專利名稱：：牛血清中分支桿菌抗體的elisa檢測方法及抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測方法及抗原，具體是一種牛血清中分支桿菌抗體的ELISA(利用結(jié)核分支桿菌分泌蛋白建立酶聯(lián)免疫吸附法)檢測方法及抗原。
背景技術(shù)：
：近年來，ELISA對結(jié)核病人血清中抗結(jié)核桿菌抗體進(jìn)行檢測，從而確定人體內(nèi)分支桿菌感染狀態(tài)。這種方法雖然取得了較為理想的效果，顯示出良好的應(yīng)用前景，但就目前而言，該方法在牛分支桿菌感染檢測方面還沒有很好的應(yīng)用。牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis)是引起人獸共患的慢性消耗性傳染病一_牛結(jié)核病的一種致病菌，可通過病畜傳染給人類或其他動(dòng)物，嚴(yán)重危害人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展并且導(dǎo)致很大的經(jīng)濟(jì)損失。至今，牛結(jié)核病所造成的損失大于牛的其他各種疾病所造成損失的總和。患牛結(jié)核病的奶牛是人結(jié)核病的重要傳染源?，F(xiàn)在控制人結(jié)核病的一種重要手段是對奶牛進(jìn)行牛分支桿菌感染檢測，然后對檢測出的陽性牛進(jìn)行隔離或捕殺。但是，由于牛分分支菌致病機(jī)制復(fù)雜，給其感染檢測造成很大的困難，使得牛結(jié)核病防制措施并未達(dá)到理想的效果，反而呈上升趨勢。目前，國內(nèi)外用于牛結(jié)核病的檢測方法，大體上可分為三大類第一類是細(xì)菌學(xué)檢查法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等；第二類是分子生物學(xué)方法，如核酸探針、PCR和DNA圖譜方法。雖然這些方法具有一定的靈敏度和特異性，但均需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且對實(shí)驗(yàn)條件要求很高，還不能夠用于基層的推廣；第三類是免疫學(xué)方法，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(PPD)、ELISA等方法。到目前為止，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0IE)推薦的唯一的牛結(jié)核病的診斷方法就是牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)(PPD)試驗(yàn)，該方法在牛結(jié)核病的診斷和防制過程中起到了重要作用，但是該方法還存在操作不方便、假陽性率高等弊端，除物理和化學(xué)的因素之外，更多的是非典型分支桿菌的干擾，常造成非特異性反應(yīng)的發(fā)生，其敏感性和特異性不高。與結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白一樣，牛分支桿菌的分泌蛋白是一類具有較強(qiáng)免疫原性和反應(yīng)原性的蛋白質(zhì)分子，能在感染的機(jī)體內(nèi)引起機(jī)體免疫反應(yīng)，包括誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。按照免疫學(xué)基本原理，只要用分泌蛋白建立檢測方法，檢測到牛血清中相應(yīng)抗體，就可以判定牛體內(nèi)的分支桿菌感染狀態(tài)?，F(xiàn)用的ELISA方法都是采用單個(gè)的牛分支桿菌分泌蛋白作抗原，建立ELISA方法，直接檢測牛血清中分支桿菌抗體，從而確定牛體內(nèi)分支桿菌感染狀態(tài)，但存在抗原識(shí)別位點(diǎn)較少，靈敏度不高的缺點(diǎn)。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未見與本發(fā)明的主題"牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法及抗原"有關(guān)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法及抗原。本發(fā)明的ELISA方法將牛分支桿菌兩個(gè)特異性分泌蛋白混合包被，增加了血清中抗分支桿菌抗體的識(shí)別抗原位點(diǎn)，其靈敏度高于單個(gè)包被抗原；實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的ELISA方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法，包括如下步驟步驟一，取氨基酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)作為抗原；步驟二，采用常規(guī)ELISA方法檢測牛血清，確定牛血清中有無分支桿菌抗體。步驟二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQIDNO:1的蛋白質(zhì)與氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)的包被濃度的比值為1:1。步驟二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQIDNO:1以及氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)的包被濃度均為6iig/ml。