專利名稱：檢測(cè)抗-tnf藥物和自身抗體的試驗(yàn)的制作方法
檢測(cè)抗-TNF藥物和自身抗體的試驗(yàn)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年10月26日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/255，048，2009年11月19日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/262，877，2010年4月15日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/324，635，2010年5月17日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/345，567，2010年6月3日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/351，269，2010年10月4日遞交的美國(guó) 臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/389，672和2010年10月15日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/393，581的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
背景技術(shù)：
自身免疫疾病是重要和廣泛傳播的醫(yī)學(xué)難題。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種影響到200萬以上美國(guó)人的自身免疫疾病。RA引起關(guān)節(jié)慢性炎癥且通常為進(jìn)行性疾病，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能殘疾。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因未知，但該病的病因?qū)W涉及遺傳傾向、傳染因子和環(huán)境因素?；钴S性RA的癥狀包括疲勞、缺乏食欲、低燒、肌肉關(guān)節(jié)疼痛和僵硬。還有在該病突發(fā)過程中，由于滑膜炎癥，關(guān)節(jié)經(jīng)常紅腫、疼痛和觸痛。此外，由于RA是全身性疾病，炎癥可能影響關(guān)節(jié)以外的機(jī)體器官和區(qū)域，包括眼睛和口腔的腺體、肺襯膜、心包膜和血管。處理RA和其他自身免疫疾病的傳統(tǒng)療法包括采用作用快速的“第一線藥物”和作用較慢的“第二線藥物”。第一線藥物能減輕疼痛和炎癥。這類第一線藥物的示例包括可口服給藥或直接注射入組織和關(guān)節(jié)的阿斯匹林、萘普生、布洛芬、依托度酸和其他非類固醇消炎藥(NSAID)，以及皮質(zhì)激素。第二線藥物能促進(jìn)疾病緩解，防止關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞，也稱為改良疾病抗類風(fēng)濕藥物或DMARD。第二線藥物的示例包括金、氫化氯奎、柳氮磺吡啶，和免疫抑制劑，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和環(huán)孢霉素。然而，這些藥物中的許多有有害的副作用。因此，已在尋找對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫失調(diào)的其他療法。腫瘤壞死因子-α (TNF-α)是由許多細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，起初是根據(jù)它能誘導(dǎo)某些小鼠腫瘤壞死而鑒定。后來，與惡病質(zhì)有關(guān)的稱為惡液質(zhì)的因子顯示與TNF-a相同。TNF-a在病理生理學(xué)上涉及到多種其他人類疾病和失調(diào)，包括休克、敗血癥、感染、自身免疫病、RA、克羅恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病。由于人TNF-a (hTNF- a )在多種人類失調(diào)中起有害作用，已設(shè)計(jì)了治療策略來抑制或?qū)筯TNF-a的活性。具體說，已尋找到能抑制和中和hTNF-a活性的抗體，作為抑制hTNF- a的工具。一些最早的這類抗體是用hTNF-a免疫小鼠的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤所分泌的小鼠單克隆抗體(mAb)(參見Moeller等人的美國(guó)專利號(hào)5，231，024)。雖然這些小鼠抗-hTNF-a抗體常常顯示對(duì)hTNF-a有高親和力能中和hTNF-a的活性，但小鼠抗體給予人所產(chǎn)生的相關(guān)問題，如血清半衰期短、不能觸發(fā)人類某些效應(yīng)器的功能和在人體中引發(fā)產(chǎn)生抗小鼠抗體的不良免疫應(yīng)答(“人抗-小鼠抗體”(HAMA)反應(yīng))限制了其體內(nèi)應(yīng)用。近年來，已采用生物學(xué)療法來治療自身免疫疾失調(diào)如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。例如，四種TNF- a抑制劑嵌合性抗-TNF- a mAb REMICADE (英夫利昔單抗)，TNFR-IgFc融合蛋白ENBREL (依那西普)，人抗-TNF a mAb HUMIRA (阿達(dá)木單抗)和PEG化(PEGylated)的Fab片段一CMZIA (賽妥珠單抗)已經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。CMZIA 也用于治療中等至嚴(yán)重的克羅恩病(CD)。雖然已證明這些生物治療劑能成功地治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫疾病如CD，但不是所有的治療對(duì)象對(duì)這種治療有反應(yīng)或反應(yīng)良好。而且，給予TNF- α抑制劑可能會(huì)誘導(dǎo)對(duì)該藥物的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生自身抗體，如人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。這類HACA、HAHA或HAMA免疫應(yīng)答可能與免疫治療TNF-α抑制劑的超敏反應(yīng)和藥代動(dòng)力學(xué)顯著改變和生物擾亂相關(guān)，阻礙了用該類藥物作進(jìn)一步治療。因此，本領(lǐng)域需要檢測(cè)患者樣品中存在抗-TNF-α生物制劑和/或其自身抗體的試驗(yàn)，以監(jiān)視TNF-α抑制劑的治療效果和指導(dǎo)治療決策。本發(fā)明滿足了這種需求并提供相關(guān)的效益。發(fā)明概述已證明TNF-α涉及炎癥疾病，自身免疫疾病，病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，惡性腫瘤和/或神經(jīng)變性疾病，它是采用特異性生物學(xué)方法治療疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和克羅恩病的有用靶標(biāo)。TNF-α抑制劑，如抗-TNFa抗體是一類重要的治療劑。因此，需要檢測(cè)存在 抗-TNF α生物制劑和/或及自身抗體的試驗(yàn)方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物的樣品接觸，形成含抗-TNF α藥物的標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)，(其中標(biāo)記TNF α和抗-TNF α藥物彼此不共價(jià)結(jié)合)；(b)標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以(如從游離的標(biāo)記TNFa中)分離標(biāo)記的復(fù)合物；和(C)檢測(cè)標(biāo)記的復(fù)合物，從而檢測(cè)抗-TNFa藥物的存在或水平。在某些情況下，所述方法可用于檢測(cè)例如接受抗-TNF α藥物治療對(duì)象的樣品中REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)和CMZIA (賽妥珠單抗)的水平。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸，形成含自身抗體的標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)，(其中標(biāo)記抗-TNFa藥物與自身抗體彼此不共價(jià)結(jié)合)；(b)標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以(如從游離的標(biāo)記TNF α藥物中)分離標(biāo)記的復(fù)合物；和(C)檢測(cè)標(biāo)記的復(fù)合物，從而檢測(cè)自身抗體的存在或水平。在某些情況下，所述方法可用于檢測(cè)例如接受抗-TNF α藥物治療對(duì)象樣品中的自身抗體水平，包括但不限于人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸，在標(biāo)記抗-TNFa藥物、標(biāo)記TNFa與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)；(其中第一標(biāo)記復(fù)合物的組分彼此不共價(jià)結(jié)合)和在標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體之間形成第二標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)，(其中第二標(biāo)記復(fù)合物的組分彼此不共價(jià)結(jié)合)，其中標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記TNF α所含的標(biāo)記不相同；(b)第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析，以分離第一標(biāo)記復(fù)合物與第二標(biāo)記復(fù)合物(例如彼此分離，和與游離的標(biāo)記TNF α和游離的標(biāo)記抗-TNF a藥物分離);和(C)檢測(cè)第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物，從而當(dāng)?shù)谝粯?biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物都存在時(shí)，檢測(cè)非中和形式自身抗體(即不干擾抗-TNFa藥物與TNFa之間結(jié)合的自身抗體)的存在或水平；當(dāng)只存在第二標(biāo)記復(fù)合物時(shí)，檢測(cè)中和形式自身抗體(即干擾 抗-TNF α藥物與TNF α之間結(jié)合的自身抗體)的存在或水平。在某些情況下，所述方法可用于檢測(cè)接受抗-TNF α藥物治療對(duì)象樣品中的自身抗體水平，包括但不限于人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸，在標(biāo)記抗-TNFa藥物與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)(其中標(biāo)記抗-TNFa藥物與自身抗體彼此不共價(jià)結(jié)合)；(b)第一標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析，以(如從游離的標(biāo)記抗-TNFa藥物中)分離第一標(biāo)記復(fù)合物；(C)檢測(cè)第一標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)存在的自身抗體或其水平；(d)使標(biāo)記TNF α與第一標(biāo)記復(fù)合物接觸，在標(biāo)記TNF α藥物與標(biāo)記TNF α之間形成第二標(biāo)記復(fù)合物(即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物)(其中標(biāo)記抗-TNF α藥物與標(biāo)記TNF α彼此不共價(jià)結(jié)合)，其中標(biāo)記TNF α藥物與標(biāo)記TNFa所含的標(biāo)記不相同；(e)第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行第二分子大小排阻層析，以(如從游離的標(biāo)記TNF α中)分離第二標(biāo)記復(fù)合物；和(f)檢測(cè)第二標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)中和形式的自身抗體(即干擾抗-TNF α藥物與TNF- α之間結(jié)合的自身抗體)的存在或水平。在某些情況下，所述方法可用于檢測(cè)接受抗-TNF α藥物治療對(duì)象樣品中的自身抗體的水平，包括但不限于人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供確定抗-TNF α藥物有效量的方法，所述方法包括(a)測(cè)量對(duì)象第一樣品中的抗-TNF α藥物水平，包括(i)使第一樣品接觸一定量的標(biāo)記TNF α，形成含標(biāo)記TNF α與抗-TNF α藥物的第一復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第一復(fù)合物，從而測(cè)量抗-TNF α藥物的水平；
(b)測(cè)量所述對(duì)象第二樣品中抗-TNF α藥物自身抗體的水平，包括⑴使第二樣品接觸一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物，形成含標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體的第二復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第二復(fù)合物，從而檢測(cè)自身抗體的水平；和(c)從步驟(a)測(cè)得的抗-TNFa藥物水平減去步驟(b)測(cè)得的自身抗體水平，從而測(cè)得抗-TNF α藥物的有效量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNF α藥物治療劑量的方法,所述方法包括(a)按照本發(fā)明方法測(cè)定抗-TNF α藥物的有效量；(b)比較抗-TNF α藥物的有效量與抗-TNF α藥物的水平；和(c)根據(jù)步驟(b)的比較，確定抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNF α藥物治療和/或減輕其毒性的方法，所述方法包括(a)測(cè)定所述對(duì)象第一樣品中的抗-TNFa藥物水平；(b)測(cè)定所述對(duì)象第二樣品中抗-TNF α藥物自身抗體的水平；和(c)根據(jù)抗-TNFa藥物和自身抗體水平，確定所述對(duì)象的后續(xù)療程，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療和/或減輕其毒性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有抗-TNFa藥物的樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的標(biāo)記TNF α和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照接觸樣品，形成標(biāo)記TNF α與抗-TNFa藥物的復(fù)合物；
