專利名稱：用于核酸檢測的層析系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及到核酸檢測領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及到一種基于橫向流層析分離和樣品中核酸的序列特異性檢測的試條、方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在不可避免地需要進(jìn)行核酸檢測的研究領(lǐng)域和工業(yè)領(lǐng)域中，不論該檢測是涉及到確認(rèn)目標(biāo)核酸的存在與否還是對核酸進(jìn)行定性或定量測定，主要使用涉及到核酸的序列特異性雜交的方法。該類方法中的其中一種是基于聚合酶鏈反應(yīng)的測試，其中對特定的目標(biāo)序列進(jìn)行選擇性擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，之后使用序列特異性雜交方法如 southern或northern blot或使用染料染色顯像。然而，上述方法是一個復(fù)雜的過程，其中無論是樣品的制備和反應(yīng)還是顯像都需要長時間的工作。而且該反應(yīng)結(jié)果不很靈敏，需要大量的進(jìn)樣，而且對不同反應(yīng)條件如雜交時間或溫度，以及反應(yīng)緩沖溶液或所用的引物等十分敏感。因此，為了設(shè)定最佳反應(yīng)條件以獲得可靠結(jié)果，需要高度熟練的技術(shù)人員進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)。核酸檢測被廣泛應(yīng)用于臨床，如疾病的診斷或篩查或治療的預(yù)后。因此，有對用于檢測樣品中核酸的簡易、方便以及可靠的系統(tǒng)或產(chǎn)品或方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到一種用于核酸檢測和/或量化以確定一種特定的核酸序列在樣品中的存在與否及含量的試條、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明基于橫向流層析分離及樣品中的核酸序列特異性檢測，易于使用并由于其相對于傳統(tǒng)系統(tǒng)的高靈敏度和特異性可在較短的分析時間內(nèi)得到精確可靠的結(jié)果。一方面，本發(fā)明涉及一種用于對分析物，即樣品中的核酸分子，進(jìn)行定性和/或定量的序列特異性測試的橫向流檢測試條。本發(fā)明的試條包含提供樣品涂布點(diǎn)的樣品墊； 吸收墊；以相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)姆绞轿挥跇悠穳|與吸收墊之間的層析介質(zhì)，所述層析介質(zhì)包含至少一種捕獲分子，所述捕獲分子能夠與涂布在樣品墊上的樣品中的特定核酸序列進(jìn)行序列特異性雜交；和固相載體，用于支撐以相同平面位于所述固相載體上以容許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)膶游鼋橘|(zhì)、樣品墊和吸收墊。在一個實(shí)施方式中，所述固相載體具有樣品墊和吸收墊分別位于一端的兩個末端。在另一個實(shí)施方式中，所述至少一種捕獲分子固定于所述層析介質(zhì)上的已知的特定位置。另一方面，本發(fā)明涉及到用于對分析物，即樣品中的核酸分子，進(jìn)行序列特異性檢測的橫向流定性和/或定量檢測試條。本發(fā)明中的試條包含提供樣品涂布點(diǎn)的樣品墊；吸收墊；以相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)姆绞轿挥跇悠穳|與吸收墊之間的層析介質(zhì)，所述層析介質(zhì)包含至少一種捕獲分子，所述捕獲分子能夠與涂布于樣品墊的樣品中并用熒光材料或生物素標(biāo)記且為聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的特定核酸序列進(jìn)行序列特異性雜交；和固相載體， 支撐以相同平面位于所述固相載體上以容許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)膶游鼋橘|(zhì)、樣品墊和吸收墊。在一個實(shí)施方式中，固相載體具有樣品墊和吸收墊分別位于一端的兩個末端。另一方面，本發(fā)明提供了上述試條，其中所述捕獲分子具有來自于人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的核酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了上述試條，能夠檢測并區(qū)分選自由16、18、沈、31、33、35、 39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和 CP108 組成的組中的不同HPV亞型。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中核酸的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含本發(fā)明中的試條和用于檢測來自本發(fā)明任一試條中的捕獲分子的信號的落射熒光檢測裝置。在一個實(shí)施方式中，所述落射熒光為激光誘導(dǎo)的。1.