遞光能的屬性。因此，為了分離出具有高效傳能的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體，必須開發(fā)出適宜分離該超分子復合體的新型緩沖液。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出ー種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，這ー緩沖液的應用不僅能增加藻膽體與光系統(tǒng)II間的連接數量，而且能大大改善體外藻膽體向光系統(tǒng)II反應中心的傳能效率。本發(fā)明采取的技術方案如下—種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，包括以下組分O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸鹽，O. 2-0. 4M檸檬酸鹽和O. 5-1. 2M甜菜堿，優(yōu)選O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿。所述磷酸鹽為磷酸ニ氫鉀、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀和磷酸氫ニ鈉中的一種或兩種以上的混合物。所述檸檬酸鹽為檸檬酸三鈉和檸檬酸三鉀中的ー種或兩種的混合物。檸檬酸鹽有利于藻膽體向光系統(tǒng)II復合體的能量傳遞。進ー步，可用堿將上述SGB緩沖液pH調節(jié)至7.0，所述堿優(yōu)選NaOH。這樣可以更好地維持體外藻膽體和光系統(tǒng)II等功能復合體的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供ー種藍藻藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體的制備方法，包括以下步驟(I)將收集的藍藻細胞重懸于上述SGB緩沖液中進行破碎，破碎時間為100-500S，每次10-20s，間隔5min ；(2)在4°C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類囊體膜的混合物；(3)用去垢劑對藻膽體和類囊體膜的混合物進行增溶，然后用蔗糖密度梯度離心，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體。所述去垢劑為體積百分比濃度為1%的Triton X-100。所述破碎和增溶在冰浴((TC )條件下進行。本發(fā)明的SGB緩沖液與常規(guī)SPC緩沖液相比，不僅能増加藻膽體與光系統(tǒng)11間的連接數量，而且能大大改善體外藻膽體向光系統(tǒng)II的能量傳遞效率。因此，本發(fā)明將有助 于人們從生物化學、生物物理學和結構生物學等水平上研究藻膽體和光系統(tǒng)II間的相互關系，從而大幅度提高藻類光合效率和生物量，為藻類能源化利用提供理論基礎。


圖I是本發(fā)明實施例I和實施例2中所得藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的低溫熒光發(fā)射光譜。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進ー步說明，其目的在于更好地理解本發(fā)明的研究內容而非限制本發(fā)明的保護范圍實施例I(I)將5g收集的藍藻細胞(A73tl=L 0-1. 2)分別重懸于15mLSPC、SGB緩沖液中，用Bead-beater (Biospec,日本)在冰浴中進行破碎，破碎時間為100s,姆次IOs,間隔5min ；SPC緩沖液含有O. 5M蔗糖，O. 5M磷酸鹽和O. 3M檸檬酸鹽，而SGB緩沖液含有O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿，pH為7. O。(2)在4° C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類囊體膜的混合物；(3)用lmLl% (V/V)去垢劑Triton X-100對藻膽體和類囊體膜的混合物進行增溶(冰浴中孵育lOmin)，然后用蔗糖密度梯度離心(4° C、150，000Xg條件下離心17h ;CP100WX,日立，日本)，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體，用蛋白免疫印跡和低溫(77K)熒光(F4500，日立，日本)等方法分別檢測所獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體的數量和能量傳遞效率。檢測結果與常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液増加了約2. I倍藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的數量(從該超分子復合體的條帶強度和蛋白免疫印跡的條帶密度進行判斷，下同)。圖I中，曲線I為本實施例中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的77K低溫熒光發(fā)射光譜，曲線2為本實施例中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的77K低溫熒光發(fā)射光譜?？梢钥闯觯c常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液提高了約2. 3倍藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II的能量傳遞效率。
實施例2步驟(I)與實施例I的不同之處在于破碎時間為500s,姆次20s,間_ 5min ;步驟(2)和(3)與實施例I相同。檢測結果常規(guī)SPC緩沖液分離出藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的數量不到實施例I的三分之一，而本發(fā)明SGB緩沖液分尚出藻膽體_光系統(tǒng)II超分子復合體的數量與實施例I類似。
曲線4為本實施例中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的77K低溫熒光發(fā)射光譜，可以看出，其能量傳遞效率不到實施例I中用SPC緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的三分之一；曲線3為本實施例中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的77K低溫熒光發(fā)射光譜，其能量傳遞效率僅略低于與實施例I中用SGB緩沖液獲得的藻膽體-光系統(tǒng)II超分子復合體的能連傳遞效率。以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應該局限于該實施例和附圖所公開的內容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護的范圍。
權利要求
1.ー種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，包括以下組分.O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸鹽，O. 2-0. 4M檸檬酸鹽和O. 5-1. 2M甜菜堿。
2.權利要求I所述的體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，包括以下組分0. 8M蔗糖，O. 5M磷酸鹽，O. 3M檸檬酸鹽和IM甜菜堿。
3.權利要求I或2所述的體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述磷酸鹽為磷酸ニ氫鉀、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀和磷酸氫ニ鈉中的一種或兩種以上的混合物。
4.權利要求I或2所述的體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述檸檬酸鹽為檸檬酸三鈉和檸檬酸三鉀中的ー種或兩種的混合物。
5.權利要求I或2所述的體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，用堿將所述SGB緩沖液pH調節(jié)至7. O。
6.權利要求5所述的體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，其特征在于，所述堿為NaOH。
7.—種藍藻藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將收集的藍藻細胞重懸于權利要求1-4任意一項所述的SGB緩沖液中進行破碎,破碎時間為100-500s，每次10-20s,間隔5min ； (2)在4°C、18，OOOXg條件下離心60min，獲得藻膽體和類囊體膜的混合物； (3)用去垢劑對藻膽體和類囊體膜的混合物進行增溶，然后用蔗糖密度梯度離心，從而獲得藻膽體-光系統(tǒng)II的超分子復合體。
8.權利要求7所述的藍藻藻膽體光系統(tǒng)II的超分子復合體的制備方法，其特征在干，所述去垢劑體積百分比濃度為1%的Triton X-100。
9.權利要求7所述的藍藻藻膽體光系統(tǒng)II的超分子復合體的制備方法，其特征在干，所述破碎和增溶在冰浴條件下進行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外高效提高藍藻藻膽體向光系統(tǒng)II傳能的SGB緩沖液，由以下組分組成0.6-0.9M蔗糖，0.4-0.6M磷酸鹽，0.2-0.4M檸檬酸鹽和0.5-1.2M甜菜堿。與常規(guī)SPC緩沖液相比，本發(fā)明SGB緩沖液不僅增加了藻膽體與光系統(tǒng)II間的連接數量，而且大大改善了體外藻膽體向光系統(tǒng)II反應中心的傳能效率；本發(fā)明將有助于人們從生物化學、生物物理學和結構生物學等水平上研究藻膽體和光系統(tǒng)II間的相互關系，從而大幅度提高藻類光合效率和生物量，為藻類能源化利用提供理論基礎。
文檔編號C12N1/06GK102660463SQ201210142640
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權日2012年5月9日
發(fā)明者王全喜, 陳李萍, 馬為民, 馬宇恒, 高復旦, 魏蘭珍 申請人:上海師范大學