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同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法

文檔序號(hào):5878051閱讀:501來源:國(guó)知局
專利名稱:同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法
同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域,涉及一種同時(shí)檢測(cè)食品中13種氟喹諾酮 類藥物和3種氯霉素類藥物的方法和建立13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的液 質(zhì)譜庫(kù)的方法。
背景技術(shù)
氟喹諾酮(fluoroquinolones)是第三代喹諾酮類藥物,該類藥物對(duì)細(xì)菌的DNA螺 旋酶(DNA-gyrase)具有選擇性抑制作用,從而抑制細(xì)菌的DNA合成,導(dǎo)致DNA降解及死亡。 該類藥物抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透能力強(qiáng),抗菌作用是磺胺類的近千倍,可與第三代 頭孢類抗生素相媲美。對(duì)水產(chǎn)魚類的消化道及鰓細(xì)菌性疾病也有良好的防治作用,自八十 年代起成為治療魚類疾病的主要抗菌藥物,由于長(zhǎng)期使用氟喹諾酮抗生素易導(dǎo)致動(dòng)物群體 體內(nèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性,某些氟喹諾酮類化合物還可能有潛在的致癌作用,該類藥物在動(dòng) 物性食品中的殘留問題已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。我國(guó)以及世界衛(wèi)生組織、歐盟、美國(guó)、日 本等國(guó)家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物名單中,并制訂出相關(guān)的最 高殘留限量MRL。隨著國(guó)際間的技術(shù)壁壘的逐年增高,氟喹諾酮藥物的殘留限量迅速降低, 水產(chǎn)品行業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)正日益增加。在我國(guó),恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氟哌酸、氧氟沙星 等氟喹諾酮類藥物在蜂產(chǎn)品中的殘留量不得超過10 μ g/kg;美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)關(guān)于鯰魚中氟 喹諾酮的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為5ppb,但阿拉巴馬州和密西西比州作為美國(guó)鯰魚加工的主要地 區(qū),則規(guī)定鯰魚中不得檢出氟喹諾酮?dú)埩?,即“零限量”?biāo)準(zhǔn)。日本肯定列表規(guī)定,在蜂產(chǎn)品 中,恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星四種氟喹諾酮類藥物的限量均為 2. 5μ g/kg ;歐盟規(guī)定,恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星四種氟喹諾酮類藥物的限 量均為5μ g/kg ;美國(guó)和加拿大規(guī)定,氟喹諾酮類藥物為養(yǎng)蜂業(yè)禁用藥物,在蜂王漿中各種 氟喹諾酮類藥物MRL為5μ g/kg。日本2006年5月29日開始實(shí)施“肯定列表制度”后,除有 暫定標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)如雙氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸等外,其余沙星類藥物均按10 μ g/kg的“一 律標(biāo)準(zhǔn)”。06年廣東省出口日本烤鰻恩諾沙星超標(biāo)事件,07年美國(guó)、韓國(guó)對(duì)中國(guó)水產(chǎn)品氟喹 諾酮藥物預(yù)警事件等都對(duì)我國(guó)水產(chǎn)品行業(yè)造成重大損失,水產(chǎn)品中氟喹諾酮藥物的殘留問 題已成為制約我國(guó)水產(chǎn)品生產(chǎn)和出口的一個(gè)重要因素。氯霉素(Chloramphenicol,CAP),是廣譜抗生素,常用于預(yù)防與治療動(dòng)物疾病,在 水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)曾廣泛使用。氯霉素存在毒副作用,能抑制骨髓造血功能,引起再生障礙性 貧血、細(xì)胞減少性貧血、血小板減少和粒狀白細(xì)胞減少。作為蛋白質(zhì)合成抑制劑,會(huì)防礙紅 細(xì)胞的產(chǎn)生[1]。氯霉素使用對(duì)人類健康潛在的危害已引起國(guó)際組織和世界上許多國(guó)家 和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”(Zero tolerance),即不得檢出。甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol,F(xiàn)F) 與氯霉素同屬于一類化合物。人們已知甲砜霉素、氟甲砜霉素的毒性很低,甲砜霉素作為氯 霉素的可行替代品用于食用動(dòng)物已獲得公認(rèn)。氟甲砜霉素是最新合成的此類化合物,在治療那些已對(duì)其他抗菌素產(chǎn)生抗藥性的傳染病時(shí),氟甲砜霉素可作為氯霉素和甲砜霉素的一 種替代品。甲砜霉素的最大殘留限量MRL(maximumrequired limits)值為50 μ g/kg,氟甲 砜霉素的MRL值為100-3000 μ g/kg。氯霉素的最低要求執(zhí)行限MRPL(minimum required performance limit)值為 0.3yg/kgo目前氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物殘留的測(cè)定方法可以概括地劃分為微生物 抑制法、免疫分析技術(shù)、色譜分析技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。微生物抑制法是一種 價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的初篩方法。但這種方法在較低限量水平時(shí)不夠靈敏,且由于具備抑菌 作用的抗生素種類繁多,干擾因素較多,假陽(yáng)性較高。免疫分析技術(shù)靈敏度較高、快速簡(jiǎn)便, 但存在交叉反應(yīng)及假陽(yáng)性問題。