專利名稱：一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其涉及一種蛋白質(zhì)芯片，具體來說是一種用于聯(lián)合 診斷三種吸蟲病的蛋白芯片。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)是九十年代中期興起的一種新型生物學技術(shù)，它基于生物大分子 (核酸、蛋白質(zhì)等)間相互作用的大規(guī)模并行分析方法，并結(jié)合微電子、微機械、化學、物理、 計算機等多領域的技術(shù)，將生命科學研究中所涉及的樣品反應、檢測、分析等過程連續(xù)化、 集成化、微型化，已成為當今生命科學研究領域發(fā)展最快的技術(shù)之一。生物芯片可以廣泛應 用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、法庭、軍事、科研等領域。不僅如此，由于生物芯片可同時檢測多種疾 病相關基因或蛋白，從而對遺傳病、腫瘤、傳染性疾病進行輔助診斷，所以它還具有重要的 臨床應用價值。生物芯片主要分為三大類核酸芯片、蛋白芯片和芯片實驗室。蛋白芯片是檢測蛋 白質(zhì)之間相互作用的生物芯片。蛋白芯片可通過發(fā)現(xiàn)體內(nèi)特定蛋白質(zhì)的含量變化，準確地 對生理/病理變化作出判斷。在臨床診斷領域，蛋白芯片具有廣泛的應用前景。隨著人們生活水平的不斷提高，對生鮮食品的不斷追求，我國食源性寄生蟲病例， 特別是華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病等，也在不斷攀升。另，局部疫區(qū)的血吸蟲病仍然很 嚴重，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人口的流動也越來越大，血吸蟲病人也漸漸分布在全國各地。因此， 對此這些吸蟲病的診斷顯得尤為重要。常規(guī)的對這幾種吸蟲的的診斷主要依靠臨床癥狀、 流行病史、實驗室檢查等進行綜合判斷。但往往有時同一器官或同一癥狀，均可這3種吸蟲 寄生引起，而在感染程度較輕時，不一定能從糞便中找到蟲卵進行確診鑒定。因此，研制一種可滿足快速、高效及高通量檢測要求的同時鑒別檢測三種吸蟲的 方法，對我們更好地控制此三種吸蟲病具有巨大推動作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，所述的這種用 于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測吸蟲病只能耽擱檢測，方法繁 瑣、檢測時間長的技術(shù)問題。本發(fā)明的這種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，由一個固相載體構(gòu)成，所述 的固相載體上固定有華支睪吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原，所述的華支睪吸 蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原呈矩陣式排列。具體的，所述的固相載體為硅片、載玻片或者尼龍膜。進一步的，所述的華支睪吸蟲抗原為華支睪吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白 片段或重組表達抗原。進一步的，衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原為衛(wèi)氏并殖吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片 段或重組表達抗原。
進一步的，所述的血吸蟲抗原為血吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重 組表達抗原。進一步的，所述的固相載體上還固定有陰性反應對照，所述的陰性反應對照物為 點樣的緩沖液。進一步的，所述的點樣的緩沖液為pH值在9. 0-10. 0之間的碳酸鹽緩沖液，具體為 NaHCO3-Na2CO3 緩沖液。進一步的，所述的固相載體上還固定有陽性反應對照，所述的陽性反應對照物為 羊抗人IgG或者羊抗人IgM。進一步的，所述的固相載體上還固定有質(zhì)量控制對照物，所述的質(zhì)量控制對照物 熒光素標記的羊抗人IgG或者熒光素標記的羊抗人IgM。進一步的，所述的熒光素標記物為異硫氰酸熒光素或花青類。本發(fā)明還提供了上述蛋白芯片的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟1)將有華支睪吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原探針分別溶于pH值為 9. 0-10. 0的碳酸鹽緩沖液中，然后用芯片自動點樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點制在固相載體上，點樣 密度為16-200點/cm2,點樣量為0. I-IOng/點；2) 2-8 °C放置過夜固定；3)用封閉液將蛋白芯片的未點樣部位封閉并凍干處理，2_8°C貯存?zhèn)溆?。