專利名稱：靈敏檢測多種樣品中三聚氰胺的毛細管電泳在線富集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了采用簡單的樣品預處理方法聯(lián)用毛細管電 泳在線富集技術(shù)檢測奶粉、動物飼料等多種樣品中三聚氰胺的方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，由于三聚氰胺分子中 含有大量氮元素，不法分子為了虛假提高蛋白質(zhì)含量而在飼料以及乳制品中添加三聚氰胺 的現(xiàn)象是屢禁不止的，導致牛奶、蛋類等生活必需品可能含有超過限量值(雞蛋中的限量 值2. 5mg/kg，嬰幼兒配方乳粉中限量值lmg/kg，液態(tài)奶、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的 限量值2. 5mg/kg)。在2008年，中國有超過51900多個嬰幼兒因為食用了含有三聚氰胺的 配方奶粉而患上泌尿疾病。自2008年發(fā)生三聚氰胺乳品事件后，2010年出現(xiàn)了封存的超 過三聚氰胺臨時管理限量值乳粉回流市場的問題，三聚氰胺又引起公眾的強烈關(guān)注。研究 建立快速測定食品、乳制品中三聚氰胺含量的高靈敏分析方法，就具有十分重要的實際意 義和應(yīng)用價值。目前關(guān)于三聚氰胺測定方法有GC-MS、HPLC、LC-MS毛細管電動色譜法和 熒光光度法等方法。這些方法中，有的方法需要比較復雜的樣品預處理過程去除樣品中的 基質(zhì)影響和比較特殊的填充柱，有的方法的檢測靈敏度比較低。這些方法的檢測靈敏度在 10. 9 μ g/kg 和 0. 25mg/kg 之間。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種樣品預處 理手段簡單，檢測靈敏度高的毛細管電泳在線富集技術(shù)-陽離子耗盡進樣聯(lián)用膠束掃集 (CSEI-sweep MEKC)方法。本發(fā)明的目的通過下列的技術(shù)方案實現(xiàn)一種利用兩種在線富集技術(shù)(陽離子耗 盡進樣和膠束掃集)聯(lián)用的膠束毛細管電泳方法，該方法的檢測步驟如下(1)將三聚氰胺標準品溶解在20%甲醇水溶液中，配制成濃度為2. 000g/L的儲備 液，避光4°C保存。使用時根據(jù)需要稀釋成不同濃度的標準液。在普通的區(qū)帶毛細管電泳 (CZE)和陽離子耗盡進樣聯(lián)用膠束掃集的模式下，在最佳檢測條件下，對三聚氰胺的標準品 進行毛細管電泳分析，得到標準譜圖。(2)采用QE和CSEI-swe印MEKC方法在最佳檢測條件下，對樣品的提取液進行分 析，獲得樣品的毛細管電泳圖。(3)根據(jù)三聚氰胺的校正曲線方程，計算出步驟O)中不同樣品中三聚氰胺的含量。所述最佳檢測條件為CZE電泳條件壓力進樣3kPa，進樣時間15s，運行緩沖液20mmol/L磷酸二氫鈉 (NaH2PO4) 10% (體積分數(shù))甲醇(pH 2. 2)，三聚氰胺溶液(8mg/L)配制在運行緩沖液中。CSEI-sweep MEKC方法首先在毛細管內(nèi)充滿非膠束背景緩沖液(NBGE)，然后在毛細管中加壓注入一段水柱(30s，P = 3kPa)，樣品采用電動進樣(60s，20kV)，水柱提供的 高電場使樣品快速向出口端遷移，同時在電滲流的作用下水柱向進口端遷移，由進口排出。 樣品離子遷移到水和低PH背景電解質(zhì)的界面，背景電解質(zhì)的低電場降低了樣品的遷移速 度，形成一段樣品區(qū)帶。進樣完畢后進出口端均換上低PH膠束背景電解質(zhì)，在負壓(_18kV) 下，運用膠束掃集樣品區(qū)帶，使樣品區(qū)帶更窄。非膠束背景電解質(zhì)緩沖溶液(NBGE)的組 成為20mmol/L NaH2PO4 (ρΗ 2. 2)、10 % 甲醇(ν/ν)。樣品基質(zhì)為0. lmmol/L NaH2PO4(pH 2. 2)-20%乙腈。三聚氰胺溶液(0. 6mg/L)配制在樣品基質(zhì)中。運行緩沖液組成120mmol/ L SDS-20mmo 1/LNaH2PO4 (pH 2.2)-10% 甲醇(ν/ν)。步驟ο)中配方奶粉和動物飼料中三聚氰胺的樣品預處理過程按照以下步驟進 行分別稱取2. OOOg動物蛋白飼料和牛奶，加入3mL乙腈，超聲lOmin，以7000r/min離心 6min，吸出上清液，在下層沉渣中再加3mL乙腈，操作方法同上，反復提取三次，合并上清 液，并將其放入冰箱內(nèi)冷凍5min，取出后用普通濾紙過濾，然后用0. 45 μ m過濾膜過濾得樣 品溶液。