另一方面，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明中所述任一試條對樣品中的核酸進(jìn)行定性和/或定量檢測的方法，該方法包括以下步驟將含有以熒光或生物素標(biāo)記的目標(biāo)核酸序列的液體樣品涂布到本發(fā)明中的試條的樣品墊上；使該液體樣品流到試條的吸收墊， 其中在試條特定位置上的捕獲物與目標(biāo)核酸序列進(jìn)行序列特異性反應(yīng)以形成雜交體；和使用落射熒光檢測裝置檢測雜交體上的標(biāo)記物發(fā)出的信號，其中信號的存在表面存在目標(biāo)核酸，或該信號用于量化目標(biāo)核酸在樣品中的量。在一個實(shí)施方式中，所述捕獲分子具有來自于人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的核酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了上述方法，能夠檢測并區(qū)分選自由16、18、沈、31、33、35、 39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和 CP108 組成的組中的不同HPV亞型。上述摘要僅僅是示例性的而并不局限于此。除了上述示例性的方面、實(shí)施方式和特征，參照附圖和以下詳細(xì)說明，其它各方面、實(shí)施方式和特征也是顯而易見的。


參照以下詳細(xì)描述以及附圖，本發(fā)明的更完整的價值以及很多隨之而來的優(yōu)勢會逐漸變得顯而易見，同樣也會被更好地理解，其中圖1為本發(fā)明中試條的一個實(shí)施方式的示意圖。附圖標(biāo)記表示101 橫向流試條； 102 樣品墊；103 吸收墊；104 層析介質(zhì)；和105 信號檢測區(qū)域(也被稱為分析物檢測區(qū)域)。圖2為激光誘導(dǎo)落射熒光檢測裝置的示意圖。附圖標(biāo)記表示108 檢測窗口 ； 109 樣品涂布點(diǎn)；Iio 試條托架；200 激光誘導(dǎo)落射熒光檢測裝置；201 激光；202 激光光束控制透鏡；203 聚光透鏡；204 熒光濾鏡；205 聚光透鏡；206 空間濾波器；和207 光探測器。圖3為DNA固定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以優(yōu)化在硝酸纖維素膜上的固定條件。(a)無紫外照射；(b)對膜進(jìn)行一小時的干燥，之后進(jìn)行紫外照射；(c)在沒有對膜進(jìn)行干燥的條件下進(jìn)行紫外照射。黃色區(qū)域表示被固定的DNA。圖4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，其中分別使用Cy5標(biāo)記的 HPV 16和18的特異引物。紅色表示DNA的存在，M表示尺寸標(biāo)記物。圖5為通過確定核酸序列間的交叉反應(yīng)以檢測HPV的不同亞型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對樣品中的HPV 16進(jìn)行檢測，其中HPV 16和18的特異 DNA被用作捕獲分子。圖6為通過確定核酸序列間的交叉反應(yīng)以檢測HPV的不同亞型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對樣品中的HPV 18進(jìn)行檢測，其中HPV 16和18的特異 DNA被用作捕獲分子。圖7為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，其中分別使用生物素標(biāo)記的HPV 16和18特異引物，并使用被鑒定為HPV陽性的模版。在PCR中使用不同的循環(huán)數(shù)。 M 尺寸標(biāo)記物，IOObp ladder ； 1 :20次PCR循環(huán)；2 10次PCR循環(huán)；3 :5次PCR循環(huán)。圖8為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對圖7中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果。藍(lán)線陰性對照；紅線20次PCR循環(huán)；黃綠線10次PCR循環(huán)；紫線5次PCR循環(huán)。圖9為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，所用反應(yīng)條件與圖7相同， 除了在模版上使用了不同樣品。M 尺寸標(biāo)記物，IOObp ladder ； 1 :30次PCR循環(huán)；2 :20次 PCR循環(huán)；3 10次PCR循環(huán)；4 5次PCR循環(huán)；5 3次PCR循環(huán)。圖10為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對圖9中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果。淺藍(lán)線陰性對照；藍(lán)線30次PCR循環(huán)；紅線20次PCR循環(huán)；黃綠線10次PCR循環(huán)；紫線5次PCR循環(huán)。圖11為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果，分別用藍(lán)色和紅色表示經(jīng)過和未經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物。使用被生物素標(biāo)記的HPV特異引物對該產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，而HPV陽性樣品被用作模版。