本發(fā)明還涉及一種抗原，所述抗原為兩種蛋白質(zhì)，所述蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述抗原，在牛血清中分支桿菌抗體的的ELISA檢測方法中使用。本發(fā)明中所涉及的大腸桿菌BL21(DE3)已在《劉芳，嚴(yán)懿嘉，朱建國，華修國，高謙。牛分枝桿菌Mbl761c蛋白的表達(dá)及其免疫原性初步研究[J]中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)。2008，30(11):875878》中公開；菌株(BL21(DE3))可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號(hào)航星商務(wù)樓1號(hào)樓606室。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明利用牛分支桿菌分泌蛋白Mbl761c(氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)和Mb2277(氨基酸序列如SEQIDNO:l所示)建立ELISA方法，進(jìn)而對牛血清中分支桿菌抗體進(jìn)行檢測；本發(fā)明的ELISA方法將牛分支桿菌兩個(gè)特異性分泌蛋白混合包被，增加了血清中抗分支桿菌抗體的識(shí)別抗原位點(diǎn)，其靈敏度高于單個(gè)包被抗原；實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的ELISA方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)。具體實(shí)施例方式本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例涉及的分泌蛋白Mb1761c和分泌蛋白Mb2277是通過以下方法獲得的根據(jù)GenBank提供的Mbl761c和Mb2277的基因序列設(shè)計(jì)引物，以Mycobacteriumbovis(標(biāo)準(zhǔn)菌株M.Bovis93006)的DNA為模板，通過PCR方法分別，擴(kuò)增出兩個(gè)目的基因Mbl761c和Mb2277，將兩個(gè)目的基因分別克隆到載體pET28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建成重組菌，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h表達(dá)后，利用Western-Blot對表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明兩個(gè)目的蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性；進(jìn)一步將500ml的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h表達(dá)后，通過Ni-NTA樹脂純化，收集10mmo1/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L咪唑洗脫液洗脫的結(jié)合的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE檢測驗(yàn)證，分別得到純化的兩個(gè)分泌蛋白Mbl761c和Mb2277。實(shí)施例1測定分泌蛋白Mbl761c的量將純化后的特異性分泌蛋白Mb1761c放入蔗糖中進(jìn)行濃縮，用紫外分光光度計(jì)測定得Mbl761c的0D260=0.315、0D280=0.118，按公式蛋白質(zhì)(mg/ml)=1.47X0D260-0.74X0D280計(jì)算Mbl761c的含量，結(jié)果為0.299mg/ml。(1)將分泌蛋白Mbl761c用0.1M的pH9.6為碳酸鈉包被液稀釋，使其終f農(nóng)度分另U為12ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、l.5ug/ml、0.75ug/ml，每孑L100u1，平行3孔，4t:包被過夜；(2)用PBST洗滌3次，洗去多余的抗原，拍干；l^明膠封閉，每孔200iil，37t:孵育1小時(shí)；(3)用PBST洗滌3次，拍干；陽、陰性血清分別以PBS作1:100、1:200、1:400稀釋，分別加入稀釋的陽性血清、陰性血清、空白對照100iU/每孔，37t:孵育1小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干；(4)將HRP-兔抗牛IgG用PBST按1:2000稀釋，每孔加入100iU，37。C孵育1小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干；(5)加入TMB顯色溶液，100ii1/每孑L顯色10分鐘；加入2M的H2S04終止反應(yīng)，每孔50ia，用酶標(biāo)儀檢測其在450nm處的0D值。經(jīng)比色測定選擇陽性孔OD值達(dá)到最大值的包被蛋白最大稀釋倍數(shù)為抗原的最佳包被濃度。表1為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由表1可知道，蛋白Mbl761c的最佳包被濃度為6ug/ml，血清最佳的稀釋比為1:200。表lMbl761c蛋白最適包被濃度和血清最適稀釋度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例2測定分泌蛋白Mb2277的量將純化后的分泌蛋白Mb2277放入蔗糖中進(jìn)行濃縮，用紫外分光光度計(jì)測定得Mb2277的0D260=0.3670D280=0.100，按公式蛋白質(zhì)(mg/ml)=1.47X0D260-0.74X0D280計(jì)算Mb2277的含量，結(jié)果為0.058mg/ml。