專利名稱：均相凝集免疫測(cè)定方法和用于這種方法的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于均相凝集測(cè)定的方法和用于這種方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
均相凝集測(cè)定通常被用于，通過采用在用于分析物檢測(cè)和定量的特異性免疫伴侶 (immunopartner)之間的結(jié)合反應(yīng)，來確定樣品中分析物的濃度。在這樣的測(cè)定中，由于聚集體形成而產(chǎn)生的凝集程度被測(cè)量并且被用作分析物計(jì)算的基礎(chǔ)。作為均相測(cè)定中的原則，將待分析的樣品與結(jié)合性伴侶相混合，并且在任選的溫育期后，直接測(cè)量在測(cè)定中的凝集情況，無需任何必需的分離步驟。通常，結(jié)合伴侶是對(duì)所關(guān)注的分析物具有特異性的抗體。合適的分析物必須暴露出兩個(gè)以上用于結(jié)合伴侶的均相或多相表位。當(dāng)然，如果抗體是所關(guān)注的分析物，也可以使用抗原作為結(jié)合伴侶。即使本發(fā)明不被具體限定，本發(fā)明也特別指向特定類型的凝集測(cè)定，該特定類型的凝集測(cè)定通常是指微粒增強(qiáng)的凝集測(cè)定。這些凝集測(cè)定法使用被用于所關(guān)注的分析物的結(jié)合伴侶所涂敷的微粒。通過例如形成抗體-抗原聚集體，所使用的結(jié)合伴侶能夠特異性地與所關(guān)注的分析物進(jìn)行反應(yīng)。通過例如在給定時(shí)間期間內(nèi)的比濁或者濁度測(cè)量法，能夠監(jiān)控在樣品中這種聚集體的形成(凝集)。被測(cè)量的凝集程度是樣品中分析物濃度的指示，并且可以通過使用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線而被確定。在一個(gè)典型的方法中，通過將用例如抗體涂覆的微粒加入至樣品/緩沖混合物中，來啟動(dòng)該測(cè)定。如果所關(guān)注的分析物存在于樣品中，則由于通過不同顆粒上的至少2個(gè)抗體與同一個(gè)分析物相結(jié)合而能夠使兩個(gè)以上顆粒被連接在一起，微粒的聚集將會(huì)發(fā)生。 通過使用某一波長的比濁或者濁度測(cè)量法，能夠進(jìn)行凝集的檢測(cè)，使用的波長的選擇取決于微粒的光散射特性。作為原則，波長大于微粒的平均直徑?；跇悠分袡z測(cè)的凝集性，利用校準(zhǔn)曲線計(jì)算出分析物濃度。已知的微粒凝集測(cè)定法的一個(gè)主要缺陷是它們的被限制的動(dòng)態(tài)范圍。術(shù)語“動(dòng)態(tài)范圍”應(yīng)該表示濃度范圍，在該范圍中測(cè)定產(chǎn)生精確的明確結(jié)果，尤其是在該范圍內(nèi)劑量反應(yīng)曲線是線性的。已知的測(cè)定法的正常動(dòng)態(tài)范圍，S卩，在檢測(cè)極限和測(cè)量上限之間的范圍，是兩個(gè)數(shù)量級(jí)。許多分析物，例如可提供僅兩個(gè)實(shí)施例的C反應(yīng)性蛋白0:rp)或者人絨毛膜促性腺激素(HCG)，能夠具有幾個(gè)數(shù)量級(jí)的樣品濃度，這意味著在一些情況中，測(cè)定必須重復(fù)或者必須分別進(jìn)行系列稀釋。在樣品含有高濃度分析物時(shí)，甚至能夠觀察到?jīng)]有發(fā)生凝集或者僅發(fā)生低程度凝集。如果這些被樣品充分稀釋，則將發(fā)生對(duì)應(yīng)于分析物濃度的凝集。在高分析物濃度下沒有凝集或者低程度凝集的現(xiàn)象被稱作前帶效應(yīng)或者“鉤狀效應(yīng)”，并且與如下事實(shí)有關(guān)例如，樣品中過量的抗原導(dǎo)致形成較小的抗體-抗原聚集體，其
4不會(huì)凝塊而形成可見的凝集。一般來講，可以說，與抗體相比，抗原的濃度越高，在樣品中觀察到的信號(hào)就越低，顯示出前帶效應(yīng)。當(dāng)提高抗原濃度超過抗體種群識(shí)別并結(jié)合的相對(duì)容量時(shí)，所造成的后果是，樣品中的凝集程度不再代表分析物的濃度，導(dǎo)致信號(hào)降低。這種效應(yīng)是動(dòng)態(tài)的，并且代表著反應(yīng)平衡從抗原-抗體聚集體形成到更高概率的非聚集性形成占優(yōu)勢(shì)的變化。已知的免疫測(cè)定方法提供了不同的方法來拓寬凝集測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍。美國專利6，248, 597公開了用于凝集測(cè)定的試劑，其包含兩個(gè)不同的微粒種群。 一個(gè)微粒種群具有相比另一個(gè)微粒種群更強(qiáng)的光散射特性，并且被額外地涂敷有結(jié)合伴侶，該結(jié)合伴侶相比涂覆到另一個(gè)微粒種群上的結(jié)合伴侶具有更高的朝向分析物的反應(yīng)性。根據(jù)US 6，M8，597，兩個(gè)微粒種群的混合物可提供更寬的動(dòng)態(tài)范圍。該顆粒用較高親合性的抗體涂敷，覆蓋測(cè)量范圍的敏感部分，而用較低親合性的抗體涂敷的顆粒提供可檢測(cè)的具有高分析物濃度的凝集。美國專利4，590，169描述了別的凝集測(cè)定。而且這種測(cè)定法用兩個(gè)不同類型的抗體進(jìn)行操作，這些抗體任選地被涂覆于不同類型的顆粒。這些抗體中的一種具有比另一種抗體低的對(duì)于分析物的親合常數(shù)，并且被提供的量可避免在高抗原濃度下的假陰性效應(yīng)。已知方法的缺陷是，它們需要在抗原上不同的表位，這些表位能夠在空間上容易接近。這不適用于所有的臨床分析物。另外，在已知的測(cè)定中對(duì)使用不同抗體的需求代表了一項(xiàng)缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于均相凝集免疫測(cè)定的方法，其與已知方法相比具有提高的動(dòng)態(tài)范圍，允許分析物的所有臨床相關(guān)濃度的測(cè)量，而沒有假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種試劑盒，其能夠被用于這種凝集測(cè)定。所述目的可通過權(quán)利要求1所述的方法和權(quán)利要求13所述的試劑盒得到理解。根據(jù)本發(fā)明的均相凝集免疫測(cè)定方法，要求將應(yīng)該檢查其內(nèi)可能含有的分析物的濃度的樣品與用于分析物的結(jié)合伴侶相混合，并且要么與至少一種離液劑相混合、要么與呈至少一種鹽形式的單價(jià)離子相混合，或者與具有權(quán)利要求1所限定濃度的至少一種離液劑和單價(jià)離子的組合物相混合。除非另外說明，所有濃度值指的是在用于測(cè)量法的測(cè)定樣 (測(cè)量用測(cè)定樣)中各個(gè)組分的濃度。