圖12為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)在以下各種材料的存在下對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果。使用被生物素標(biāo)記的HPV特異引物對該產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，而HPV陽性樣品被用作模版。所加入的組分為藍(lán)色純品；紅色Taq緩沖溶液；黃綠色dNIPs ；紫色 50mM KCl ；和淺藍(lán)色2. 5mM MgCl2。圖13為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)在以下EDTA的不同濃度下對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果。使用被生物素標(biāo)記的HPV特異引物對該產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，而HPV陽性樣品被用作模版。藍(lán)色純品；紅色2. 5mM MgCl2 ；黃綠色2. 5mM MgCl2+檢測劑(ImM EDTA)； 和紫色2. 5mM MgCl2+檢測劑(50mM EDTA)。圖14為PCR擴(kuò)充產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，其中使用生物素標(biāo)記的 HPV特異引物，幾種HPV陽性樣品被用作模版。圖15A和15B為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對圖14中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果。圖右側(cè)的數(shù)字表示不同來源的樣品ID。圖16為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果，其中使用HPV特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，并使用從圖14中的非特異性條帶提取的DNA作為模版。37 ；紅色陰性對照。圖17為使用HPV特異引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果， 所用引物直接來自活檢樣品，之前沒有進(jìn)行DNA提取。圖18為使用本發(fā)明中一個實(shí)施方式中的系統(tǒng)對圖17中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)^ ο每幅附圖中相同的附圖標(biāo)記表示相應(yīng)的部分。
具體實(shí)施例方式以下部分將參照附圖進(jìn)行詳細(xì)說明。除非另作說明，圖中相同的標(biāo)志通常表示相同組分。本發(fā)明并不局限于在詳細(xì)說明書、附圖和權(quán)利要求中所描述的示例性實(shí)施方式。在不違背此處主題的精神和范圍的情況下，也可使用其它實(shí)施方式并作出其它改變?？梢岳斫獗景l(fā)明中主要描述并在圖中說明的各方面可以以多種不同形式進(jìn)行排列、取代、結(jié)合和設(shè)計，它們都經(jīng)過明確的思考并包括在本發(fā)明中。一方面，本發(fā)明涉及一種用于以序列特異性方式對分析物，即樣品中的核酸，進(jìn)行定性和/或定量實(shí)驗(yàn)的橫向流試條。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種試條，包括提供樣品涂布點(diǎn)的樣品墊；吸收墊；以允許相互(樣品墊、層析介質(zhì)和吸收墊)之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)姆绞轿挥跇悠穳|和吸收墊之間的層析介質(zhì)，該層析介質(zhì)包含至少一種捕獲分子，該捕獲分子能夠與涂布于樣品墊的樣品中的特定核酸序列進(jìn)行序列特異性反應(yīng)；和固相載體，支撐以相同平面位于所述固相載體上以容許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)膶游鼋橘|(zhì)、樣品墊和吸收墊。在一個實(shí)施方式中，固相載體具有樣品墊和吸收墊分別位于一端的兩個末端。在另一個實(shí)施方式中， 至少一種捕獲分子固定于層析介質(zhì)上的一個特定位置。此處所用術(shù)語“毛細(xì)流動傳輸”表示樣品墊、層析介質(zhì)和吸收墊之間存在接觸，使得在樣品墊中涂布的液體樣品通過毛細(xì)作用流過層析介質(zhì)到達(dá)吸收墊。在一個實(shí)施方式中，具有第一和第二末端的層析介質(zhì)位于樣品墊和吸收墊之間，一末端與樣品墊接觸，另一末端與吸收墊接觸，其中所述末端可以與樣品墊或吸收墊的一末端重疊或相互接觸或相鄰。優(yōu)選樣品墊、層析介質(zhì)和吸收墊具有相同寬度，特別在末端重疊處。此處所用術(shù)語“樣品”是指含有需要被檢測的分析物的化合物或組合物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品為液態(tài)或水溶液，以使得被加入到樣品墊中的樣品可以通過毛細(xì)作用經(jīng)由層析介質(zhì)流動到吸收墊。此處所用術(shù)語“分析物”或“目標(biāo)分析物”或“目標(biāo)材料”是指樣品中被分析的化合物，也叫做“目標(biāo)材料”，包括核酸。