進一步的，所述的封閉液中含有TBS溶液和質(zhì)量百分比為1-9%的蔗糖、質(zhì)量百分 比為1-9%的牛血清白蛋白(BSA)、質(zhì)量百分比為0.05-0. 2%的Tween 20、質(zhì)量百分比為 0. 05-0. 3%的酪氨酸、質(zhì)量百分比為0. 2-1% NaN3，其中TBS含有質(zhì)量百分比為0. 8-0. 9% NaCl和質(zhì)量百分比為1. 1-1. 5% Tris0本發(fā)明的原理是蛋白芯片是一種將大量的吸蟲抗原蛋白分子有規(guī)律地固定在某 種固相介質(zhì)上，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、酶和底物以及蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用進行 檢測分析的一項技術(shù)，是生物芯片的重要組成部分。該技術(shù)由芯片、樣品處理系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。首先將各種吸蟲的蛋白質(zhì) (抗原)有序地固定于載玻片、尼龍膜等各種載體上成為檢測用的芯片；待芯片固定好后， 用血清、抗體等待測樣品在芯片上進行孵育，清洗掉未結(jié)合的樣品；然后用標記了特定熒光 素的抗體或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結(jié)合的成分洗去， 再利用熒光掃描儀(芯片掃描儀)測定芯片上各點的熒光強度，從而達到檢測的目的。本發(fā)明的有益效果是操作簡便，每次反應約需1. 5_2h，僅需極少量抽一次血即 可準確地完成對華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和血吸蟲病的檢測，從而快速實現(xiàn)多指標 并行檢測三種重要吸蟲病，省去了傳統(tǒng)ELISA需要多次檢測才能獲得多指標結(jié)果的麻煩。


圖1是本發(fā)明的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白的芯片點陣結(jié)構(gòu)示意圖和 檢測結(jié)果顯示圖像。其中，a表示芯片點陣，其中QC表示質(zhì)量控制；NC表示陰性反應對照； PC表示陽性反應對照；1-3依次表示華支睪吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和血吸蟲抗原；b-d分別表 示檢測的華支睪吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和血吸蟲病人陽性血清^表示檢測的正常人血清；f 表示檢測的蛔蟲病人血清。
具體實施例方式以下實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。對實施例所涉及儀器的說明芯片點樣儀中國博奧生物有限公司，Personal Arrayer 16;芯片洗干儀中國博奧生物有限公司，Slider Washer 8 ；芯片掃描儀中國博奧生物有限公司，晶芯 LuxScan IOK ；實施例1以玻璃基片為固相載體經(jīng)過氨基化處理和壓穴處理后，利用Personal Arrayer 16芯片點樣儀把20nL平均濃度為0. 5-1. Omg/mL的華支睪吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和血吸蟲 等純化抗原點陣于該基片的同一反應腔室內(nèi)，點樣重復2次，點間的距離為0. 1-1. Omm,蛋 白質(zhì)通過化學鍵連接于固相載體上；點樣后，放置于濕盒中，以含BSA 5%的封閉液進行封 閉，晾干后放置于4°C冰箱保存即為蛋白芯片成品，點陣圖如圖Ia所示。進一步的，所述的華支睪吸蟲抗原為華支睪吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白 片段或重組表達抗原。進一步的，衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原為衛(wèi)氏并殖吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片 段或重組表達抗原。進一步的，所述的血吸蟲抗原為血吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重 組表達抗原。進一步的，所述的固相載體上還固定有陰性反應對照，所述的陰性反應對照物為 點樣的緩沖液。進一步的，所述的點樣的緩沖液為pH值在9. 0-10. 0之間的NaHCO3-Na2COdl沖液。進一步的，所述的固相載體上還固定有陽性反應對照，所述的陽性反應對照物為 羊抗人IgG或者羊抗人IgM。進一步的，所述的固相載體上還固定有質(zhì)量控制對照物，所述的質(zhì)量控制對照物 為熒光素標記的羊抗人IgG或者熒光素標記的羊抗人IgM。進一步的，所述的熒光素標記物為異硫氰酸熒光素或花青類。實施例2:一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片制備方法如下1)將華支睪吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和血吸蟲的純化抗原探針溶于pH值為9. 