(b)用分子大小排阻層析檢測(cè)標(biāo)記TNF α和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(c)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記TNF α峰曲線下面積的積分；(d)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分；(e)用標(biāo)記TNFa的量除以標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照的量確定第一比率；(f)用步驟(c)測(cè)得的積分除以步驟(d)測(cè)得的積分確定第二比率；和(g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而參比內(nèi)部對(duì)照確定抗-TNF α藥物的存在或水平在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNF α藥物治療劑量的方法，所述方法包括根據(jù)上面章節(jié)步驟(e)的標(biāo)記TNF α與標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照比率和上面章節(jié)步驟(f)的標(biāo)記TNFa與標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照比率的比較，確定所述對(duì)象抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有自身抗體的樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照與樣品接觸,形成標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體的復(fù)合物；
(b)用分子大小排阻層析檢測(cè)標(biāo)記抗-TNF α和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(c)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖計(jì)算標(biāo)記抗-TNFa藥物峰曲線下面積的積分；(d)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖計(jì)算標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分；(e)將標(biāo)記抗-TNFa藥物含量除以標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照含量，測(cè)得第一比率；和(f)除以步驟(C)和⑷所得的積分，測(cè)得第二比率；和(g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而參比內(nèi)部對(duì)照確定自身抗體的存在或水平。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供測(cè)定樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平，和 抗-TNF α藥物自身抗體的存在或水平的試劑盒，該試劑盒包括(a)含一定量的標(biāo)記TNFa的第一檢測(cè)底物；(b)含一定量的標(biāo)記抗-TNF α的第二檢測(cè)底物；(c)任選的第三檢測(cè)底物，其含一定量的標(biāo)記TNFa和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(d)任選的第四檢測(cè)底物，其含一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物α和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(e)任選的提取對(duì)象樣品的工具；和(f)任選的使用該試劑盒的說明書小冊(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀以下詳述和
將會(huì)明白本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)要說明圖I.顯示本發(fā)明試驗(yàn)的示例實(shí)施方式，其中采用分子大小排阻HPLC來檢測(cè)TNF a -Alexa647 與 HUMIRA 之間的結(jié)合。圖2.顯示HUMIRA 與TNF a -Alexa647結(jié)合的劑量響應(yīng)曲線圖3.顯示目前檢測(cè)HACA水平的基于ELISA的方法，稱為橋連試驗(yàn)。圖4.本發(fā)明檢測(cè)產(chǎn)生的抗REMICADE 的HACA/HAHA自身抗體試驗(yàn)的示例概要圖解說明。圖5.顯示結(jié)合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗體的劑量響應(yīng)分析。圖6.顯示結(jié)合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗體的第二劑量響應(yīng)分析。圖7.顯示結(jié)合REMICADE -Alexa647的抗-人IgG抗體的劑量響應(yīng)曲線。圖8.顯示正常人血清和HACA陽性血清中形成的REMICADE -Alexa647免疫復(fù)合物。圖9.提供用本發(fā)明的橋連試驗(yàn)或遷移改變?cè)囼?yàn)(mobility shift assay),檢測(cè)20位患者血清樣品HACA的概況。圖10.提供用目前檢測(cè)HACA血清濃度的方法與本發(fā)明新穎HACA試驗(yàn)方法的概況和比較。圖11.顯示熒光(Fl)標(biāo)記的IFX與正常(NHS)或HACA-陽性血清孵育的SE-HPLC圖。在孵育的混合液中加入遞增量的HACA-陽性血清導(dǎo)致IFX-Fl峰以劑量依賴方式轉(zhuǎn)移到更高分子量的洗脫位置Cl和C2。圖12.顯示用遷移改變?cè)囼?yàn)測(cè)定的，隨著HACA-陽性血清的稀釋度增加所產(chǎn)生的結(jié)合和游離的IFX-Fl的劑量響應(yīng)曲線。(A)稀釋度遞增的HACA-陽性血清與37. 5ng的IFX-Fl 一起孵育。SE-HPLC分析發(fā)現(xiàn)，稀釋度越高(HACA越低)，游離的IFX-Fl越多。(B)稀釋度遞增的HACA-陽性血清與37. 5ng的IFX-Fl —起孵育。SE-HPLC分析發(fā)現(xiàn)稀釋度越高(HACA越低)，HACA所結(jié)合的IFX-Fl越少。圖13.顯示TNF a -Fl與正常(NHS)或摻入IFX的血清一起孵育的SE-HPLC圖。在孵育混合液中加入遞增量的IFX的血清導(dǎo)致熒光TNF α峰以劑量依賴方式轉(zhuǎn)移到更高分子量的洗脫位置。圖14.顯示用遷移改變?cè)囼?yàn)測(cè)定的，隨著摻入IFX的血清的稀釋度增加所產(chǎn)生的結(jié)合和游離的TNFa的劑量響應(yīng)曲線。將遞增濃度的IFX加到孵育混合液中降低了游離的TNFa的百分比同時(shí)提高了結(jié)合的TNFa的百分比。
圖15.顯示在不同時(shí)間點(diǎn)以遷移改變?cè)囼?yàn)測(cè)定的，用IFX治療的IBD患者血清的相對(duì)HACA水平和IFX濃度。圖16.顯示患者的處理-在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)用IFX治療的IBD患者血清的HACA水平和IFX濃度。圖17.顯示本發(fā)明檢測(cè)⑷非中和抗體或⑶中和抗體，如HACA的存在的試驗(yàn)的示例實(shí)施方式。圖18.顯示本發(fā)明檢測(cè)中和性自身抗體如HACA的存在的試驗(yàn)的一種替代實(shí)施方式。圖19.顯示在存在不同含量抗人-IgG時(shí)Fl-標(biāo)記的ADL與正常人血清(NHS) —起孵育后的遷移改變圖。在孵育混合液中加入遞增量的抗-人IgG，導(dǎo)致游離的Fl-ADL峰(FA)以劑量依賴方式轉(zhuǎn)移到更高分子量的洗脫位置Cl和C2，而內(nèi)部對(duì)照(IC)位置不變。圖20.顯示抗-人IgG對(duì)游離Fl-ADL的遷移的劑量響應(yīng)曲線。取遞增量的抗-人IgG與37. 5ng的Fl-ADL和內(nèi)部對(duì)照一起孵育。反應(yīng)混合液中加入的該抗體越多，游離的FI-ADL與內(nèi)部對(duì)照的比例越低。圖21.顯示在存在不同含量ADL時(shí)，F(xiàn)l-標(biāo)記TNF-α與正常人血清(NHS) —起孵育后的遷移改變圖。Ex = 494nm ；Em = 519nm。在孵育混合液中加入遞增量的ADL，導(dǎo)致游離的TNF-Fl峰(Fl)以劑量依賴方式轉(zhuǎn)移到更高分子量的洗脫位置，而內(nèi)部對(duì)照(IC)峰位置不變。圖22.顯示ADL對(duì)游離的TNF-a-Fl遷移的劑量響應(yīng)曲線。遞增量的ADL與IOOng的TNF- a -Fl和內(nèi)部對(duì)照一起孵育。反應(yīng)混合液中加入的抗體ADL越多，游離的TNF- a -Fl與內(nèi)部對(duì)照的比例越低。圖23.顯示Fl標(biāo)記的Remicade (IFX)與正常(NHS)或HACA陽性患者混合血清孵育后的遷移改變分布。圖24.顯示Fl標(biāo)記的HUMIRA(ADL)與正常(NHS)或小鼠抗-人IgG抗體孵育后的遷移改變分布。圖25.顯示Fl標(biāo)記的HUMIRA (ADL)與正常(NHS)或HACA陽性患者混合血清孵育后的遷移改變概況。發(fā)明詳述I.引言
本發(fā)明部分根據(jù)以下發(fā)現(xiàn)采用分子大小排阻層析的同質(zhì)遷移改變?cè)囼?yàn)特別有利于檢測(cè)TNF α抑制劑以及針對(duì)它們所產(chǎn)生的自身抗體(如HACA、HAHA等)的存在或水平。具體說，本發(fā)明提供不需要任何洗滌步驟的“混和與讀取”試驗(yàn)。因此，易于彼此區(qū)分復(fù)雜的與不復(fù)雜的蛋白質(zhì)療法。此外，采用本發(fā)明的試驗(yàn)可最大程度減少游離藥物的任何可能的干擾。相反，檢測(cè)HACA或HAHA水平的經(jīng)典ELISA要到機(jī)體清除TNFa抑制劑后才能進(jìn)行，這可能要花費(fèi)多達(dá)3個(gè)月時(shí)間。而且，除了抗-TNFa抗體，本發(fā)明一般還可用于各種蛋白質(zhì)治療藥物。本發(fā)明的試驗(yàn)還具有其他優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)椴恍枰箍乖降焦腆w表面上從而可消除無關(guān)IgG的非特異性結(jié)合，可檢測(cè)親和力弱的抗體，和顯示靈敏度和特異性高于目前可用的檢測(cè)方法，如酶免疫試驗(yàn)。檢測(cè)抗-TNF α生物藥物以及其他免疫治療藥物血清濃度的重要性可從以下事實(shí)得到證明FDA要求在臨床試驗(yàn)期間進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和藥物耐受性(如免疫應(yīng)答)研究。還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)接受這些藥物治療的患者以確保他們得到正確的劑量，這種正確劑量使藥物不會(huì)被機(jī)體清除太快，患者不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該藥物的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明可用于 指導(dǎo)由于先前藥物失效而在不同的藥物之間的切換。II.定義本文所用的以下術(shù)語具有它們本身的含義，除非另有說明。本文所用的術(shù)語“抗-TNF α藥物”或“TNF α抑制劑”旨在包括通過例如抑制TNF a與其細(xì)胞表面受體相互作用、抑制TNFa蛋白的產(chǎn)生、抑制TNFa基因的表達(dá)、抑制細(xì)胞分泌TNF α、抑制TNF α受體的信號(hào)傳導(dǎo)、或可導(dǎo)致對(duì)象TNF α活性降低的任何其他手段能直接或間接抑制TNFa活性的試劑、包括蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、融合蛋白(如Ig融合蛋白或Fe融合蛋白)、多價(jià)結(jié)合蛋白(如DVDIg)、小分子TNF α拮抗劑和其相似的天然或非天然產(chǎn)生的分子和/或重組和/或工程改造形式。術(shù)語“抗-TNF α藥物”或“TNF α抑制劑”優(yōu)選包括能干擾TNF α活性的制劑。TNFa抑制劑的例子包括依那西普(ENBREL ，安進(jìn)公司(Amgen))、英夫利昔單抗(REMICADE ,強(qiáng)生公司(Johnson and Johnson))、人抗-TNF α單克隆抗體-阿達(dá)木單抗(D2E7/HUMIRA ,雅培公司(Abbott Laboratories))、賽妥珠單抗(CMZIA ,UCB公司)、CDP 571(克隆泰克(Celltech)公司)和CDP 870 (克隆泰克公司)以及能抑制TNF α活性的其他化合物，從而當(dāng)給予患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有TNF α活性受損的失調(diào)(如RA)的對(duì)象時(shí)能治療該失調(diào)。本文術(shù)語“預(yù)計(jì)對(duì)TNFa抑制劑的治療有反應(yīng)”意指評(píng)估用TNF α抑制劑治療對(duì)象可能有效或可能無效的可能性(如向?qū)ο筇峁┛珊饬康乃幮?。具體說，通常是在治療開始后觀察到對(duì)象出現(xiàn)治療有效的指標(biāo)(如有可衡量藥效的指標(biāo))時(shí)方能評(píng)估治療可能有效或無效。特別優(yōu)選的TNF α抑制劑是已得到FDA批準(zhǔn)用于治療TNF α介導(dǎo)的人類疾病或失調(diào)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或炎性腸病(IBD)的生物制劑，這類制劑包括阿達(dá)木單抗(HUMIRA )、英夫利昔單抗(REMICADE )、依那西普(ENBREL )和賽妥珠單抗(CIMZIA ，UCB公司)。