此處所用術(shù)語“核酸”是指任何來自生物材料或被化學(xué)合成或通過已知方法如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增得到的DNA或RNA分子，其包括但不局限于如基因組DNA(脫氧核糖核酸)、cDNA、RNA(核糖核酸)。另外所述核酸可以是雙鏈或單鏈，并可由生物材料如細(xì)胞或組織中提取，或根據(jù)本領(lǐng)域已知方法合成。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明中的核酸為DNA，特別是通過PCR合成的DNA，并作為單鏈?zhǔn)褂?，直接或間接被用于檢測的標(biāo)記基團(tuán)如熒光染料或生物素標(biāo)記，所述熒光染料或生物素可在合成時或合成后被結(jié)合到核酸中。當(dāng)使用了標(biāo)記染料如生物素時，所述染料可與鏈親和素或親和素結(jié)合使用并與顆粒相關(guān)聯(lián)用于檢測?？捎糜诒景l(fā)明的顆粒包括但不局限于例如聚苯乙烯微球、乳膠顆粒、納米金顆粒、膠體金顆粒、金屬顆粒、磁性微粒、熒光微粒和半導(dǎo)體納米晶體顆粒。一旦被標(biāo)記的核酸被固定在層析介質(zhì)上的捕獲分子通過序列特異性雜交捕獲，核酸上的染料可被檢測或被本領(lǐng)域中已知的適宜裝置讀取。如果需要，可以直接對作為模版的生物標(biāo)本或由作為模版的標(biāo)本中提取的DNA或RNA進(jìn)行分析物的PCR擴(kuò)增。另外，根據(jù)本發(fā)明，擴(kuò)增后經(jīng)過或未經(jīng)過下一步檢測純化的PCR產(chǎn)物可用于分析。此處所用術(shù)語“目標(biāo)序列”是指被擴(kuò)增并用作被檢測的目標(biāo)材料的序列。目標(biāo)序列可以含有或不含有引物結(jié)合序列。目標(biāo)序列可以根據(jù)將要進(jìn)行的檢測的目的選擇。例如，如果該檢測是為了區(qū)分目標(biāo)病毒的不同類型，該目標(biāo)序列需要涵蓋各型目標(biāo)病毒的特異性病毒基因組區(qū)域。為了增加特異性，可以使用多于一種目標(biāo)序列并例如可以包括毒素基因或病原體的特異性序列，該序列可根據(jù)本領(lǐng)域中已知信息選擇。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個目標(biāo)序列或目標(biāo)材料的示例選自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HIV (人類免疫缺陷病毒)以區(qū)分其亞型。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)序列來自HPV以區(qū)分其包括高危型和低危型的亞型。高危型HPV包括但不局限于HPV亞型16、18、沈、31、33、35、 39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73 和 82。低危型 HPV 包括但不局限于 HPV 亞型 6、 11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，HPV亞型包括6、11、 16、18、31、45和51，特別是亞型16和18。根據(jù)本發(fā)明可以使用的熒光染料(分子)的激發(fā)波長和發(fā)射波長相差20nm。示例性例子包括但不局限于量子點(diǎn)、鑭系元素螯合物(如Sm(釤)、Eu(銪)、Tb(鋱))以及熒光物質(zhì)(如 FITC、羅丹明綠、硫雜二羰花菁(thiadicarbocyanine)、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5. 5、 Alexa 488、Alexa 594和Alexa 647)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明被檢測的分析物被生物素標(biāo)記。在另一個實(shí)施方式中分析物被Cy3或Cy5標(biāo)記。一般來說，熒光的強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比。此處所用術(shù)語“落射熒光”是指從結(jié)合了捕獲分子的標(biāo)記目標(biāo)材料或分析物中的共軛鍵，和/或結(jié)合了一個對照捕獲分子的標(biāo)記對照材料中的對照共軛鍵發(fā)出的熒光，其可以在固定有捕獲分子的層析介質(zhì)區(qū)域內(nèi)被檢測到。此處所用術(shù)語“捕獲物或捕獲分子或捕獲寡核苷酸”是指一種可以與樣品中的分析物進(jìn)行序列特異性雜交的材料，包括但并不局限于核酸。本發(fā)明中的捕獲分子被固定于層析介質(zhì)上的特定區(qū)域，并通過序列特異性雜交捕獲通過毛細(xì)作用在試條上傳輸?shù)哪繕?biāo)分析物。本發(fā)明中的捕獲分子可以通過與層析介質(zhì)的共價或非共價鍵固定。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，捕獲分子通過非共價鍵連接或被固定。將核酸如DNA連接或固定到多孔膜如硝基纖維素膜上的方法在本領(lǐng)域中已知，并可被應(yīng)用于本發(fā)明中?？捎糜诒景l(fā)明中的一種示例性的固定方法是，例如將核酸吸收在膜表面上，接下來在80°C下進(jìn)行熱處理。