具體實(shí)施例方式為了便于更好地理解，參見表1中的值，其指的是通常用于免疫測(cè)定的尿素和 NaCl及它們的組合物于37°C下在緩沖液(Tris緩沖液，pH 7.4)中的溶解度。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，尿素是優(yōu)選使用的離液劑，NaCl是優(yōu)選使用的鹽。表1顯示了尿素的近似飽和濃度、NaCl的近似飽和濃度、以及尿素濃度與鹽濃度的不同組合中的一些配對(duì)數(shù)值，該組合中發(fā)生了飽和。表 權(quán)利要求
1.一種均相凝集免疫測(cè)定方法，其中(a)將可能含有待測(cè)分析物的樣品與下述物質(zhì)相混合-用于分析物的結(jié)合伴侶，和-至少一種離液劑，其中調(diào)節(jié)離液劑的濃度以使得在用于步驟(b)中測(cè)量的測(cè)定樣 (測(cè)量用測(cè)定樣)中的離液劑終濃度超過其于測(cè)量溫度下在測(cè)量用測(cè)定樣中的飽和濃度的 40%，或者-呈至少一種鹽形式的單價(jià)離子，其中調(diào)節(jié)鹽的濃度以使得鹽在測(cè)量用測(cè)定樣中的終濃度超過其于測(cè)量溫度下的飽和濃度的40%，或者-至少一種離液劑和呈至少一種鹽形式的單價(jià)離子的組合物，其中調(diào)節(jié)離液劑和鹽的濃度以使得組合物的終濃度超過于測(cè)量溫度下的飽和濃度的70%，(b)在反應(yīng)時(shí)間期間，測(cè)量至少一種與在測(cè)量用測(cè)定樣中的結(jié)合伴侶和分析物間的相互作用相關(guān)的信號(hào)，以及(c)由在步驟(b)中測(cè)得的至少一種信號(hào)計(jì)算出樣品中的分析物的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定是顆粒增強(qiáng)的測(cè)定，其中結(jié)合伴侶被固定在微顆粒上。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所選擇的顆粒的直徑優(yōu)選是在50nm 500nm之間。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用至少2個(gè)不同直徑的顆粒種群的混合物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述種群之一所包括的顆粒的直徑在 50nm IOOnm之間，而另一個(gè)種群所包含的顆粒的直徑在IOOnm 500nm之間，所述至少2 個(gè)種群的混合比率在1 99 99 1之間、優(yōu)選在20 80 80 20之間、并且最優(yōu)選在40 60 60 40之間。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述離液劑是尿素。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在結(jié)合伴侶和分析物之間的相互作用通過比濁技術(shù)確定。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，用于比濁法的波長處于450nm-800nm之間、 優(yōu)選在500nm-700nm之間。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合伴侶是抗體、優(yōu)選多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗體對(duì)分析物具有高親和性或親和力。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述樣品的混合包括下述步驟(al)提供第一試劑A，(a2)將樣品加入試劑A，以及(a3)加入含有用所述結(jié)合伴侶涂敷的顆粒的第二試劑B，得到測(cè)量用測(cè)定樣，其中或者試劑A、或者試劑B、或者兩者都含有離液劑，并且或者試劑A、或者試劑B、或者兩者都含有單價(jià)離子。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述離液劑和單價(jià)離子被包含在試劑A 中，而試劑B包含所述單價(jià)離子。
13.用于如權(quán)利要求11所述方法的試劑盒，其包括試劑A和試劑B。
全文摘要
一種均相凝集免疫測(cè)定方法，其中，將可能含有待測(cè)分析物的樣品與用于分析物的結(jié)合伴侶和至少一種離液劑、呈至少一種鹽形式的單價(jià)離子相混合，或者與至少一種離液劑和呈至少一種鹽形式的單價(jià)離子的組合物相混合，在反應(yīng)時(shí)間期間測(cè)量至少一種與結(jié)合伴侶和分析物的相互作用相關(guān)的信號(hào)，并且由測(cè)量的至少一種信號(hào)計(jì)算出樣品中的分析物濃度。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102395885SQ201080016290
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者馬丁·伯克哈特 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特生物醫(yī)學(xué)有限公司