術(shù)語“分子大小排阻層析”(SEC)意思包括依據(jù)分子的大小和/或流體動(dòng)力學(xué)體積分離溶液中的分子的層析方法?？蓪⑵鋺?yīng)用于大分子或高分子復(fù)合物，如蛋白質(zhì)及其偶聯(lián)物。通常采用水溶液來轉(zhuǎn)運(yùn)樣品使之通過層析柱，這種技術(shù)也稱為凝膠過濾層析。術(shù)語“復(fù)合物”，“免疫復(fù)合物”，“偶聯(lián)物”和“免疫偶聯(lián)物”包括但不限于TNF a結(jié)合(如通過非共價(jià)鍵)于抗-TNF α藥物，抗-TNF α藥物結(jié)合(如通過非共價(jià)鍵)于抗-TNFa藥物的自身抗體，和抗-TNF α藥物結(jié)合(如通過非共價(jià)鍵)于TNF α和抗-TNF a藥物的自身抗體二者。本文所用術(shù)語“標(biāo)記的”所修飾的物質(zhì)包括與經(jīng)驗(yàn)上可檢測(cè)的另一種分子或化學(xué)物偶聯(lián)的任何物質(zhì)、分子、蛋白質(zhì)、酶、抗體、抗體片段、細(xì)胞因子或相關(guān)物質(zhì)。適合用作標(biāo)記來標(biāo)記物質(zhì)的化學(xué)物包括但不限于突光染料，如Alexa Fluor 染料、Alexa Fluor 647染料、量子斑點(diǎn)、發(fā)光染料、發(fā)冷光染料和放射性核素，如1251。術(shù)語“有效量”包括能在需要的對(duì)象中達(dá)到治療效果的藥物劑量，以及物質(zhì)的生物可利用量。術(shù)語“生物可利用的”包括給藥劑量中有治療活性的組分(分?jǐn)?shù))。例如，用于治療病理生理學(xué)上涉及TNFa的疾病和失調(diào)，包括但不限于休克、敗血癥、感染、自身免疫病、RA、克羅恩病、移植物排斥和移植物抗宿主疾病的藥物有效量，可以是能防止或減輕一種或多種該疾病相關(guān)癥狀的用量。短語“曲線下面積”是數(shù)學(xué)術(shù)語，用于描述兩維圖像中一部分的積分。例如，在作為 些峰的積分，包括y軸最小值，如兩維圖像的基線圍繞的面積和兩維圖像本身圍繞的面積積分。同樣也可用計(jì)算公式曲線下面積=/ abf(x)dx來描述峰的積分，f(x)是兩維圖像的函數(shù)，變量“a”和“b”表示X-軸峰積分的界線。短語“熒光標(biāo)記的檢測(cè)”包括檢測(cè)熒光標(biāo)記物的工具。該檢測(cè)工具包括但不限于分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)、光度計(jì)，經(jīng)常與層析儀合用的檢測(cè)工具，例如但不限于分子大小排阻高效液相層析儀，例如但不限于Agilent-1200HPLC系統(tǒng)。括弧“[]”表示參見該括弧內(nèi)的物質(zhì)濃度。短語“最優(yōu)化的治療”包括最優(yōu)化劑量(如有效用量或水平)和/或特定治療類型的效果。例如，最優(yōu)化抗-TNFa藥物的劑量，包括增加或減少后續(xù)給予對(duì)象的抗-TNFa藥物的用量。在某些情況下，最優(yōu)化抗-TNF α藥物的類型包括改變給予的抗-TNF α藥物，從一種藥物換成不同的藥物(如不同的抗-TNFa藥物)。在某些其他情況下，最優(yōu)化治療包括同時(shí)給予一種劑量的抗-TNF α藥物(如增加、減少的劑量或與原先劑量相同的劑量)聯(lián)用免疫抑制藥物。術(shù)語“同時(shí)給藥”包括給予一種以上的活性制劑，從而一種活性制劑發(fā)揮生理效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間與第二種活性制劑發(fā)揮生理效應(yīng)的時(shí)間相重疊。術(shù)語“對(duì)象”、“患者”或“個(gè)體”通常指人，但是也指其他動(dòng)物，例如包括其他靈長(zhǎng)動(dòng)物、哨齒動(dòng)物、狗、貓、馬、羊、豬等。術(shù)語“治療方案”包括采用能減輕或預(yù)防TNFa介導(dǎo)疾病或失調(diào)的相關(guān)一種或多種癥狀的治療方法。該術(shù)語包括給予任何化合物、藥物、程序和/或治療方案，用于改善患TNF α介導(dǎo)疾病或失調(diào)個(gè)體的健康,包括本文所述的任何治療劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得,可根據(jù)抗-TNF α藥物和/或抗-TNF α藥物自身抗體的存在和濃度水平，改變療程或目前療程的劑量。術(shù)語“免疫抑制藥物”或“免疫抑制劑”包括能產(chǎn)生免疫抑制作用的任何物質(zhì)，例如通過照射或給予這類藥物，如抗代謝藥、抗淋巴血清、抗生素等可防止或減輕免疫應(yīng)答反應(yīng)。合適的免疫抑制藥物包括但不限于硫代嘌呤藥物，如硫唑嘌呤(AZA)及其代謝產(chǎn)物；抗代謝藥物，如氨甲喋呤(MTX)、西羅莫司(雷怕霉素)、坦西莫司、依維莫司、他克莫司(FK-506)、FK-778 ;抗-淋巴細(xì)胞抗體球蛋白、抗-胸腺細(xì)胞抗體球蛋白、抗-⑶3抗體、抗CD4抗體和抗體-毒素偶聯(lián)物、環(huán)孢霉素、霉酚酸酯、咪唑立賓一磷酸酯、蒿屬香豆素、乙酸格拉默及其代謝產(chǎn)物、藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物、前藥和組合。術(shù)語“硫代嘌呤藥物”包括硫唑嘌呤(AZA)、6_巰基嘌呤(6-MP)和其有治療作用的任何代謝產(chǎn)物，包括但不限于6_巰基鳥嘌呤(6-TG)、6-甲基巰嘌呤苷、6-硫代肌苷核苷酸(如6-硫代肌苷一磷酸鹽、6-硫代肌苷二磷酸鹽、6-t硫代肌苷三磷酸鹽)、6_硫代鳥嘌呤核苷酸(如6-硫代鳥苷一磷酸鹽、6-硫代鳥 苷二磷酸鹽、6-硫代鳥苷三磷酸鹽)、6_硫代黃苷核苷酸(如6-硫代黃苷一磷酸鹽、6-硫代黃苷奪磷酸鹽、6-硫代黃苷三磷酸鹽)、其衍生物、同類物和組合。術(shù)語“樣品”包括獲自個(gè)體的生物學(xué)標(biāo)本。適合本發(fā)明所用的樣品包括但不限于全血、血漿、血清、唾液、尿液、糞便、淚水、任何其他體液、組織樣品(如活檢)和其細(xì)胞提取物(如血液紅細(xì)胞提取物)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品是血清樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，可在分析前稀釋樣品，如血清樣品。在某些情況下，術(shù)語“樣品”包括但不限于血液、機(jī)體組織、血液的血清、淋巴液、淋巴結(jié)組織、脾組織、骨髓，或用這些組織的一種或多種衍生的富含免疫球蛋白的組分。在某些其他情況下，術(shù)語“樣品”包括血液的血清，或從血液血清或血液衍生的富含免疫球蛋白的組分。在某些情況下，術(shù)語“樣品”包括體液。III.實(shí)施方式的描述本發(fā)明方法的各步驟不需要以它們提出的特定順序?qū)嵤１绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得本發(fā)明方法步驟的其他順序包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物的樣品接觸，與抗-TNF α藥物形成標(biāo)記的復(fù)合物；(b)使標(biāo)記的復(fù)合物通過分子大小排阻層析以分離所述標(biāo)記復(fù)合物；和(C)檢測(cè)所述標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)抗-TNFa藥物。在某些情況下，所述方法尤其可用于以下的抗-TNFa抗體REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)和CIMZIA (賽妥珠單抗)。腫瘤壞死因子a (TNFa)是一種參與全身炎癥的細(xì)胞因子，是能激發(fā)急性反應(yīng)的一組細(xì)胞因子中的一個(gè)成員。在免疫細(xì)胞調(diào)控中TNFa起著重要作用。TNFa也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)炎癥和抑制腫瘤發(fā)生及病毒復(fù)制。TNFa制劑主要是長(zhǎng)212個(gè)氨基酸的II型跨膜蛋白，為穩(wěn)定的同質(zhì)三聚體。本文所用的術(shù)語“TNFa ”意指包括以17kDa分泌蛋白形式和26kDa膜結(jié)合形式存在的一種人細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性形式是17kDa分子的非共價(jià)結(jié)合三聚體。TNFa結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步描述可參見，例如Jones等人(1989)，Nature，338 :225-228。術(shù)語TNF α的意思包括人TNFa、重組的人TNFa (rhTNF a )或與人TNFa蛋白至少有約80%相同。人TNF a由35個(gè)氨基酸的胞漿結(jié)構(gòu)域、21個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)段和177個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)組成(Pennica, D等(1984)Nature 312 :724)。在ECD內(nèi)，人TNFa與恒河猴的氨基酸序列有97 %相同，與牛、犬、棉鼠、馬、貓、小鼠、豬和大鼠TNF α的氨基酸序列有71 % -92 %相同。可用標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)方法制備或購買其商品(R&D系統(tǒng)(R&DSystems)公司，產(chǎn)品分類號(hào)210-TA，明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)。在某些實(shí)施方式中，“TNFa ”是一種“抗原”，是能被抗-TNF α抗體結(jié)合的一種分子或該分子的一部分。TNF-α可含有一個(gè)或一個(gè)以上的表位。在某些情況下，TNFa以高選擇性方式與抗TNFa抗體反應(yīng)。優(yōu)選的能結(jié)合本發(fā)明抗-TNF α抗體、片段和區(qū)域的抗原包含SEQ ID NO :1中的至少5個(gè)氨基酸。在某些情況下，TNFa的長(zhǎng)度足夠包含TNF α的一個(gè)表位，從而能結(jié)合抗-TNF α抗體、其片段和區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，含有結(jié)合抗-TNF α抗體、其片段和區(qū)域的長(zhǎng)度足夠的表位的TNFa 長(zhǎng)度至少為 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、I10、I15、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220個(gè)氨基酸。在一種些實(shí)施方式中，所用的TNFa包含SEQ ID NO :1的77-233 殘基。在某些情況下，至少標(biāo)記TNF α可溶性部分，即SEQ ID NO 1的殘基77_233中的一個(gè)氨基酸。在某些情況下，采用胺反應(yīng)活性熒光團(tuán)衍生物。在大多數(shù)情況下，此胺反應(yīng)活性基團(tuán)是一種酰化試劑，與胺反應(yīng)時(shí)能形成羧酰胺、磺酰胺或硫脲。事實(shí)上所有蛋白質(zhì)都含有賴氨酸殘基，大多數(shù)的N-末端含有游離胺基，因此可用作標(biāo)記物的結(jié)合位點(diǎn)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記殘基77，所用的TNFa包含SEQ ID NO : I的77-233殘基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記許多伯胺基從而多重標(biāo)記TNF α。在某些情況下，不標(biāo)記TNF α的某一部分，即被抗體、其片段和區(qū)域識(shí)別的那部分。換言之，TNF α抗原的某些部分可提供為抗-TNF α抗體所識(shí)別的和/或與抗-TNF α抗體、其片段和可變區(qū)結(jié)合的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(topographical)表位或三維表位。優(yōu)選這些部分游離而用于結(jié)合，因此不被標(biāo)記。其包含SEQ ID NO 1的136-157和164-185殘基Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-IIe ;和Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-GIu-Thr-Pro-Glu-Gly.可利用各種可檢測(cè)的基團(tuán)標(biāo)記抗-TNFa藥物。TNFa或抗-TNF α藥物優(yōu)選用熒光團(tuán)或熒光染料標(biāo)記。適合用于本發(fā)明的示例熒光團(tuán)包括通過引用納入本文作參考的“分子探針目錄(Molecular Probes Catalogue) ”中所列的那些(參見R. Haugland的“焚光探針和標(biāo)記技術(shù)指南手冊(cè)(The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies) ”，第 10 版，分子探針(Molecular probes)公司(2005))。此類示例的焚光團(tuán)包括但不限于Alexa 焚光染料，如 Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor ⑧ 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、AlexaFluor CD 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750 和 / 或 Alexa Fluor 790，以及其他熒光團(tuán)，例如丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺)熒光素(5-IAF)、5-異硫氰酸熒光素 (FITC)、四甲基羅丹明5-(和6_)異硫氰酸鹽(TRITC)、6_丙烯酰-2-二甲基氨基萘(丙烯酉先丹(acrylodan))、7_硝基苯基-2-惡_1，3，-重氣-4-基氧化物(NBD-Cl)、漠化乙徒、焚光黃、5-羧基羅丹明6G氫氯化物、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、德克薩斯紅酰氯、B0DIPY 、萘甲叉胺磺酸酯(例如I-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-(對(duì)-二磺基甲苯基)萘-2-磺酸(TNS)等等)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光黃-磷酯酰乙醇胺、德克薩斯紅磷酯酰乙醇胺、德克薩斯紅-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷酯酰膽堿，芴基-磷酯酸膽喊、部花青540、I-(3-諷丙基)_4_[ β-[2 [(二 -正-丁基氨基)-6萘基]乙烯基]批唳甜菜堿(萘基苯乙烯基)、3，3’ 二丙基硫代羰花青(dipropylthiadicarbocyanine) (二S-C3-(5))、4_(對(duì)-二戍基氨基苯乙烯基)-1_甲基卩比唳(二-5-ASP)、氰基-3-碘乙酰胺、氰基-5-正-羥基琥珀酰亞胺、氰基-7-異硫氰酸鹽、羅丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅蘭、Al酞菁、惡嗪I，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、Τ0Τ0、吖啶橙、乙啡啶同質(zhì)二聚體、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉銨(MQAE)、呋喃-2、鈣綠、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物熒光素、暈苯、金屬-配體復(fù)合物、IRDye 700DX、IRDye 700、IRDye 800RS、IRDye 800CW、IRDye 800、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DY676、DY680、DY682、DY780和其混合物。