其它示例性方法包括，將核酸加入到膜上后風(fēng)干，之后用紫外照射，或?qū)⒉东@寡核苷酸與等量的氯化鈉和檸檬酸鈉混合并真空處理，或使用紫外線處理。捕獲分子同樣可以通過共價鍵固定于帶電尼龍膜上。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明中的捕獲分子為單鏈寡核苷酸，其序列部分或全部與目標(biāo)材料或目標(biāo)分析物的序列互補(bǔ)。一般來說，捕獲序列可選自一段目標(biāo)序列的區(qū)域，其中基于內(nèi)部氫鍵的二級結(jié)構(gòu)并不重要。捕獲分子以一條例如寬度為Imm或更少的直線加入到層析介質(zhì)如硝基纖維素膜上。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以根據(jù)在測試中所用的層析介質(zhì)類型選擇所用的合適的線寬。加入到本發(fā)明中的層析介質(zhì)上的捕獲分子濃度在約10 到150pM的范圍內(nèi)，但并不局限于此。在一個實(shí)施方式中，捕獲分子的濃度為ΙΟΟρΜ。至少將可包括但不限于目標(biāo)DNA、陰性和/或陽性對照的至少一種捕獲分子(固定于本發(fā)明中試條上的層析介質(zhì)的已知特定位置。術(shù)語“已知特定位置”是指與樣品涂布點(diǎn)沿毛細(xì)流動方向具有已知/特定距離的位置(此后被稱為“分析物測定區(qū)域”)，并根據(jù)所用捕獲分子的數(shù)量可以有多于一個位置。例如，捕獲分子可存在于多個位置，而該位置在層析介質(zhì)中形成一條線，起點(diǎn)與樣品涂布點(diǎn)的距離為2至5mm，而不同捕獲分子間的距離為Imm或更多。 多個捕獲分子可被固定于一個層析介質(zhì)上，而本領(lǐng)域中技術(shù)人員可根據(jù)所用的層析介質(zhì)類型、分子大小和/或分析物和/或用于檢測的捕獲分子的性質(zhì)選擇捕獲分子的最佳數(shù)量。 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明中的試條可在層析介質(zhì)的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個及更多的位置上具有相同或不同的捕獲分子。當(dāng)存在多條捕獲分子線時，各條線間的距離可變。在一個實(shí)施方式中，捕獲線間的距離為至少1mm， 但并不局限于此。作為捕獲分子的核酸長度可以為約10到200個堿基，但并不局限于此。在一個實(shí)施方式中，該長度可包括，但不局限于，約20個堿基、30個堿基、40個堿基、50個堿基、60個堿基、70個堿基、80個堿基、90個堿基、100個堿基、110個堿基、120個堿基、130個堿基。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該能夠根據(jù)所測試的的分析物選擇合適的捕獲分子的序列和/或長度。常用的長度為至少20個堿基，或任何熔點(diǎn)在50至70°C的長度。在一個實(shí)施方式中，捕獲分子可包括包含9至20個T殘基的空間序列。在另一個實(shí)施方式中，捕獲分子可包含改性的核酸，如PNA(肽核酸)或LNA(鎖核酸)，以改變或提高雜交性質(zhì)，這一點(diǎn)對于短寡核苷酸或在需要調(diào)控熔融溫度時特別有用。用于與目標(biāo)分析物雜交的捕獲分子優(yōu)選具有0、1 或2個不同堿基。這是由于堿基堆積對穩(wěn)定的雜交來講很重要。捕獲分子的序列選擇取決于目標(biāo)分析物。因此根據(jù)所測定的不同分析物的數(shù)量可使用多于一種具有不同序列的捕獲分子。在一個實(shí)施方式中，捕獲分子來源于包含高危亞型和低危亞型HPV序列。根據(jù)本發(fā)明的示例性高危亞型序列例子包括但不局限于亞型16、18、沈、31、33、35、39、45、51、52、53、 56、58、59、66、68、70、73、82。根據(jù)本發(fā)明的示例性低危亞型序列的例子包括但不局限于亞型 6、11、40、42、43、44、54、61、72、81、CP108。在一個實(shí)施方式中，HPV 亞型包括 6、11、16、18、 31,45和51。在另一個實(shí)施方式中，HPV亞型包括16和18。另外，基于衛(wèi)生原因，如防止污染，本發(fā)明中的試條可被封于托架(盒子)中。本發(fā)明中的試條所用的托架可覆蓋除用于進(jìn)樣和落射熒光測定區(qū)域外的全部試條。在一個實(shí)施方式中使用了圖2(110)描述的一種示例性托架。另一方面，本發(fā)明提供了一種核酸檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括本發(fā)明中的任一種試條和用于檢測由固定捕獲分子且目標(biāo)分析物與其雜交的位置所發(fā)出的信號的落射熒光檢測