表2Mb2277蛋白最適包被濃度和血清最適稀釋度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>最佳蛋白包被濃度和血清稀釋度的確定(1)將分泌蛋白Mb2277用0.1M的碳酸鈉pH9.6包被液稀釋，使其終濃度分別為12iig/ml、6iig/ml、3iig/ml、l.5iig/ml、0.75iig/ml，每孑L100ii1，平行3孑L，4。C包豐皮過夜；(2)用PBST洗滌3次，洗去多余的抗原，拍干；l^明膠封閉，每孔200iil，37t:孵育1小時(shí)；(3)用PBST洗滌3次，拍干；陽、陰性血清分別以PBS作1:100、1:200、1:400稀釋，分別加入稀釋的陽性血清、陰性血清、空白對照100iU/每孔，37t:孵育1小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干；(4)將HRP-兔抗牛IgG用PBST按1:2000稀釋，每孔加入100iU，37。C孵育1小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干。(5)加入TMB顯色溶液，100ii1/每孔，顯色10分鐘；加入2M的H2S04終止反應(yīng)，每孔50iU，用酶標(biāo)儀檢測其在450nm處的0D值。經(jīng)比色測定選擇陽性孔OD值達(dá)到最大值的包被蛋白最大稀釋倍數(shù)為抗原的最佳包被濃度。表2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由表2可知，蛋白Mb2277的最佳包被濃度為6ug/ml，血清最佳的稀釋比為1:200。實(shí)施例3兩種分泌蛋白混合的最佳配比的確定(1)取濃度均為6iig/ml的兩種分泌蛋白Mbl761c和Mb2277按照1:1，1:2，i:4，2:3，3:4，4:3，3:2，4:1，2:i的比例進(jìn)行混勻，分泌蛋白總量6yg/mi，加入微量反應(yīng)板，每孔lOOiU，平行3孔，4t:包被過夜；(2)用PBST洗滌3次，洗去多余的抗原，拍干；l^明膠封閉，每孔200iil，37t:孵育1小時(shí)；(3)用PBST洗滌3次，拍干；陽、陰性血清分別以PBS作1:100、1:200、1:400稀釋，分別加入稀釋的陽性血清、陰性血清、空白對照100iU/每孔，37t:孵育1小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干；(4)將HRP-兔抗牛IgG用PBST按1:2000稀釋后，每孔加入100iU，37。C孵育l小時(shí)；用PBST洗滌3次，拍干；(5)加入TMB顯色溶液，100ii1/每孔，顯色10分鐘；加入2M的H2S04終止反應(yīng)，每孔50iU，用酶標(biāo)儀檢測其在450nm處的0D值。經(jīng)比色測定選擇陽性孔OD值達(dá)到最大值的包被蛋白最大稀釋倍數(shù)為抗原的最佳包被濃度。表3兩種蛋白混合包被結(jié)果(一)Mbl761c蛋白濃度/Mb2277蛋白濃度Mbl761c1:11:21:42:33:4陽性血清1.002±0.0281.342±0.0491.020±0.0361.023±0.0110.921±0.0450.984±0.029陰性血清0.108±0.0160.091±0.0110.093±0.0130.087±0.0170.091±0.0270.078±0.017空白對昭"、、0.094±0.0090.083±0.0170.126±0.0190.078±0.0250.089±0.0240.092±0.014表3兩種蛋白混合包被結(jié)果(二)Mbl761c蛋白濃度/Mb2277蛋白濃度4:33:24:12:1Mb2277陽性血清1.035±0.915±0.996±1.017±1.050±0.0390.0210.0190.0470.0387陰性血清0.096±0.084±0.103±0.115±0.090±0.0180.0150.0220.0210.027空白對0.087±0.069±0.091±0.082±0.079±昭"、、0.0160.0160.0180.0150.0264、特異性實(shí)驗(yàn)將牛結(jié)核病陰性血清和奶牛乳房炎、牛副結(jié)核、牛附紅細(xì)胞體病、牛布氏桿菌病的陽性血清以PBS作1:200稀釋，利用間接ELISA方法進(jìn)行特異性檢測，0D，^臨界值(0.200)的判定為陽性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，由表4可知，結(jié)果全部為陰性，表明本實(shí)施例的ELISA方法具有良好的特異性。表4利用分泌抗原檢測1:200稀釋的其他病牛陽性血清的0D值牛結(jié)核病陽性血清牛結(jié)核病陽性血清牛副結(jié)核陽性血清牛附紅細(xì)胞體陽性血清牛布氏桿菌病陽性血清Mbl761c(6ug/ml)0.98±0.0120.18±0.1160.16±0.0260.17±0.0330.19±0.031Mb2277(6ug/ml)0.96±0.0130.08±0.0360.15±0.0260.15±0.0370.19±0.011Mbl761c與Mb2277混合(1:1)(6ug/ml)1.18±0.0160.19±0.0130.09±0.0230.16±0.0110.18±0.012序列表〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法及抗原〈130>10005〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>182〈212>PRT〈213>Mycobacteriumbovis〈400〉