其他合適的熒光團(tuán)包括酶-輔因子、鑭系元素、綠熒光蛋白、黃熒光蛋白、紅熒光蛋白，或其突變體和衍生物。在本發(fā)明一實(shí)施方式中，這種特異性結(jié)合對(duì)的第二成員含有附著其上的可檢測(cè)基團(tuán)。 熒光團(tuán)中的熒光基團(tuán)通常選自所述染料目錄，包括聚甲炔、酞菁、花青、夾氧雜蒽、芴、羅丹明、香豆素、熒光黃和B0DIPY 。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熒光基團(tuán)是近紅外(NIR)熒光團(tuán)，發(fā)射光的范圍約650-約900nm。在生物學(xué)試驗(yàn)中采用近紅外熒光技術(shù)有益，因?yàn)樗苫旧舷驕p少生物物質(zhì)自身熒光產(chǎn)生的背景。近紅外熒光技術(shù)的另一優(yōu)點(diǎn)是激發(fā)光源產(chǎn)生的散射光極大地減少，因?yàn)樯⑸涔獾膹?qiáng)度與波長(zhǎng)四次方的倒數(shù)成正比。背景熒光低和散射光低可導(dǎo)致提高信嗓比，這是高靈敏度檢測(cè)所需。而且，在生物組織中近-IR區(qū)^50nm-900nm)內(nèi)的光透明窗口產(chǎn)生的NIR熒光，為體內(nèi)成像和亞細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)用(需要光透射穿過生物體組分)提供了有價(jià)值的技術(shù)。在該實(shí)施方式的諸方面中，熒光基團(tuán)宜選自IRDye 700DX、IRDye 700、IRDye 800RS、IRDye 800CW、IRDye 800、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor (g) 790、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DY676、DY680、DY682和DY780。在某些實(shí)施方式中，此種近紅外基團(tuán)是IRDye 800CW、IRDye 800、IRDye ⑧ 700DX、IRDye 700 或 DynomicDY676?？衫脽晒鈭F(tuán)的化學(xué)反應(yīng)衍生物進(jìn)行熒光素的標(biāo)記。常用的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)包括胺反應(yīng)的異硫氰酸衍生物，如FITC和TRITC (熒光黃和羅丹明的衍生物)；胺反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯，如NHS-熒光素；和巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺活化的熒光素，如熒光黃-5-馬來酰亞胺，它們中的許多可商品化購得。使這些反應(yīng)染料的任何一種與TNF α或抗-TNF α藥物反應(yīng)，可導(dǎo)致在熒光團(tuán)與TNFa之間或熒光團(tuán)與抗-TNFa藥物之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。在某些情況下，進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)后，常常需要去除標(biāo)記靶分子物質(zhì)中未反應(yīng)的熒光團(tuán)。這通常采用分子大小排阻層析，利用熒光團(tuán)與標(biāo)記的蛋白質(zhì)之間分子大小不同而實(shí)現(xiàn)?？蓮脑S多來源購得反應(yīng)熒光染料。其可用不同反應(yīng)基團(tuán)獲得以將各種功能基團(tuán)附著于靶分子。也能在標(biāo)記試劑盒中得到它們，試劑盒包括進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)的所有組分。在一優(yōu)選方面，采用英杰(Invitrogen)公司的Alexa Fluor 647 C2馬來酰亞胺(目錄號(hào)A-20347)。
可直接或間接檢測(cè)抗-TNF α抗體與TNF α，或抗-藥物抗體(ADA)與抗-TNF α抗體的免疫學(xué)特異性結(jié)合。直接標(biāo)記物包括熒光素或冷光標(biāo)簽、金屬、染料、放射性核素等，使之附著抗體。在某些情況下，用碘-125 (125I)標(biāo)記TNFa或抗-TNF α抗體可用于分別檢測(cè)樣品中的抗-TNFa抗體或ADA的濃度水平。在其他情況下，采用對(duì)樣品中的抗-TNF α抗體或ADA分別具有特異性的化學(xué)發(fā)光TNF α試驗(yàn)或抗-TNF α抗體的化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)，適合于靈敏地?zé)o放射活性地檢測(cè)抗-TNF α抗體或ADA的濃度水平。在特定情況下，用熒光染料標(biāo)記TNF α或抗-TNF α抗體也適合分別檢測(cè)樣品中的抗-TNF α抗體或ADA的濃度水平。熒光染料的示例包括但不限于=Alexa Fluor 染料、DAPI、熒光黃、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺?？缮唐坊彽眠B接有熒光染料的第二抗體，例如山羊F(ab’)2抗-人IgG-FITC可購自Tago免疫公司(Burlingame,CA)。間接標(biāo)記物包括本領(lǐng)域熟知的各種酶，如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。例如，可采用辣根過氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)與生色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，在存在過氧化氫時(shí)，以450nm檢測(cè)產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物。例如，可采用堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)與產(chǎn)色底物對(duì)-硝基苯磷酸鹽，產(chǎn)生405nm處容易檢測(cè)的可溶性產(chǎn)物。類似地，可 采用β -半乳糖苷酶檢測(cè)系統(tǒng)與其產(chǎn)色底物鄰-硝基苯基-β -D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)，產(chǎn)生410nm檢測(cè)的可溶性產(chǎn)物。可采用脲酶檢測(cè)系統(tǒng)與其底物，如尿素-溴甲酚紫(西格瑪(Sigma)免疫化學(xué)公司；St. Louis,MO)。連接酶的有用第二抗體可獲自一些商品化來源，如購自杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)(賓夕法尼亞州西格魯甫)的山羊F (ab，) 2抗-人IgG-堿性磷酸酶ο可分析直接或間接標(biāo)記物產(chǎn)生的信息，例如用分光光度計(jì)檢測(cè)產(chǎn)色底物產(chǎn)生的顏色，用幅射計(jì)數(shù)儀檢測(cè)幅射光，如用Y計(jì)數(shù)器檢測(cè)125I;或在存在某些波長(zhǎng)光時(shí)用熒光計(jì)檢測(cè)熒光。對(duì)于酶聯(lián)抗體的檢測(cè)，可用分光光度計(jì)，如EMAX微孔板讀數(shù)儀(加利福尼亞州門洛帕克的分子裝置公司(Molecular Devices))按照廠商說明書進(jìn)行抗-TNF α抗體含量或ADA水平的定量分析。如果需要，可使本發(fā)明的試驗(yàn)自動(dòng)化或用機(jī)器人進(jìn)行，而可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品產(chǎn)生的信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，采用分子大小排阻層析。SEC的原理是大小不同的顆粒將以不同速率通過靜止相洗脫(過濾)。導(dǎo)致溶液中的顆粒依據(jù)其大小而分離。條件是，同時(shí)或近乎同時(shí)加載所有的顆粒，同樣大小的顆粒在一起洗脫。每種分子大小排阻層析柱都有其可分離的分子量范圍。排阻界限的定義是此范圍的上端分子量，如果分子太大則不能被靜止相捕獲入其中。滲透界限的定義是此分離范圍的下端分子量，如果分子足夠小則可全部滲透入靜止相的孔中，低于此(下端)分子量的所有分子都很小，它們以一條帶洗脫。在某些方面，收集恒定體積的洗脫液或組分。顆粒的大小越相似，它們?cè)娇赡茉谕幌疵摻M分中而不能分別檢測(cè)。優(yōu)選以光譜學(xué)技術(shù)檢測(cè)收集的組分，以測(cè)定洗脫顆粒的濃度。本發(fā)明可用的光譜檢測(cè)技術(shù)通常包括但不限于熒光比色法、折射率(RI)和紫外線輻射(UV)法。在某些情況下，洗脫體積的減少大約與分子流體力學(xué)體積的對(duì)數(shù)線性相關(guān)(即較重部分先洗脫)。在某些方面，采用所述方法檢測(cè)抗-TNF α藥物，例如抗體的含量，包括REMICADE (英夫利昔單抗)、嵌合型抗-TNFa單抗、TNFR-IgFc融合蛋白ENBREL (依那西普)、人抗-TNF α單抗HUMIRA (阿達(dá)木單抗)和PEG化Fab片段CMZIA (賽妥珠單抗)。在某些情況下，檢測(cè)到抗-TNFa藥物(如抗-TNF α抗體)后，用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量這種抗-TNFa藥物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與樣品接觸，與自身抗體形成標(biāo)記的復(fù)合物；(b)所述標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以分離所述標(biāo)記復(fù)合物；和(c)檢測(cè)標(biāo)記復(fù)合物的存在或水平，從而檢測(cè)自身抗體。在某些情況下,所述自身抗體包括人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水平的方法，包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸，在標(biāo)記抗-TNFa藥物，標(biāo)記TNFa與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合物，和在標(biāo)記抗-TNFa藥物與自身抗體之間形成第二標(biāo)記復(fù)合物，其中標(biāo)記抗-TNFa藥物和標(biāo)記TNFa所含的標(biāo)記不相同；(b)第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以分離第一標(biāo)記復(fù)合物與第二標(biāo)記復(fù)合物；和(c)檢測(cè)第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物，從而當(dāng)存在第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物二者時(shí)檢測(cè)非中和形式的自身抗體，和當(dāng)只存在第二標(biāo)記復(fù)合物時(shí)檢測(cè)中和形式的自身抗體。在某些情況下，所述自身抗體包括人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗-TNF α藥物抗體(HAMA)。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的方法，包括(a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸，在標(biāo)記抗-TNFa藥物與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合物；(b)使第一標(biāo)記復(fù)合物通過分子大小排阻層析柱，而分離第一標(biāo)記復(fù)合物；(C)檢測(cè)第一標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)自身抗體的存在或水平；(d)使標(biāo)記TNF α與第一標(biāo)記復(fù)合物接觸，形成標(biāo)記抗-TNF α藥物與標(biāo)記TNF α之間的第二標(biāo)記復(fù)合物，其中標(biāo)記抗-TNFa藥物和標(biāo)記TNF α所含的標(biāo)記不相同； (e)第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行第二分子大小排阻層析，從而分離第二標(biāo)記復(fù)合物；和(f)檢測(cè)第二標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)存在的中和形式的自身抗體或其水平。在某些情況下，所述自身抗體包括人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和人抗-小鼠抗體(HAMA)。在其他實(shí)施方式中，本文所述的試驗(yàn)方法可用于預(yù)測(cè)患自身免疫疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等)對(duì)象對(duì)TNFa抑制劑，具體是對(duì)抗-TNF α抗體的應(yīng)答反應(yīng)。在此方法中，測(cè)定所述對(duì)象的抗-TNFa抗體正確劑量或治療有效量，即治療濃度水平，可預(yù)計(jì)該個(gè)體是否對(duì)這種治療會(huì)有響應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)患自身免疫失調(diào)對(duì)象的自身免疫失調(diào)的方法。