所有溶液進入毛細管前均經(jīng)過0. 45 μ m過濾膜過濾，經(jīng)超聲脫氣后使用。對毛細管進行如下處理毛細管在使用時，分別用0. lmol/L HCI、超純水、0. lmol/L NaOH、超純水、非膠束 背景緩沖液沖洗lOmin。兩次MEKC樣品分析運行期間，分別用0. Imol/LNaOH、超純水、非膠 束背景緩沖液沖洗5min，以獲得良好的分離檢測重現(xiàn)性。在最佳的富集檢測條件下，三聚氰胺的富集倍數(shù)比普通區(qū)帶毛細管電泳法提高了 沈00倍。方法的線性范圍為2-1000 μ g/L，檢出限為0. 77yg/kg(S/N = 3)，遷移時間和峰 面積的相對標準偏差(RSD)分別小于5. 2^^Π3.5%。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明為多種樣品中 三聚氰胺的檢測提供技術(shù)支持；( 環(huán)境友好，經(jīng)濟環(huán)保，所用的緩沖液多為水相，無需消 耗大量的有機溶劑，比液相色譜更環(huán)保，更有利于檢測者的身體健康；C3)分析成本低，所 需樣品和溶劑都很少，檢測一個樣品消耗的緩沖溶液不到lmL，且不需要特殊的色譜柱，僅 使用普通的空心毛細管柱，價格比一般的色譜柱要低好幾倍，使用方便；(4)本發(fā)明所采用 的在線富集技術(shù)使三聚氰胺的檢測靈敏度提高了 3個數(shù)量級左右，遠遠低于一般常用的檢 測手段；(5)運用了電進樣方式，時樣品是通過電泳作用力引入到毛細管中的，在正向電壓 下，只有陽離子化合物才能進入毛細管中，而基質(zhì)中一些中性分子或者陰離子化合物就不 能進入毛細管中，從而能克服測量樣品中存在的一部分干擾，不需要采用常規(guī)的較為繁瑣 的預處理方法也可以達到靈敏的檢測效果


圖1為三聚氰胺標準品的CZE 2 為 CSEI-swe印 MEKC 3為空白配方奶粉樣品提取液4為加標的配方奶粉樣品提取液圖
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
所需的儀器裝置為CAPEL105高效毛細管電泳系統(tǒng)，配有紫外檢測器；未涂層石 英毛細管(φ75 μ mX65cm，有效長度50cm)。所需試劑三聚氰胺標準品，十二烷基硫酸鈉(SDS)，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，磷酸，乙腈，甲 醇，0. lmol/LHCl，0. Imol/LNaOH,超純水，所用緩沖液及樣品溶液均經(jīng)過0. 45 μ m過濾膜過 濾后使用。1)最佳檢測條件的確定(1)運行液和樣品基質(zhì)的配制用超純水分別配制濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液；a.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液，配制十二 烷基硫酸鈉濃度分別為30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L和120mmol/L的15mmol/L磷酸二氫 鈉-體積比10%甲醇緩沖液，用5mmol/L氫氧化鈉和磷酸調(diào)節(jié)pH為2. 2。b.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液，配制磷 酸二氫鈉濃度分別為 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L 和 30mmol/L 的 120mmol/L十二烷基硫酸鈉-體積比10%甲醇緩沖液，用5mmol/L氫氧化鈉和磷酸調(diào)節(jié)pH 為 2. 2。c.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4母液配制磷酸二氫鈉溶液濃度分別為0. 10、 0. 50,1. 00,2. 00,5. 00 和 10. OmmoVLNaH2PO4-體積比 20% 乙腈樣品基質(zhì)溶液，用 5mmol/L 氫氧化鈉和磷酸調(diào)節(jié)pH為2. 2。d.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4母液配制磷酸二氫鈉溶液濃度分別為5mmol/L、 10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L 和 30mmol/L NaH2PO4-體積比 10% 甲醇非膠束背 景緩沖溶液，用5mmol/L氫氧化鈉和磷酸調(diào)節(jié)pH為2. 