1MetAlaValGluSerSerMetLeuAlaLeuGlyThrProAlaProSer51015PheThrLeuProGinProAlaThrGlyAlaThrValSerLeuAspGlu202530LeuThrGlyProAlaLeuValValThrPhelieArgAsnHisCysPro354045TyrValGinHisValAlaAlaGlyLeuAlaThrLeuGlyArgAspLeu505560AlaAspGinGlyValProMetValGlylleSerSerAsnAspValVal65707580ThrTyrProGinAspGlyProAspGinMetValAlaGluAlaArgArg859095HisGlyTrpThrPheProTyrLeuTyrAspGluThrGinAspValAla100105110ArgAlaPheSerAlaAlaCysThrProAspThrPheValPheAspGly115120125GinArgArgLeuValTyrArgGlyGinLeuAspAspSerArgProGly130135140AsnGlyArgProValThrAlaAlaAspValArgAlaAlaValAspAla145150155160LeuLeuAlaGlyArgProValAsnProAspGinArgProSerlieGly165170175CysGlylieLysTrpArg180〈210>2〈211>167〈212>PRT〈213>Mycobacteriumbovis〈400>2MetSerGlyHisArgLysLysAlaMetLeuAlaLeuAlaAlaAlaSer151015LeuAlaAlaThrLeuAlaProAsnAlaValAlaAlaAlaGluProSer202530TrpAsnGlyGinTyrLeuValThrLeuSerAlaAsnAlaLysThrGly354045ThrSerMetAlaAlaAsnArgProGluTyrProHisLysAlaAsnTyr505560ThrPheSerSerArgCysAlaSerAspValCyslieAlaThrValVal65707580AspAlaProProProLysAsnGluPhelieProArgProlieGluTyr985ThrTrpAsnGlyThrGinTrp100CysLeuLeuProAspGlyThr115ThrAlaTyrThrProGlyGin130135ThrAsplieAlaSerGlyThr145150SerAlaProlieValGly1659095ValArgGlulieSerTrpGinTrpAsp105110lieGluTyrAlaProAlaLysSerlie120125TyrGlylieLeuThrGlyValPheHis140CysLysGlyAsnValAspMetProVal155160權(quán)利要求一種牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取氨基酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的蛋白質(zhì)作為抗原；步驟二，采用常規(guī)ELISA方法檢測牛血清，確定牛血清中有無分支桿菌抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法，其特征是，步驟二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQIDNO:1的蛋白質(zhì)與氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)的包被濃度的比值為1:1。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法，其特征是，步驟二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQIDNO:1以及氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的蛋白質(zhì)的包被濃度均為6iig/ml。4.一種抗原，其特征在于，所述抗原為兩種蛋白質(zhì)，所述蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。全文摘要一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的牛血清中分支桿菌抗體的ELISA檢測方法及抗原；所述ELISA檢測方法包括如下步驟步驟一，取氨基酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的蛋白質(zhì)作為抗原；步驟二，采用常規(guī)ELISA方法檢測牛血清，確定牛血清中有無分支桿菌抗體；本發(fā)明還涉及一種抗原，所述抗原為兩種蛋白質(zhì)，所述蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。本發(fā)明的ELISA方法將牛分支桿菌兩個(gè)特異性分泌蛋白混合包被，增加了血清中抗分支桿菌抗體的識(shí)別抗原位點(diǎn)，其靈敏度高于單個(gè)包被抗原；實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的ELISA方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)。文檔編號(hào)G01N33/53GK101750485SQ20101030083公開日2010年6月23日申請日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者劉芳,朱建國,林源申請人:上海交通大學(xué)