0-10. 0 的NaHCO3-Na2CO3緩沖液中，然后用芯片自動點樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點制在固相載體上，點樣密 度為16-200點/cm2,點樣量為0. I-IOng/點；2)4°C放置過夜固定；3)用封閉液將蛋白芯片的未點樣部位封閉并凍干處理，4°C貯存?zhèn)溆?。進一步的，所述的華支睪吸蟲抗原為華支睪吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白 片段或重組表達抗原。進一步的，衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原為衛(wèi)氏并殖吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片 段或重組表達抗原。進一步的，所述的血吸蟲抗原為血吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重組表達抗原。進一步的，所述的固相載體上還固定有陰性反應對照，所述的陰性反應對照物為 點樣的緩沖液。進一步的，所述的點樣的緩沖液為pH值在9. 0-10. 0之間的NaHCO3-Na2COdl沖液。進一步的，所述的固相載體上還固定有陽性反應對照，所述的陽性反應對照物為 羊抗人IgG或者羊抗人IgM。進一步的，所述的固相載體上還固定有質(zhì)量控制對照物，所述的質(zhì)量控制對照物 熒光素標記的羊抗人IgG或者熒光素標記的羊抗人IgM。進一步的，所述的熒光素標記物為異硫氰酸熒光素或花青類。進一步的，所述的封閉液中含有TBS溶液、質(zhì)量百分比為1-9%的蔗糖、質(zhì)量百分 比為1-9%的牛血清白蛋白(BSA)、質(zhì)量百分比為0.05-0. 2%的Tween 20、質(zhì)量百分比為
0.05-0. 3%的酪氨酸、質(zhì)量百分比為0. 2-1% NaN3，其中TBS含有質(zhì)量百分比為0. 8-0. 9% NaCl、質(zhì)量百分比為1. 1-1. 5% Tris0實施例3 一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片的使用方法，包括1)將結(jié)合了三種吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重組表達抗原(A)的 固相載體與被檢血清中特異抗體(B)接觸，使其充分反應形成穩(wěn)定的復合物A-B;2)用洗滌液洗去未結(jié)合的血清抗體，IOOOg離心Imin ；2)加入反應液，該穩(wěn)定的復合物A-B進一步與熒光素標記的羊抗人IgG/IgM(C)反 應液反應，形成穩(wěn)定復合物A-B-C-Iabelled ；3)用洗滌液洗掉未結(jié)合的反應液，IOOOg離心Imin ；4)進行信號檢測。進一步的，所述的反應液為異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC) 或花青類(cyanine，如Cy3、C0)標記的羊抗人IgG或者羊抗人IgM。進一步的，所述的稀釋液內(nèi)含質(zhì)量百分比為0.8-0.9的NaCl、質(zhì)量百分比為
1.1-1. 5% Tris、質(zhì)量百分比為0. 05-0. 2%的Tween 20、質(zhì)量百分比為0. 05-0. 3%的酪氨酸。進一步的，所述的洗滌液是Tris-HCl緩沖液，其中NaCl在洗滌液中的質(zhì)量百分比 為0.8-0.9%，Tris在洗滌液中的質(zhì)量百分比為1. 1-1. 5%,Tween 20在洗滌液中的質(zhì)量百 分比為 0. 05-0. 2%o實施例4 檢測時，在蛋白芯片每個反應腔室內(nèi)加入20-30UL用稀釋液100倍稀釋后的待檢 血清，37°C孵育30min后，在芯片洗干儀Slider WasherS中操作，用洗滌液漂洗3次，每次 5min, IOOOg離心Imin ；然后加入用稀釋液1000倍稀釋的Cy3標記的羊抗人IgG或者羊抗 人IgM反應液的20-30uL，37°C孵育30min，用洗滌液漂洗離心同上；最后在晶芯 LuxScan IOK芯片掃描儀中進行掃描和數(shù)據(jù)分析，依此獲得評判結(jié)果，在相應的點陣部位出現(xiàn)高信號 強度的即為感染此吸蟲病，如圖1所示b-d分別表示檢測的華支睪吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和 血吸蟲病人陽性血清^表示檢測的正常人血清；f表示檢測的蛔蟲病人血清。實施例5
檢測的具體過程是采集受試者外周血0. 5-lmL，離心分離血清；IuL待檢血清，用 稀釋液100倍稀釋后，取20-30UL加入實施例1的蛋白芯片反應孔，37°C孵育30min，洗滌液 漂洗3次，每次5min，IOOOg離心Imin ；然后加入用稀釋液1000倍稀釋的Cy3標記的羊抗 人IgG或者羊抗人IgM反應液的20-30uL，37°C孵育30min，用洗滌液漂洗離心同上；最后在 晶芯 LuxScan IOK芯片掃描儀中進行掃描和數(shù)據(jù)分析，依此判斷結(jié)果(如圖1所示)。