2。(2)三聚氰胺標準品的配制準確稱取三聚氰胺標準品，用20%甲醇水溶液配制成濃度為2. 000g/L的儲備液。 避光4°C保存。使用時根據(jù)需要稀釋成不同濃度的標準液。(3)區(qū)帶毛細管電泳法檢測三聚氰胺將步驟O)中的三聚氰胺標準品進行區(qū)帶毛細管電泳法分析，在進樣壓力為 3kPa，進樣時間15s、檢測波長230nm，檢測溫度為20°C和條件下，在5mmOl/L-30mmOl/L之 間調(diào)節(jié)磷酸二氫鈉-體積比10%甲醇中磷酸二氫鈉的濃度，在體積百分含量為0-20%之 間調(diào)節(jié)甲醇-20mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液中甲醇的含量，在反向15_20kV之間調(diào)節(jié)分離電 壓。綜合峰形對稱、靈敏度高、重現(xiàn)性好等檢測條件為最佳檢測條件，獲得最佳區(qū)帶毛細管 電泳檢測三聚氰胺的條件為壓力進樣3kPa，進樣時間15s，運行緩沖液20mmol/L磷酸二 氫鈉(pH 2. 2) 10% (體積分數(shù))甲醇，三聚氰胺溶液(8mg/L)配制在運行緩沖液中，運行壓 力-20kV。(4)陽離子耗盡進樣-膠束掃集在線富集檢測三聚氰胺將步驟⑵中的三聚氰胺標準品進行陽離子耗盡進樣-膠束掃集，檢測波 長230nm，檢測溫度為20 °C和條件下，在5mmOl/L-30mmOl/L磷酸二氫鈉-體積比10 % 甲醇之間調(diào)節(jié)非膠束背景緩沖液中磷酸二氫鈉的濃度，在5mmOl/L-30mmOl/L磷酸二氫 鈉-90mmol/LSDS-體積比10%甲醇之間調(diào)節(jié)運行緩沖液中磷酸二氫鈉的濃度，在30mmol/
5L-120mmol/L之間調(diào)節(jié)SDS-15mmol/L磷酸二氫鈉-體積比10%甲醇運行緩沖液中SDS的 濃度，在體積百分含量為0-20%之間調(diào)節(jié)甲醇-20mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液中甲醇的含 量，在0. 10mmol/L-10. Ommol/L NaH2PO4-體積比20 %乙腈樣品基質(zhì)溶液中調(diào)節(jié)磷酸二氫 鈉的濃度，在10-50秒之間調(diào)節(jié)水塞進入時間，在30-80秒之間調(diào)節(jié)電動進樣時間，在反向 電壓15-25kV之間調(diào)節(jié)分離電壓。根據(jù)峰形對稱、靈敏度高、分析時間短、重現(xiàn)性好等條件 選擇了最佳富集檢測條件首先在毛細管內(nèi)充滿非膠束背景緩沖液(NBGE)，然后在毛細管 中加壓注入一段水柱(30s，P = 3kPa)，樣品采用電動進樣(60s，20kV)，進樣完畢后進出 口端均換上低PH膠束背景電解質(zhì)，在負壓(_18kV)下，運用膠束掃集樣品區(qū)帶。非膠束背 景電解質(zhì)緩沖溶液(NBGE)的組成為:20mmol/L NaH2PO4 (pH 2. 2)-10%甲醇(ν/ν)。樣品 基質(zhì)為0. ImmoVLNaH2PO4(pH2. 2)-20% 乙腈。運行緩沖液組成120mmol/L SDS-20mmol/ LNaH2PO4(pH 2. 2)-10% 甲醇(ν/ν)。2)三聚氰胺標準品的區(qū)帶毛細管電泳分析和陽離子耗盡進樣-膠束掃集將三聚氰胺標準品溶液，分別在在最佳C^E條件和CSEI-sweep MEKC下進行分析， 三聚氰胺的檢測靈敏度提高2600倍。電泳譜圖分別如圖1、圖2所示。3)校正曲線的制定將三聚氰胺標準品溶液分別稀釋為ΙΟΟΟμ g/L、500y g/L、100y g/L、25y g/L、 10μ g/L、5y g/L、2y g/L的三聚氰胺標準。在最佳檢測條件下，對上述系列標準溶液進行毛 細管電泳分析。以分析物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制校正曲線，獲得校正曲線方 程、線性相關(guān)系數(shù)，線性范圍和檢測下限如表1所示。表1三聚氰胺的線性范圍和檢出限Table !Linear range and detection limit of melamine
權(quán)利要求