直ο所述系統(tǒng)可使用本領(lǐng)域中已知的落射熒光檢測裝置。通常，本系統(tǒng)所用的激光誘導(dǎo)落射熒光檢測裝置包含激光裝置、激發(fā)濾光片、橢圓形反射鏡或球面反射鏡、熒光控制裝置、準(zhǔn)直儀、熒光濾鏡和光檢測器?？捎糜诒鞠到y(tǒng)的檢測裝置的一個實(shí)例如圖2所述。參照圖2可解釋檢測和收集落射熒光的原理。激光裝置發(fā)出的入射光經(jīng)過激發(fā)濾光片被聚焦到橢圓反射鏡的第一焦點(diǎn)上，樣品/分析物也位于此處，而聚焦在橢圓反射鏡的第二焦點(diǎn)上的光被轉(zhuǎn)化為平行光，之后經(jīng)過熒光濾鏡到達(dá)聚光透鏡和光檢測器。光檢測器所檢測到的落射熒光通過模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器被傳送到CPU，在與標(biāo)準(zhǔn)熒光比較后可確定樣品中分析物的存在、不存在和/或量。在一個實(shí)施方式中，可用于本發(fā)明的檢測裝置包括但不限于 Boditech Med, Inc.(韓國)的 i_或 Biosite (美國)的裝置。另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明中所述的試條檢測樣品中的核酸的方法。該方法包括以下步驟將含有以熒光物質(zhì)或生物素標(biāo)記的目標(biāo)核酸序列的液體樣品涂布到本發(fā)明中試條的樣品墊上；使液體樣品流過層析介質(zhì)到達(dá)試條的吸收墊上，其中在試條的層析介質(zhì)上特定位置的捕獲物與樣品中的目標(biāo)核酸序列進(jìn)行序列特異性反應(yīng)以形成雜交體；和使用落射熒光檢測裝置檢測雜交體上的標(biāo)記物所發(fā)出的信號，此處信號的存在表明存在目標(biāo)核酸，或該信號用于量化樣品中目標(biāo)核酸的量。在一個實(shí)施方式中，捕獲分子含有來自于人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的核酸序列。本方法特別適用于樣品中DNA或RNA的序列特異性檢測。通常將整段DNA或RNA 從細(xì)胞和組織中提取出來，之后用PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA。之后將所擴(kuò)增的DNA涂布到在層析介質(zhì)上具有捕獲分子的本發(fā)明中的試條上，該捕獲分子的序列部分或整體與上述擴(kuò)充的序列互補(bǔ)。在反應(yīng)完成后使用落射熒光檢測裝置檢測信號。本發(fā)明中的方法十分靈敏，可用于檢測擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為5或更少的PCR產(chǎn)物。也可將直接來自于PCR的生物樣品作為模版使用而不需要對樣品中的核酸進(jìn)行前純化。如果需要對樣品中的核酸進(jìn)行前純化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇本領(lǐng)域中已知的各種方法來提取和純化DNA和RNA，也可使用商業(yè)產(chǎn)品和試劑盒。通常擴(kuò)增產(chǎn)物，即目標(biāo)分析物，作為單鏈?zhǔn)褂谩Ｄ繕?biāo)序列含有引物結(jié)合位。根據(jù)檢測的目的，測試的目標(biāo)序列可以各自不同。例如，當(dāng)該檢測是為了區(qū)分同一種病毒的各種不同亞型時，上述目標(biāo)序列需要選擇涵蓋包含對該病毒的每個亞型都具有特異性的序列的病毒基因組區(qū)域?？墒褂枚嘤谝粋€目標(biāo)序列以提高特異性和/或靈敏度。本領(lǐng)域中存在各種已知信息用來例如選擇病原體或毒素特異性序列。目標(biāo)分析物可直接或間接被標(biāo)記染料標(biāo)記。該標(biāo)記染料可以在涂布到試條之前加入到液體樣品中，也可以在擴(kuò)增過程中被結(jié)合。例如，可以擴(kuò)增或合成目標(biāo)序列以在其中包含熒光分子或可檢測基團(tuán)如生物素。在后一種情況中，該被生物素標(biāo)記的序列接著與帶有鏈親和素的顆粒反應(yīng)以作為檢測材料使用?？捎糜谠撃康牡谋绢I(lǐng)域已知的各類顆粒包括但不局限于，例如聚苯乙烯微球、乳膠顆粒、納米金顆粒、膠體金顆粒、金屬顆粒、磁性微粒、熒光微粒和半導(dǎo)體納米晶體。一旦所標(biāo)記的核酸被固定于層析介質(zhì)上的捕獲分子通過序列特異性雜交捕獲，該被染料標(biāo)記的核酸可以被適宜的本領(lǐng)域中已知設(shè)備檢測或讀取。需要時， 可以在對目標(biāo)序列的PCR擴(kuò)增過程中加入被檢測材料標(biāo)記的引物，該方法在本領(lǐng)域已知。 被擴(kuò)增或未被擴(kuò)增使用的核酸分子通過毛細(xì)作用從樣品墊的樣品涂布點(diǎn)中轉(zhuǎn)移，并流經(jīng)層析介質(zhì)，此處該分析物與被沉淀并固定在層析介質(zhì)上特定位置的捕獲分子進(jìn)行序列特異性雜交以形成分析物-捕獲物復(fù)合體。之后來自該復(fù)合體(雜交體)的信號被落射熒光檢測裝置檢測，該復(fù)合體的陽性信號表示樣品中存在目標(biāo)序列。本發(fā)明中的試條、系統(tǒng)和方法可用于例如區(qū)分一種病毒的各種不同亞型，或確定一種特定病原體的存在。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明中的試條、系統(tǒng)和方法可用于區(qū)分并鑒定HPV病毒的各種亞型。HPV是一種含有7900bp雙鏈DNA作為其基因組的病毒，在95%患有子宮頸癌的女性中被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為是誘發(fā)子宮頸癌的主要原因。至今已發(fā)現(xiàn)120種不同亞型，其中多于40種被發(fā)現(xiàn)與子宮頸癌相關(guān)，并被進(jìn)一步分類為高危型和低危型。高危型包括 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73 和 82，低危型包括HPV亞型6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108。它們都可被本試條、方法和/ 或系統(tǒng)檢測到。在高危型中，亞型16和18占據(jù)70-80%，其余20-30%被亞型31、33、35、 52和58占據(jù)。在少數(shù)情況下，HPV也可導(dǎo)致陰莖癌。(Gissmann L, Boshart M, Durst M, Ikenberg H, Wagner D, zur Hausen H. Presence of human papillomavirus in genital turners. J Invest Dermatol 1984 ；83 (Isuppl) :26S-8S ;de Villers EM. Heterogeneity of the human papillomavirus group. J Virol 1989 ；63 :4898-903 ；Lorincz AT,Reid R,