所述方法包括測(cè)試隨時(shí)間推移所述對(duì)象的抗-TNFa抗體正確劑量或治療有效量，即治療濃度水平。以此方式，可預(yù)計(jì)在給定的時(shí)間內(nèi)該個(gè)體是否對(duì)這種治療會(huì)有響應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象，提供確定抗-TNF α藥物有效量的方法，所述方法包括(a)測(cè)定對(duì)象第一樣品中的抗-TNFa藥物水平，包括(i)使第一樣品接觸一定量的標(biāo)記TNF α，形成包含標(biāo)記TNF α與抗-TNF α藥物的第一復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第一復(fù)合物，從而測(cè)量抗-TNFa藥物的水平； (b)測(cè)定對(duì)象第二樣品中的抗-TNFa藥物自身抗體水平，包括(i)使第二樣品接觸一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物a，形成包含標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體的第二復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第二復(fù)合物，從而檢測(cè)自身抗體的水平；和(c)從步驟(a)測(cè)得的抗-TNFa藥物水平減去步驟(b)測(cè)得的自身抗體水平，從而測(cè)得抗-TNF α藥物的有效量。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供步驟(a) (ii)中的檢測(cè)，包括(I)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度率第一圖像計(jì)算標(biāo)記TNFa峰曲線下面積的積分；(2)從所述第一圖像計(jì)算第一復(fù)合物峰曲線下面積的積分；(3)將步驟⑵得到的積分除以步驟⑴得到的積分測(cè)得比率；和(4)將標(biāo)記TNF α含量乘步驟(3)的比率。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供步驟(b) (ii)中的檢測(cè)，包括(I)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度的第二圖像計(jì)算標(biāo)記抗-TNF α藥物峰曲線下面積的積分；(2)從該第二圖像計(jì)算第二復(fù)合物峰曲線下面積的積分；(3)將步驟⑵得到的積分除以步驟⑴得到的積分測(cè)得比率；和(4)將標(biāo)記抗-TNF α藥物含量乘步驟(3)的比率。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的第一和第二樣品都是血清樣品。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的第一和第二樣品都獲自用抗-TNFa藥物治療期間的對(duì)象。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供步驟(a) (ii)和/或步驟(b) (ii)中的檢測(cè)，包括熒光標(biāo)記物的檢測(cè)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明為接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNF α藥物治療劑量的方法,所述方法包括(a)按照本發(fā)明的方法測(cè)得抗-TNFa藥物的有效量；(b)比較抗-TNF α藥物的該有效量與抗-TNF α藥物的水平；和(c)根據(jù)步驟(C)的比較，確定所述對(duì)象的后續(xù)抗-TNFa藥物的劑量，從而最優(yōu)化抗-TNFa藥物的治療劑量。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，當(dāng)抗-TNF α藥物有效量低于抗-TNF α藥物水平時(shí)，本發(fā)明還提供提聞抗-TNFa藥物的后續(xù)劑量。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供提聞的后續(xù)抗-TNF α藥物劑量，從而抗-TNF α藥物的有效量約等于抗-TNF α藥物的水平。在一些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供的抗-TNF α藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA (賽妥珠單抗)和其組
入
口 ο在某些實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。在某些其他實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。在其他實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物是依那西普(ENBREL )。在某些其他實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是CMZIA .⑧(賽妥珠單抗)。在其他實(shí)施方式中，標(biāo)記TNFa是熒光團(tuán)標(biāo)記TNFa。在一些其他實(shí)施方式中，定量 檢測(cè)抗-TNFa藥物。在某些實(shí)施方式中，定量檢測(cè)TNF α。在其他實(shí)施方式中，先洗脫標(biāo)記的復(fù)合物，然后是游離的標(biāo)記抗-TNFa抗體。在某些實(shí)施方式中，分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)。在一些其他實(shí)施方式中，自身抗體選自人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)或其組合。在某些實(shí)施方式中，定量檢測(cè)自身抗體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療和/或減輕其毒性的方法，所述方法包括(a)測(cè)定所述對(duì)象第一樣品中的抗-TNFa藥物水平；；(b)測(cè)定所述對(duì)象第二樣品中的抗-TNF α藥物自身抗體的水平；和(c)根據(jù)抗-TNFa藥物和自身抗體的水平，確定所述對(duì)象的后續(xù)療程，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療和/或減輕其毒性。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNFa藥物水平高和自身抗體水平低時(shí)，同時(shí)給予免疫抑制藥物和抗-TNFa藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNF α藥物水平中等和自身抗體水平低時(shí)，提高抗-TNF α藥物的水平和同時(shí)給予免疫抑制藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNF α藥物水平中等和自身抗體水平中等時(shí)，給予不同的抗-TNFa藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNF α藥物水平低和自身抗體水平高時(shí)，給予不同的抗-TNF α藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，給予阿達(dá)木單抗(HUMIRA )代替英夫利昔單抗(REMICADE )。在一些實(shí)施方式中，短語“高水平抗-TNFa藥物”包括藥物水平約10_約100ng/10yL，約10-約70ng/10 μ L，或約10-約50ng/10 μ L。在其他實(shí)施方式中，短語“高水平抗-TNF α藥物”包括藥物水平高于約10、20、30、40、50、60、70、80、90或lOOng/lOy L。在一些實(shí)施方式中，短語“中等水平抗-TNFa藥物”包括藥物水平約5. 0_約50ng/10 μ L、約 5. O-約 30ng/10 μ L、約 5. 0-約 20ng/10 μ L、或約 5. O-約 10ng/10 μ L。在其他實(shí)施方式中，短語“中等水平抗-TNFa藥物”包括藥物水平約10、9、8、7、6、5、4、3、2或lng/ΙΟμ L0在一些實(shí)施方式中，短語“低水平抗-TNFa藥物”包括藥物水平約0_約lOng/lOy I、約O-約8ng/10y I或約O-約5ng/10y I。在其他實(shí)施方式中，短語“低水平抗-TNFa 藥物”包括藥物水平低于約 10,9. 0,8. 0,7. 0,6. 0,5. 0,4. 0,3. 0,2. 0、1· O 或O.5ng/10μ I。
首字母縮寫詞“ADA”包括短語“抗-藥物抗體”。在一些實(shí)施方式中，短語“高水平抗-TNFa抗體”包括抗-藥物抗體的水平約3. O-約 100ng/10 μ L、約 3. O-約 50ng/10 μ L、約 10-約 100ng/10 μ L、約 10-約 50ng/10 μ L或約20-約50ng/10 μ L。在某些其他實(shí)施方式中，短語“高水平抗-藥物抗體”包括抗_藥物抗體的水平大于約 10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 lOOng/lOy I。在一些實(shí)施方式中，短語“中等水平抗-藥物抗體”包括抗-藥物抗體的水平約O. 5-約 20ng/10y I、約 O. 5-約 lOng/lOy I、約 2. O-約 20ng/10y I、約 2. O-約 lOng/lOy I、約 2. O-約 5. 0ng/10 μ I 或約 2. O-約 5. 0ng/10 μ I。在某些實(shí)施方式中，短語“低水平抗-藥物抗體”包括抗-藥物抗體水平約O. O-約5. Ong/lOy I、約 O. I-約 5. Ong/lOy I、約 O. O-約 2. Ong/lOy I、約 O. I-約 2. Ong/lOy I 或約O. 5-約2. 0ng/10 μ I。在其他實(shí)施方式中，短語“低水平抗-藥物抗體”包括抗_藥物抗體水平低于約 5. 0,4. 0,3. 0,2. 0、1· O 或 O. 5ng/10 μ I。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供檢測(cè)抗-TNFa藥物的試驗(yàn)方法，包括⑴使第一樣品與一定量的標(biāo)記TNF α接觸，形成含有標(biāo)記TNF α和抗-TNF α藥物的第一復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第一復(fù)合物，從而檢測(cè)抗-TNF α藥物的水平。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供用檢測(cè)自身抗體的試驗(yàn)方法，包括(i)使第二樣品與一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物接觸，形成含有標(biāo)記抗_TNF α藥物與自身抗體的第二復(fù)合物；和(ii)用分子大小排阻層析檢測(cè)第二復(fù)合物，從而檢測(cè)自身抗體的水平。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的抗-TNF α藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA (賽妥珠單抗)和其組合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的抗-TNFa藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。在一些其他實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。在一些其他實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是依那西普(ENBREL )。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的抗-TNFa藥物是CIMZIA (賽妥珠單抗)。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供定量檢測(cè)抗-TNF α藥物的方法。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的第一和第二樣品是血清。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的第一和第二樣品獲自用抗-TNFa藥物治療期間的對(duì)象。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法提供的自身抗體選自人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)或其組合。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供定量檢測(cè)自身抗體的方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有抗-TNFa藥物的樣品中抗-TNF α藥物的存在或水平的方法，所述方法包括(a)使一定量的標(biāo)記TNF α和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照與樣品接觸,形成標(biāo)記TNF α與抗-TNFa藥物的復(fù)合物；(b)用分子大小排阻層析檢測(cè)標(biāo)記TNFa和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(c)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記TNFa峰曲線下面積的積分；(d)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分；(e)將標(biāo)記TNF α含量除以標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照含量測(cè)得第一比率；(f)將步驟(c)得到的積分除以步驟(d)得到的積分測(cè)得第二比率；和(g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而通過參比內(nèi)部對(duì)照確定抗-TNF α藥物的存在或水平。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供步驟(e)所測(cè)得的第一比率是約80 1-100 I。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供步驟(e)所測(cè)得的第一比率是約100 I。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是生物胞素_Alexa488。