權(quán)利要求
1.一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，由一個固相載體構(gòu)成，其特征在于所 述的固相載體上固定有華支睪吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原，所述的華支睪 吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原呈矩陣式排列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的華支睪吸蟲抗原為華支睪吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重組表達抗原。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于衛(wèi)氏 并殖吸蟲抗原為衛(wèi)氏并殖吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重組表達抗原。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的血吸蟲抗原為血吸蟲粗抗原、純化后的天然抗原蛋白片段或重組表達抗原。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的固相載體上還固定有陰性反應對照，所述的陰性反應對照物為點樣的緩沖液。
6.如權(quán)利要求5所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的點樣的緩沖液為PH值在9. 0-10. 0之間的碳酸鹽緩沖液。
7.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的固相載體上還固定有陽性反應對照，所述的陽性反應對照物為羊抗人IgG或者羊抗人 IgM。
8.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的固相載體上還固定有質(zhì)量控制對照物，所述的質(zhì)量控制對照物為熒光素標記的羊抗人 IgG或者熒光素標記的羊抗人IgM。
9.如權(quán)利要求8所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，其特征在于所述 的熒光素標記物為異硫氰酸熒光素或花青類。
10.權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片的制備方法，其特征 在于包括如下步驟1)將有華支睪吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原探針分別溶于PH值為 9. 0-10.0的碳酸鹽緩沖液中，然后用芯片自動點樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點制在固相載體上，點樣 密度為16-200點/cm2,點樣量為0. I-IOng/點；2)2-8°C放置過夜固定；3)用封閉液將蛋白芯片的未點樣部位封閉并凍干處理，2-8°C貯存?zhèn)溆谩?br> 11.如權(quán)利要求1所述的一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片的制備方法，其特 征在于所述的封閉液中含有TBS溶液和質(zhì)量百分比為1-9%的蔗糖、質(zhì)量百分比為1-9% 的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比為0. 05-0. 2%的Tween 20、質(zhì)量百分比為0. 05-0. 3%的酪氨 酸、質(zhì)量百分比為0. 2-1% NaN3，其中TBS含有質(zhì)量百分比為0. 8-0. 9% NaCl和質(zhì)量百分比 為 1. 1-1. 5% Tris0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，屬于生物工程領域，本發(fā)明一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片，由一個固相載體構(gòu)成，所述的固相載體上固定有華支睪吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原和血吸蟲抗原。本發(fā)明還提供了一種用于聯(lián)合診斷三種吸蟲病的蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明的芯片靈敏度高、特異性強，操作簡便，一次反應可以同時診斷3種人體吸蟲病。
文檔編號G01N33/68GK102141569SQ20101059234
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者張永年, 張玲玲, 朱興全, 李 浩, 田利光, 艾琳, 蔡玉春, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所