10Jenson AB, Greenberg MD, Lancaster W, Kurman RJ. Human papillomavirus infection of the cervix :relative risk association of 15common anogental types. Obstet Gynecol 1992；79 :328-37.)常見的子宮頸癌類型是腺癌和占所有病例的90-95%的鱗狀細(xì)胞癌(SSC)。通過各種方法如細(xì)胞學(xué)診斷、陰道鏡檢查或活檢來檢測SSC的癌前病變被認(rèn)為是核異質(zhì)(細(xì)胞核具有異常形狀)或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)。根據(jù)CIN的病變程度，其可被進(jìn)一步分為一其月、二其月禾口三其月(Mclndoe WA et al. Obstetrics and Gynaecology, October, 1984 ； 64(4) :451-458)。如本發(fā)明中實(shí)施例所述，本發(fā)明的試條、方法和系統(tǒng)可用于區(qū)分不同宮頸癌病變的不同HPV亞型。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明中的試條、方法和系統(tǒng)可用于鑒定和區(qū)分不同HPV亞型16和18。HPV感染需要盡快被檢測到，這不僅是為了預(yù)防子宮頸癌，也是為了癌癥治療中 /后的預(yù)后，因?yàn)榕缘淖訉m頸癌發(fā)病率較高而HPV被認(rèn)為是主要誘因。之前診斷子宮頸癌的方法包括細(xì)胞學(xué)檢測、陰道鏡檢查或活檢、檢測HPV蛋白的免疫學(xué)試驗(yàn)和HPV DNA 測試，其中由于其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性常使用HPV DNA測試(Duggan MA, Benoit幾， Mcgregor SE, Nation JG, Inoue Μ, Stuart GC. The human papillomavirus status of 114endocervical adenocarcinoma cases by dot-blot hybridization. Hum Pathol 1993 ；189 :12-9 ；Jane C. Sterling and Stephen K. Tying. Human Papillomavirus Clinical and scientific advances, ARNOLD, 2001 ；Schneider A, Zahm DM, Kirchmayr R, Schneider VL. Screening for cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3 validity of cytologic study, cervicography, and human papillomavirus detection. Am J Obstet Gynecol 1996 ；174 :1534-41 ；Cuzick J. Beverley Ε,Ηο L,Terry G,Snapper H, Mielzynska I, et al. HPV testing in primary screening of older women. Br J Cancer 1999;81:554-8.)。特別是細(xì)胞學(xué)檢測具有診斷的高假陰性率、低靈敏度和不準(zhǔn)確性的問題。以下表1比較了常用的DNA HPV測試。表 權(quán)利要求
1.一種用于定性和/或定量檢測樣品中核酸的橫向流試條，包括提供樣品涂布點(diǎn)的樣品墊；吸收墊；以允許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)姆绞轿挥谒鰳悠穳|和所述吸收墊之間的層析介質(zhì)，所述層析介質(zhì)包含至少一種捕獲分子，所述捕獲分子能夠與涂布到所述樣品墊上的所述樣品中的所述核酸進(jìn)行序列特異性雜交；和固相載體，支撐以相同平面位于所述固相載體上以容許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)乃鰧游鼋橘|(zhì)、所述樣品墊和所述吸收墊。
2.如權(quán)利要求1所述的試條，其中所述至少一種捕獲分子具有來自人類乳頭狀瘤病毒的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的試條，其中所述至少一種捕獲分子具有來自HPV亞型的序列， 所述 HPV 亞型選自由 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、 73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81 和 CP108 組成的組中。