1. 一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品中的三聚氰胺的方法， 其特征在于包括如下步驟(1)將三聚氰胺標準品溶解在20%甲醇水溶液中，配制成濃度為2.000g/L的儲備液。 避光4°C保存。使用時根據(jù)需要稀釋成不同濃度的標準液。在普通的區(qū)帶毛細管電泳(CZE) 和陽離子耗盡進樣聯(lián)用膠束掃集(CSEI-swe印MEKC)的模式下，在最佳檢測條件下，對三聚 氰胺的標準品進行毛細管電泳分析。得到標準譜圖。(2)采用QE和CSEI-sweepMEKC方法在最佳檢測條件下，對樣品的提取液進行分析， 獲得樣品的毛細管電泳圖。(3)根據(jù)三聚氰胺的校正曲線方程，計算出步驟O)中不同樣品中三聚氰胺的含量。 所述最佳檢測條件為CZE電泳條件壓力進樣3kPa，進樣時間15s，運行緩沖液20mmol/L磷酸二氫鈉(pH 2. 2)-10% (體積分數(shù))甲醇，三聚氰胺溶液(8mg/L)配制在運行緩沖液中。CSEI-sweep MEKC方法首先在毛細管內(nèi)充滿非膠束背景緩沖液(NBGE)，然后在毛細 管中加壓注入一段水柱(30s，P = 3kPa)，樣品采用電動進樣(60s，20kV)，水柱提供的高電 場使樣品快速向出口端遷移，同時在電滲流的作用下水柱向進口端遷移，由進口排出。樣 品離子遷移到水和低PH背景電解質(zhì)的界面，背景電解質(zhì)的低電場降低了樣品的遷移速度， 形成一段樣品區(qū)帶。進樣完畢后進出口端均換上低PH膠束背景電解質(zhì)，在負壓(_18kV) 下，運用膠束掃集樣品區(qū)帶，使樣品區(qū)帶更窄。非膠束背景電解質(zhì)緩沖溶液(NBGE)的組 成為20mmol/L NaH2PO4(pH 2. 2)、10 % 甲醇(ν/ν)。樣品基質(zhì)為0. lmmol/LNaH2P04(pH 2. 2)-20%乙腈。三聚氰胺溶液(0.6mg/L)配制在樣品基質(zhì)中。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品 中的三聚氰胺的方法，其特征在于步驟O)中配方奶粉、牛奶和動物飼料中三聚氰胺的樣 品預處理過程按照以下步驟進行分別稱取2. OOOg動物蛋白飼料、配方奶粉或牛奶3mL乙 腈，超聲lOmin，以7000r/min離心6min，吸出上清液，在下層沉渣中再加3mL乙腈，操作方 法同上，反復提取三次，合并上清液，并將其放入冰箱內(nèi)冷凍5min，取出后用普通濾紙過濾， 然后用0. 45 μ m過濾膜過濾得樣品溶液。所有溶液進入毛細管前均經(jīng)過0. 45 μ m過濾膜過 濾，經(jīng)超聲脫氣后使用。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品 中的三聚氰胺的方法，其特征在于對毛細管進行如下處理毛細管在使用時，分別用0. lmol/L HC1、超純水、0. Imol/LNaOH、超純水、非膠束背景緩 沖液沖洗lOmin。兩次MEKC樣品分析運行期間，分別用0. Imol/LNaOH、超純水、非膠束背景 緩沖液沖洗5min，以獲得良好的分離檢測重現(xiàn)性。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品 中的三聚氰胺的方法，其特征在于在最佳的富集檢測條件下，三聚氰胺的富集倍數(shù)比普通 區(qū)帶毛細管電泳法提高了沈00倍。方法的線性范圍為2-1000 μ g/L，檢出限為0. 77 μ g/ kg(S/N = 3)，遷移時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)分別小于5. 2%和3. 5%。
全文摘要
本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種靈敏檢測多種樣品中三聚氰胺的毛細管電泳方法。該方法通過兩種在線富集技術(shù)(陽離子耗盡進樣和膠束掃集)聯(lián)用測定三聚氰胺，使三聚氰胺的富集靈敏度與普通的區(qū)帶毛細管電泳相比提高了2600倍，檢出限降低為1.8μg/kg。本發(fā)明采用低電滲流下的電動進樣，對進入毛細管中的樣品有選擇性，受樣品基質(zhì)影響小，不需要如液相色譜等方法中復雜的樣品預處理過程，適用于多種樣品中三聚氰胺的檢測；靈敏度高，比已有的液相色譜、熒光光譜法的檢出限降低兩到三個數(shù)量級；所用的緩沖液主要是水溶液，無需大量使用有機溶劑，污染小，環(huán)境友好；所需溶劑和樣品用量小，使用的空心毛細管柱價格便宜，分析成本低。
文檔編號G01N1/40GK102121919SQ20101057971
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者劉瑛, 陳新 申請人:江南大學