在某些實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素-Alexa 488)含量約I-約25ng/100yLo在某些其他實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素-Alexa488)含量約 5-約 25ng/100 μ L、約 5-約 20ng/100 μ L、約 I-約 25ng/100 μ L、約 I-約20ng/100yL、約I-約10ng/100yL或約I-約5ng/100 μ L。在其他實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素-Alexa 488)含量約為1、5、10、15、20或25ng/100 μ L。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明對(duì)接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象提供最優(yōu)化抗-TNFa藥物治療劑量的方法，所述方法包括根據(jù)按照本發(fā)明方法得到的第一比率與第二比率的比較，確定所述對(duì)象的后續(xù)抗-TNF α藥物劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的方法還包括當(dāng)?shù)谝槐嚷始s為100 I而第二比率低于約95 I時(shí)提高后續(xù)的抗-TNF α藥物劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的抗-TNF α藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CIMZIA (賽妥珠單抗)和其組合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的抗-TNFa藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的抗-TNF α藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的抗-TNFa藥物是CIMZIA (賽妥珠單抗)。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的抗-TNFa藥物是CIMZIA (賽妥珠單抗)。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的標(biāo)記TNF α是熒光標(biāo)記TNF α。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供定量檢測(cè)抗-TNF α藥物。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的標(biāo)記復(fù)合物先洗脫，然后是的是游離的標(biāo)記TNF α。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的樣品是血清。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的樣品獲自接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有自身抗體的樣品中抗-TNF α藥物自身抗體的方法，所述方法包括(a)使一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照與樣品接觸,形成標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體的復(fù)合物；(b)用分子大小排阻層析檢測(cè)標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(c)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記的標(biāo)記TNFa峰曲線下面積的積分；(d)多作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分；(e)將標(biāo)記抗-TNF α藥物含量除以標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照含量測(cè)得第一比率；、
(f)除以步驟(C)和步驟(d)得到的積分測(cè)得第二比率；和(g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而通過參比內(nèi)部對(duì)照測(cè)得存在的自身抗體或其水平。在一相關(guān)實(shí)施方式中，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約80 I—約100 I。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約100 I。在一相關(guān)實(shí)施方式中，標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是生物胞素-Alexa 488。在某些實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素-Alexa 488)含量約50_200pg/100 μ L。在某些其他實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素-Alexa 488)含量約 100-約 200pg/100 μ L、約 150-約 200pg/100 μ L、約50-約150pg/100y L或約50-約lOOpg/lOOy L。在其他實(shí)施方式中，所分析樣品中標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照(如生物胞素的-Alexa 488)含量約為 50、75、100、125、150、175 或 200pg/100 μ L。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)、 ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CIMZIA. (賽妥珠單抗)和其組合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物是依那西普(ENBREL )。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNFa藥物是CMZIA (賽妥珠單抗)。在一相關(guān)實(shí)施方式中，定量檢測(cè)自身抗體。在一相關(guān)實(shí)施方式中，標(biāo)記的復(fù)合物先洗脫，然后是游離的標(biāo)記抗-TNF α抗體。在一相關(guān)實(shí)施方式中,樣品是血清。在一相關(guān)實(shí)施方式中，樣品獲自接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象。在一相關(guān)實(shí)施方式中，分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)。在一相關(guān)實(shí)施方式中，自身抗體選自人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，定量檢測(cè)自身抗體。在一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供確定后續(xù)療程的方法。該后續(xù)療程包括當(dāng)抗-TNFa藥物水平高和自身抗體水平低時(shí)共同給予免疫抑制藥物和抗-TNFa藥物。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNFa藥物水平中等和自身抗體水平低時(shí)，提高抗-TNFa藥物的水平和同時(shí)給予免疫抑制藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNF α藥物水平中等和自身抗體水平中等時(shí)，給予不同的抗-TNFa藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，所述后續(xù)治療方案包括當(dāng)抗-TNFa藥物水平低和自身抗體水平高時(shí)，給予不同的抗-TNFa藥物。在另一相關(guān)的實(shí)施方式中，給予阿達(dá)木單抗(HUMIRA )代替英夫利昔單抗(REMICADE )。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平和存在 抗-TNF α藥物自身抗體的存在或水平的試劑盒，該試劑盒包括(a)含一定量的標(biāo)記TNF α的第一檢測(cè)底物；(b)含一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物的第二檢測(cè)底物；(c)任選的第三檢測(cè)底物，其含一定量的標(biāo)記TNFa和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(d)任選的第四檢測(cè)底物，其含一定量的標(biāo)記抗-TNFa藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照；(e)任選包括用于提取對(duì)象樣品的工具；和(f)任選包括如何使用該試劑盒的說明書小冊(cè)子。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包括能沉積本發(fā)明化學(xué)物質(zhì)的任何材料，包括但不限于硝化纖維素、硅膠、薄層層析基質(zhì)、木制小棍、纖維素、棉花、聚乙烯、其組合等等。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，可將本發(fā)明所用的化學(xué)物質(zhì)以有序的陣列、矩陣或矩陣陣列形式沉積在上述材料上。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括檢測(cè)標(biāo)記TNF α、標(biāo)記抗-TNF α藥物和/或標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照的方法。在一相關(guān)實(shí)施方式中，該試劑盒還包括檢測(cè)方法，包括但不限于熒光標(biāo)記檢測(cè)，UV-幅射光檢測(cè)或放射性碘暴光。在一相關(guān)實(shí)施方式中，該試劑盒還包括分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)儀器。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述第一、第二、第三和第四檢測(cè)底物選自硝化纖維素、硅膠和分子大小排阻層析的介質(zhì)。在一相關(guān)實(shí)施方式中，抗-TNF α藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)>ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CIMZIA (賽妥珠單抗)和其組合。在一相關(guān)實(shí)施方式中，標(biāo)記TNFa是熒光標(biāo)記TNFa。在一相關(guān)實(shí)施方式中，樣品是血清。在一相關(guān)實(shí)施方式中，樣品獲自接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象。在一相關(guān)實(shí)施方式中，所述自身抗體選自人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。本發(fā)明有關(guān)物質(zhì)的生理范圍和水平 用REMICADE 治療的患者中REMICADE 的治療有效水平范圍約為1-lOmgREMICADE /每kg患者體重。在一些實(shí)施方式中，REMICADE 的治療有效水平范圍約為3_8mgREMICADE /每kg患者體重。在一些實(shí)施方式中，REMICADE 的治療有效水平范圍約為5mgREMICADE /每kg患者體重。典型的REMICADE (英夫利昔單抗)劑量范圍為約O. 05-約80 μ g/ml。在一些實(shí)施方式中，REMICADE 的劑量范圍為約O. 05-約50 μ g/ml。在一些其他實(shí)施方式中，REMICADE 的劑量范圍為約O. 05-約30 μ g/ml ο在一些實(shí)施方式中，REMICADE 的劑量約為30 μ g/ml。在一些其他實(shí)施方式中，REMICADE 的劑量約為50 μ g/ml。用HUMIRA 治療的患者中HUMIRA 的治療有效水平范圍為約O. I-約IOmgHUMIRA /每kg患者體重。在一些實(shí)施方式中，HUMIRA 的治療有效水平范圍為約O. I-約8mg HUMIRA /每kg患者體重。在一些其他實(shí)施方式中，HUMIRA 的治療有效水平范圍約為Img HUMIRA /每kg患者體重。在一些實(shí)施方式中，HUMIRA 的治療有效水平范圍約為O. 8mg HUMIRA / 每 kg 患者體重。典型的HUMIRA 劑量范圍為約O. 05-約150 μ g/ml。在某些實(shí)施方式中，HUMIRA 的劑量范圍為約O. 05-約100 μ g/ml。在某些其他實(shí)施方式中，HUMIRA 的劑量為約O. 05-約50 μ g/ml。在某些實(shí)施方式中，HUMIRA 的劑量約為30 μ g/ml。在某些實(shí)施方式中，HUMIRA 的劑量約為32 μ g/ml。在某些其他實(shí)施方式中，HUMIRA 的劑量約為50 μ g/ml οV.示例疾病和用于治療其的治療抗體在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明采用單克隆抗體治療劑。表I提供了已獲批準(zhǔn)或目前正在開發(fā)中的治療用單克隆抗體的示例名單。在2006年P(guān)hRMA的題目為“418Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal AgainstDisease (允許測(cè)試以加強(qiáng)針對(duì)疾病的儲(chǔ)備的418種生物技術(shù)藥物)”的報(bào)告中披露了臨床開發(fā)和已獲批準(zhǔn)的單克隆抗體產(chǎn)品的擴(kuò)大名單。特別優(yōu)選的治療用抗體包括但不限于抗-TNFa單克隆抗體，例如(I)小鼠_人IgGl-κ輕鏈抗-TNFa單克隆抗體REMICADE (英夫利昔單抗)，(2)人TNF受體2與人IgGl的融合蛋白ENBREL (依那西普)和(3)完全的人IgGl-κ輕鏈抗-TNF α單克隆抗體HUMIRA (阿達(dá)木單抗)。構(gòu)建的其他二種抗-TNF α抗體在關(guān)鍵的III期臨床試驗(yàn)中對(duì)患同樣疾病的一些患者顯示出可靠性，這二種抗體是(4) PEG化的人源化抗-TNF α單克隆抗體Fab片段一CMZIA CD870(賽妥珠單抗)和(5)完全的人IgGl-κ輕鏈抗-TNF α單克隆抗體一CNTO 148(戈利木單抗(golimlunab))。