4.如權(quán)利要求3所述試條，其中所述HPV亞型選自由6、11、16、18、31、45和51組成的組中。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試條，其中涂布到所述樣品墊上的所述核酸為聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的試條，其中所述PCR進(jìn)行1到10次循環(huán)。
7.如權(quán)利要求6所述的試條，其中所述PCR進(jìn)行1到5次循環(huán)。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的試條，其中涂布到所述樣品墊上的所述核酸用熒光材料或生物素標(biāo)記。
9.一種用于定性和/或定量鑒定樣品中的核酸的橫向流試條，包括提供樣品涂布點(diǎn)的樣品墊；吸收墊；以允許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)姆绞轿挥谒鰳悠穳|和所述吸收墊之間的層析介質(zhì)，所述層析介質(zhì)具有至少一種捕獲分子，所述捕獲分子能夠與涂布到所述樣品墊上的所述樣品中的所述核酸進(jìn)行序列特異性雜交；和固相載體，支撐以相同平面位于所述固相載體上以容許相互之間進(jìn)行毛細(xì)流動傳輸?shù)乃鰧游鼋橘|(zhì)、所述樣品墊和所述吸收墊，所述樣品中的所述核酸用熒光材料或生物素標(biāo)記，且為PCR產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求9所述的試條，其中所述PCR進(jìn)行1到10次循環(huán)。
11.如權(quán)利要求5所述的試條，其中所述PCR進(jìn)行1到5次PCR循環(huán)。
12.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的試條，其中所述至少一種捕獲分子具有來自人類乳頭狀瘤病毒的序列。
13.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的試條，其中所述至少一種捕獲分子具有來自 HPV 亞型的序列，所述 HPV 亞型選自由 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、 58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81 和 CP108 組成的組中。
14.如權(quán)利要求13所述的試條，其中所述HPV亞型選自由6、11、16、18、31、45和51組成的組中。
15.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的試條和用于檢測由所述捕獲分子存在的點(diǎn)發(fā)出的信號的落射熒光檢測裝置。
16.一種使用權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的試條對樣品中的核酸進(jìn)行定性和/或定量檢測的方法，所述方法包括以下步驟將含有以熒光素或生物素標(biāo)記的目標(biāo)核酸序列的液體樣品涂布到所述試條的樣品墊上；使所述液體樣品流到所述試條的吸收墊上，其中固定于所述試條的特定位置上的至少一個捕獲分子與所述目標(biāo)核酸序列進(jìn)行序列特異性反應(yīng)以形成雜交體；和使用落射熒光裝置檢測由所述雜交體上的標(biāo)記物發(fā)出的信號，其中所述信號的存在表明存在所述目標(biāo)核酸，或所述信號用于量化所述樣品中的所述目標(biāo)核酸的量。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述至少一種捕獲分子具有來自人類乳頭狀瘤病毒的序列。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述至少一種捕獲分子具有來自HPV亞型的序列， 所述 HPV 亞型選自由 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、 73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81 和 CP108 組成的組中。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述HPV亞型選自由6、11、16、18、31、45和51組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于對樣品中的核酸進(jìn)行分離和序列特異性檢測的試條，一種包含本發(fā)明中的試條和一種落射熒光裝置以對核酸進(jìn)行序列特異性檢測的系統(tǒng)，和一種使用該試條對核酸進(jìn)行定性和/或定量測定的方法。本發(fā)明中的試條、系統(tǒng)和方法容易使用，且由于其高靈敏度和特異性可在相對于常規(guī)檢測更短的分析時間內(nèi)提供精確和可靠的結(jié)果。
文檔編號G01N30/90GK102471807SQ201080036160
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者南基風(fēng), 崔義烈, 鄭東錫, 金成中 申請人:韓國帕克特生物科技有限公司