治療用的一類優(yōu)選抗體是抗-TNFa單鏈單克隆抗體，可用于治療許多自身免疫疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎(白赫鐵列夫癥(Bechterew))、炎性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、嚴(yán)重的銀屑病、慢性眼葡萄膜炎、嚴(yán)重的結(jié)節(jié)病和韋格納肉芽腫病。除了用于檢測(cè)抗-TNF α抗體的生物利用度/濃度外，本發(fā)明也適合用于檢測(cè)機(jī)體內(nèi)所用的任何治療抗體的生物利用度/濃度，例如為治療和診斷目的。以下表I也提供了 與體內(nèi)應(yīng)用的各種治療性單克隆抗體相關(guān)的醫(yī)學(xué)指示癥狀(indication)名單。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明方法適合用于檢測(cè)治療性抗體的自身抗體的存在或濃度水平。因此，本發(fā)明的方法可用于最優(yōu)化包括給予對(duì)象治療性抗體的治療(或診斷)。所述方法可用于最優(yōu)化治療(或診斷)一種或多種疾病或失調(diào)，包括以下疾病的一種或多種傳染病，如呼吸道合胞病毒(RSV)、HIV、炭疽、念珠菌病、葡萄球菌感染、丙型肝炎。自身免疫疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、B-細(xì)胞非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性硬化癥、SLE、強(qiáng)直性脊柱炎、狼瘡、銀屑病關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡。炎性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎(白赫鐵列夫癥)、炎性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、嚴(yán)重的銀屑病、慢性眼葡萄膜炎、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病和其他炎性為主要特征的疾病。血液病，如敗血病、敗血病休克、突然發(fā)作的夜間血紅蛋白尿和溶血性尿毒綜合征。癌癥，如結(jié)腸直腸癌、非何杰金氏淋巴瘤、慢性B-淋巴細(xì)胞白血病、可復(fù)原的大細(xì)胞淋巴瘤、頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、治療HER2-過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、急性髓樣白血病、前列腺癌(如腺癌)、小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、惡性黑色素瘤、實(shí)體瘤、乳腺癌、早期HER2-陽性乳腺癌、一線非鱗狀上皮NSCLC癌、AML、毛細(xì)胞白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌、腦癌、骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移、SCLC，頭頸癌、一線胰腺癌、SCLC、NSCLC、頭頸癌、血癌和實(shí)體瘤、晚期實(shí)體瘤、胃腸癌、胰腺癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、非皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、CLL、卵巢癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、表達(dá)間皮素的腫瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移性胰腺癌、血液惡性腫瘤、可復(fù)原的皮膚大細(xì)胞MAb淋巴瘤、AML、骨髓異常增生綜合癥。心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化急性心肌梗塞、心肺分流術(shù)、心絞痛。代謝疾病，如糖尿病、I型糖尿病。消化道疾病，如克羅恩病、艱難梭菌(C. difficile)病，潰瘍性結(jié)腸炎。眼睛疾病，如葡萄膜炎。遺傳疾病，如陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)。
神經(jīng)障礙性疾病，如骨關(guān)節(jié)炎疼痛和阿爾茨海默病。呼吸道疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、鼻息肉病、兒童哮喘病。皮膚病，如銀屑病，包括慢性中等至嚴(yán)重的斑塊狀銀屑病。移植物排斥，如急性腎移植排斥、逆轉(zhuǎn)心肝移植物排斥、預(yù)防腎移植物排斥、預(yù)防急性腎移植物排斥、腎移植排斥。其他疾病，如闌尾炎診斷、腎炎、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(骨失調(diào))、嗜酸細(xì)胞增多綜合征、嗜酸性細(xì)胞食道炎和花生過敏癥。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述疾病選自上述特定疾病和失調(diào)的一種或多種。
表I
治療和診斷用單克隆抗體 產(chǎn)品名稱丨生產(chǎn)廠家適應(yīng)癥_
__傳染病_
Synagis 帕利珠單米迪繆尼(MedImmune)公預(yù)防呼吸道合胞病毒(RSV)
^__I__
抗-HIV-1 MAb迫立芒科學(xué)(Polymun HIV感染的治療
Scientific)公司，日內(nèi)瓦，
__奧地利__
CCR5 MAb哈南基因組科學(xué)(Hunan HIV感染
GenomeSciences)公司
__馬里蘭州羅克維爾__
Cytolin 賽托單(CytoDyn)公司^ HIV感染
抗-CD8 MAb__新墨西哥州圣菲__
NMOlSRD制藥公司HIV感染
_加州洛杉肌__
PRO 140普羅基尼(Progenies)制藥公HIV感染
司
__紐約州塔利鎮(zhèn)__
TNX355TanoxMAbHIV 感染,355TanoxMAb HIV 感染，
__臨床二期__臨床二期_
ABthrax 人類基因組科學(xué)(Human炭疽
拉巴庫單抗GenomeSciences)公司
(raxibacumab)___
Anthim (ETI-204)愛魯絲(Elusys)制藥公司炭痕
(罕用藥物)___
抗-hsp90 MAb耐特藥物(NeuTec Pharma)念珠菌病
___
抗-葡萄球菌-MAb 米迪繆尼公司預(yù)防葡萄球菌感染_
Aurexis英貝泰克斯(Inhibitex)公預(yù)防和治療金黃色葡萄球
特弗巴珠單抗司菌感染
(tefibazumab)___
巴維托星單抗__培格林(Peregrine)制藥公丙型肝炎治療_
_表I_
治療和診斷用單克隆抗體 產(chǎn)品名稱生產(chǎn)廠家適應(yīng)癥
(Bavituximab)_ 司
MDX-1303麥得萊克斯藥物(Medarex炭疽
__PharmAthene )公司_
Numax 米迪繆尼公司RSV
莫他維珠單抗
(motavizumab)_
Tarvacin I音格林制藥公司丙型肝炎
巴維托星單抗藥學(xué)(Pharmaceuticals)公 (bavituximab)司
XTL 6865XTL生物醫(yī)藥公司'丙型肝炎—
自身免疫病
Humira 阿達(dá)木單|雅培實(shí)驗(yàn)公司|類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
U___
Remicade 森拓科(Centocor)公司克羅恩病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
英夫利昔單抗___
Rituxan 基因泰克(Genentech)公B-細(xì)胞非何杰金淋巴瘤、用
瑞替星單抗司B細(xì)胞單抗治療后復(fù)發(fā)的患
Critiximab)__百集(Biogen Idec)公司者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎_
Tysarbi 百集公司多發(fā)性硬化癥
那他珠單抗
(natalizumab )___
ART 874培公司多發(fā)性硬化癥
Actemra__羅氏(Roche)公司__類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎_
AME 527應(yīng)用分子~( Applied類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
__Molecular)公司__
AMG 108一安進(jìn)公司^類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
AMG 714—安進(jìn)公司類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
抗-CD16 MAb巨基因(MacroGenics)公免疫性血小板減少癥
___
CNTO 1275森拓科公司多發(fā)性硬化癥
__賓夕法尼亞州霍舍姆__
達(dá)克珠單抗PDL生物制藥公司秦發(fā)性硬化癥(也見用于呼
(daclizumab)加州弗里蒙特吸道疾病)
(抗-CD25MAb) 百集公司
__馬薩諸塞州劍橋__
^~I 安進(jìn)公司多發(fā)性硬化癥(denosumah)__加州千橡__
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象中所述抗-TNF a藥物有效量的方法， 所述方法包括 (a)測(cè)量所述對(duì)象第一樣品中的所述抗-TNFa藥物的水平，包括 (i)使所述第一樣品接觸一定量的標(biāo)記TNFa，形成含所述標(biāo)記的TNFa與所述抗-TNF a藥物的第一復(fù)合物；和 ( )用分子大小排阻層析檢測(cè)所述第一復(fù)合物，從而檢測(cè)所述抗-TNF a藥物的所述水平； (b)測(cè)定所述對(duì)象第二樣品中所述抗-TNFa藥物的自身抗體的水平，包括 (i)使第二樣品接觸一定量的標(biāo)記抗-TNF a藥物,形成含所述標(biāo)記抗-TNF a藥物與所述自身抗體的第二復(fù)合物；和 ( )用分子大小排阻層析檢測(cè)所述第二復(fù)合物，從而檢測(cè)所述自身抗體的所述水平；和 (C)從步驟(a)測(cè)得的所述抗-TNFa藥物水平中減去步驟(b)測(cè)得的所述自身抗體水平，從而確定所述抗-TNF α藥物的有效量。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)(ii)的檢測(cè)包括 (1)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度第一圖像計(jì)算所述標(biāo)記的TNFa峰曲線下面積的積分； (2)從所述第一圖像計(jì)算所述第一復(fù)合物峰曲線下面積的積分； (3)將步驟(2)得到的積分除以步驟(I)得到的積分確定比率；和 (4)用所述標(biāo)記的TNFa的所述量乘步驟(3)的所述比率。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)(ii)的檢測(cè)包括 (1)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度的第二圖像計(jì)算所述標(biāo)記抗-TNF a藥物峰曲線下面積的積分； (2)從所述第二圖像計(jì)算所述第二復(fù)合物峰曲線下面積的積分； (3)將步驟(2)得到的積分除以步驟(I)得到的積分確定比率；和 (4)用所述標(biāo)記抗-TNFa藥物的所述量乘步驟(3)的所述比率。
4.如權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一和第二樣品均是血清樣品。
5.如權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，步驟(a)(ii)和/或步驟(b)(ii)的所述檢測(cè)包括突光標(biāo)記檢測(cè)。
6.一種最優(yōu)化接受抗-TNF α藥物治療的對(duì)象中抗-TNFa藥物治療劑量的方法，所述方法包括 (a)按照權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的方法測(cè)定所述抗-TNFa藥物的有效量； (b)比較所述抗-TNFa藥物的該有效量與所述抗-TNFα藥物的水平；和 (C)根據(jù)步驟(b)的比較，確定所述對(duì)象的所述抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括 (d)當(dāng)所述抗-TNF α藥物的有效量低于所述抗-TNFa藥物所述水平時(shí)，提高所述抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，提高所述抗-TNFa藥物的后續(xù)劑量，使所述抗-TNFa藥物的有效量約等于所述抗-TNF α藥物的所述水平。
9.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，所述抗-TNFα藥物選自下組REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)和CMZIA _ (賽妥珠單抗)和其組合。
10.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是英夫利昔單抗(RHMICADE )。
11.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。
12.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是依那西普(ENBREL )。
13.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物是CIMZIA .⑧(賽妥珠單抗)。
14.如權(quán)利要求1-13任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記的-TNFα是熒光標(biāo)記的TNFa。
15.如權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量的抗-TNFα藥物是定量的。
16.如權(quán)利要求1-15任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一復(fù)合物先被洗脫，然后是游離的標(biāo)記TNF α。
17.如權(quán)利要求1-16任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二復(fù)合物先被洗脫，然后是游離的標(biāo)記抗-TNF α藥物。
18.如權(quán)利要求1-17任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC).
19.如權(quán)利要求1-18任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，所述自身抗體選自下組人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。
20.如權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量的自身抗體是定量的。
21.如權(quán)利要求1-20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一和第二樣品均獲自用所述抗-TNF α藥物治療期間的所述對(duì)象。
22.—種在接受抗-TNF α藥物治療的對(duì)象中最優(yōu)化所述抗-TNF α藥物的治療和/或減輕其毒性的方法，所述方法包括 (a)測(cè)定所述對(duì)象第一樣品中的所述抗-TNFa藥物水平； (b)測(cè)定所述對(duì)象第二樣品中的所述抗-TNFa藥物的自身抗體的水平；和 (C)根據(jù)所述抗-TNFa藥物和所述自身抗體的水平，確定所述對(duì)象的后續(xù)療程，從而最優(yōu)化所述抗-TNFa藥物的治療和/或減輕其毒性。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗-TNFa藥物的所述水平高和所述自身抗體的所述水平低時(shí)，所述后續(xù)療程包括共同給予免疫抑制藥物和抗-TNFa藥物。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗-TNFa藥物的所述水平中等和所述自身抗體的所述水平低時(shí)，所述后續(xù)療程包括提高所述抗-TNFa藥物的水平和同時(shí)給予免疫抑制藥物。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗-TNFa藥物的所述水平中等和所述自身抗體的所述水平中等時(shí)，所述后續(xù)療程包括給予不同的抗-TNFa藥物。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述抗-TNFa藥物的所述水平低和所述自身抗體的所述水平高時(shí)，所述后續(xù)療程包括給予不同的抗-TNFa藥物。
27.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其特征在于，給予阿達(dá)木單抗(HUMIRA )代替英夫利昔單抗(REMICADE )。
28.如權(quán)利要求22-27任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，采用以下試驗(yàn)測(cè)量所述抗-TNF α藥物,所述試驗(yàn)包括 (i)使所述第一樣品與一定量的標(biāo)記TNFa接觸，形成含有所述標(biāo)記TNFa和所述抗-TNF α藥物的第一復(fù)合物；和 ( )用分子大小排阻層析檢測(cè)所述第一復(fù)合物，從而測(cè)量所述抗-TNFa藥物的所述水平。
29.如權(quán)利要求22-28任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，采用以下試驗(yàn)測(cè)量所述自身抗體，所述試驗(yàn)包括 (i)使所述第二樣品與一定量的標(biāo)記抗-TNFa藥物接觸，形成含有所述標(biāo)記抗-TNFa藥物與所述自身抗體的第二復(fù)合物；和 ( )用分子大小排阻層析檢測(cè)所述第二復(fù)合物，從而測(cè)量所述自身抗體的水平。
30.如權(quán)利要求22-29任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物選自下組REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA. (賽妥珠單抗)和其組合。
31.如權(quán)利要求22-29任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。
32.如權(quán)利要求22-29任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。
33.如權(quán)利要求22-29任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是依那西普(ENBREL )。
34.如權(quán)利要求22-29任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物是CIMZIA (R)(賽妥珠單抗)。
35.如權(quán)利要求22-34任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量的抗-TNFα藥物是定量的。
36.如權(quán)利要求22-35任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量的自身抗體是定量的。
37.如權(quán)利要求22-36任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一和第二樣品均是血清樣品。
38.如權(quán)利要求22-37任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一和第二樣品均獲自用所述抗-TNF α藥物治療期間的所述對(duì)象。
39.如權(quán)利要求22-38任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述自身抗體選自下組人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。
40.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其特征在干，所述免疫抑制藥物選自下組氨甲喋呤、硫唑嘌呤，其代謝產(chǎn)物和其組合。
41.一種參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有抗-TNFa藥物的樣品中所述抗-TNF α藥物的存在或水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的標(biāo)記TNFa和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照接觸所述樣品，形成所述標(biāo)記TNFa與所述抗-TNF α藥物的復(fù)合物； (b)用分子大小排阻層析檢測(cè)所述標(biāo)記TNFα和所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照； (C)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算所述標(biāo)記TNFa峰曲線下面積的積分； (d)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分； (e)用所述標(biāo)記TNFa的量除以所述標(biāo)記內(nèi)部対照的量，測(cè)得第一比率； (f)用步驟(C)測(cè)得的積分除以步驟(d)測(cè)得的積分，測(cè)得第二比率；和 (g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而參比內(nèi)部對(duì)照確定所述抗-TNF α藥物的存在或水平。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約80-約100。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約100.
44.如權(quán)利要求41-43任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是生物胞素-Alexa 488。
45.如權(quán)利要求41-44任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，分析樣品中所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照為姆100 μ L約I-約25ng。
46.ー種在接受抗-TNFa藥物治療的對(duì)象中最優(yōu)化所述抗-TNF α藥物治療劑量的方法，所述方法包括 根據(jù)權(quán)利要求41-44任何一項(xiàng)所述方法測(cè)得的所述第一比率與第二比率的比較，確定所述對(duì)象的所述抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括當(dāng)所述第一比率約100 I和所述第二比率低于約95 I吋，提高抗-TNFa藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化所述抗-TNF α藥物的治療劑量。
48.如權(quán)利要求41-47任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物選自下組REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA. (賽妥珠單抗)和其組合。
49.如權(quán)利要求41-47任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。
50.如權(quán)利要求41-47任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。
51.如權(quán)利要求41-47任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是依那西普(ENBREL )。
52.如權(quán)利要求41-47任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物是CIMZIA (賽妥珠單抗)。
53.如權(quán)利要求41-52任何一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述標(biāo)記TNFα是突光標(biāo)記的 TNF α。
54.如權(quán)利要求41-53任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述測(cè)量的標(biāo)記抗-TNFa和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是定量的。
55.如權(quán)利要求41-54任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合物先被洗脫，然后是游離的標(biāo)記TNF α。
56.如權(quán)利要求41-55任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清。
57.如權(quán)利要求41-56任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，所述樣品獲自接受所述抗-TNF α藥物治療期間的對(duì)象。
58.如權(quán)利要求41-57任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC).
59.一種參比內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)含有或懷疑含有自身抗體的樣品中所述抗-TNFa藥物自身抗體的存在和水平的方法，所述方法包括 (a)使一定量的標(biāo)記抗-TNFa藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照與所述樣品接觸，形成所述標(biāo)記抗-TNF α藥物與所述自身抗體的復(fù)合物； (b)用分子大小排阻層析檢測(cè)所述標(biāo)記抗-TNFa藥物和所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照； (C)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算所述標(biāo)記TNFa峰曲線下面積的積分； (d)從作為分子大小排阻層析洗脫時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度圖像計(jì)算所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照峰曲線下面積的積分； (e)將所述標(biāo)記抗-TNFa藥物的含量除以所述標(biāo)記內(nèi)部対照的含量，測(cè)得第一比率； (f)除以步驟(C)和步驟⑷得到的積分，測(cè)得第二比率；和 (g)比較步驟(e)測(cè)得的第一比率與步驟(f)測(cè)得的第二比率，從而參比內(nèi)部對(duì)照測(cè)定所述自身抗體的存在或水平。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約80-約100。
61.如權(quán)利要求59-61任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(e)測(cè)得的第一比率為約 100.
62.如權(quán)利要求59-61任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是生物胞素-Alexa 488。
63.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，分析樣品中所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照為每100 μ L約50-約200pg。
64.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物選自REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA (賽妥珠單抗)和其組合。
65.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是英夫利昔單抗(REMICADE )。
66.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是阿達(dá)木單抗(HUMIRA )。
67.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFα藥物是依那西普(ENBREL )。
68.如權(quán)利要求59-62任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗-TNFa藥物是CIMZIA (D (賽妥珠單抗)。
69.如權(quán)利要求59-68任何一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述測(cè)量的標(biāo)記抗-TNFα藥物和標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照是定量的。
70.如權(quán)利要求59-69任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合物先被洗脫，然后是游離的標(biāo)記抗-TNF α藥物。
71.如權(quán)利要求59-70任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清。
72.如權(quán)利要求59-71任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品獲自接受所述抗-TNF α藥物治療期間的對(duì)象。
73.如權(quán)利要求59-72任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分子大小排阻層析是分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC).
74.如權(quán)利要求59-73任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述自身抗體選自下組人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。
75.ー種檢測(cè)樣品中抗-TNF α藥物的存在或水平和抗-TNF α藥物自身抗體的存在或水平的試劑盒，所述試劑盒包括 (a)含一定量的標(biāo)記TNFa的第一檢測(cè)底物； (b)含一定量的標(biāo)記抗-TNFα藥物的第二檢測(cè)底物； (C)任選的第三檢測(cè)底物,其含一定量的標(biāo)記TNFa和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照； (d)任選的第四檢測(cè)底物，其含一定量的標(biāo)記抗-TNFα藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對(duì)昭. (e)任選的用于提取對(duì)象樣品的工具；和 (f)任選的使用該試劑盒的說明書小冊(cè)。
76.如權(quán)利要求75所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括檢測(cè)所述標(biāo)記TNFa、所述標(biāo)記抗-TNFa藥物和/或所述標(biāo)記內(nèi)部對(duì)照所用的手段。
77.如權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)手段包括熒光標(biāo)記檢測(cè)、UV-幅射光檢測(cè)或放射性碘暴光檢測(cè)。
78.如權(quán)利要求75-77所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括分子大小排阻高效液相層析(SE-HPLC)儀器。
79.如權(quán)利要求75-78所述的試劑盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四檢測(cè)底物選自下組硝化纖維素、硅膠和分子大小排阻層析的介質(zhì)。
80.如權(quán)利要求75-79所述的試劑盒，其特征在于，所述抗-TNFa藥物選自下組REMICADE (英夫利昔單抗)、ENBREL (依那西普)、HUMIRA (阿達(dá)木單抗)、CMZIA (賽妥珠單杭)和其組合。
81.如權(quán)利要求75-80任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記TNFα是熒光標(biāo)記的 TNF α。
82.如權(quán)利要求75-81任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品是血清。
83.如權(quán)利要求75-82所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品獲自接受所述抗-TNFα藥物治療期間的對(duì)象。
84.如權(quán)利要求75-83所述的試劑盒，其特征在干，所述自身抗體選自下組人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)、人抗-人源化抗體(HAHA)和其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測(cè)和測(cè)量樣品中抗-TNFα藥物治療和自身抗體的存在或水平的方法。本發(fā)明可用于最優(yōu)化治療和監(jiān)測(cè)接受抗-TNFα藥物治療患者以檢測(cè)抗藥物的自身抗體(如HACA和/或HAHA)的存在或水平。
文檔編號(hào)G01N33/564GK102695955SQ201080060442
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者L·奧爾穆德, S·L·王, S·辛格 申請(qǐng)人:普羅米修斯實(shí)驗(yàn)室股份有限公司