色譜分析技術(shù)最常見的有采用熒光檢測(cè)的高效液相色譜 法,近年來,隨著液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,這種技術(shù)靈敏度高、定性準(zhǔn)確,可實(shí)現(xiàn)多 種物質(zhì)的同時(shí)定量與確證,越來越廣泛地應(yīng)用在了氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物殘留的 分析中。但該兩類化合物需要分別檢測(cè),且缺乏譜庫(kù)檢索,本發(fā)明選擇13種常見的氟喹諾 酮類藥物和3種氯霉素類藥物為研究對(duì)象,建立該兩類藥物的LC-MS/MS (液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用)譜庫(kù),并利用譜庫(kù)檢索建立水產(chǎn)品中同時(shí)檢測(cè)13種常見的氟喹諾酮類藥物和3種氯 霉素類藥物的快速LC-MS/MS (液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)篩選方法,這對(duì)保障我國(guó)水產(chǎn)品進(jìn)出 口安全具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方 法,同時(shí)提供了建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的液質(zhì)譜庫(kù)的方法,其中氟喹諾酮類 藥物為環(huán)丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘啶酸、諾氟沙星、 氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹,氯霉素類藥物為氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜 霉素。本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)13種氟喹諾酮類藥物的檢測(cè)限為0. 5ppb,3種氯霉素類藥物的 檢測(cè)限為0. Ippb,回收率大于80%。上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法,其特征在于,所述 方法按如下步驟進(jìn)行1)提取稱取樣品至離心管中,加入內(nèi)標(biāo)物溶液,再加入N,N-二甲基甲酰胺-乙 腈,經(jīng)均質(zhì)、水浴超聲、12000r/min離心后,吸取上清液,在45 50°C氮?dú)獗Wo(hù)下濃縮,再加 入水,于渦旋振蕩器振蕩,得提取液;2)凈化將所述提取液過HLB固相萃取小柱,先后以水、20%甲醇淋洗,棄去淋洗 液,抽干,用5%氨甲醇溶液洗脫,收集洗脫液于瓶,50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,上述殘?jiān)?0%乙 腈溶解,于渦旋振蕩器振蕩,過濾膜,得凈化液;3)將所述凈化液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,液相色譜條件31) C18色譜柱,xdb-c8保護(hù)柱,柱溫35°C,進(jìn)樣量10 μ L,流動(dòng)相流速0. 3mL/min, 流動(dòng)相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成,采用線性梯度流動(dòng)相洗脫;32)質(zhì)譜條件掃描方式正負(fù)掃描方式,離子源電噴霧離子源;霧化氣氮?dú)?,流?5mL/min ;氣簾氣氮?dú)?,流?0mL/min ;輔助加熱氣氮?dú)猓魉?0L/min,溫度700°C ;碰撞氣氮?dú)猓?流速5mL/min ;電離電壓5. 5kV ;監(jiān)測(cè)方式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè);通過多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行定量分 析;33)檢測(cè)模式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)一自動(dòng)信息關(guān)聯(lián)掃描一增強(qiáng)離子掃描一譜庫(kù)檢索。一種建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的譜庫(kù)的方法,其特征在于,所述方法 按如下步驟進(jìn)行1)將氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,液相色譜條件C18色譜柱,xdb-c8保護(hù)柱,柱溫35°C,進(jìn)樣量10 μ L,流動(dòng)相流速0. 3mL/min,流 動(dòng)相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成,采用線性梯度流動(dòng)相洗脫;質(zhì)譜條件掃描方式正負(fù)掃描方式,離子源電噴霧離子源;霧化氣氮?dú)?,流?5mL/min ; 氣簾氣氮?dú)?,流?0mL/min ;輔助加熱氣氮?dú)?,流?0L/min,溫度700°C ;碰撞氣氮?dú)猓?流速5mL/min ;電離電壓5. 5kV ;監(jiān)測(cè)方式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè);2)分別用高(30ev)、中(20ev)、低(IOev)三種碰撞能量對(duì)氟喹諾酮類藥物和氯霉 素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行EPI掃描,分別得出二級(jí)質(zhì)譜掃描圖,從而建立譜庫(kù)。本發(fā)明建立了 13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的液質(zhì)譜庫(kù)和LC-MS/MS 檢測(cè)方法,該前處理簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,結(jié)合本發(fā)明建立的液質(zhì)譜庫(kù),能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)13種氟喹 諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的快速定量定性分析,分析時(shí)間縮短了一倍,非常適合進(jìn) 出口快速確證工作。

圖1為本發(fā)明的檢測(cè)方法的示意圖;圖2為恩諾沙星陽(yáng)性可疑樣品重構(gòu)離子色譜圖;圖3為恩諾沙星陽(yáng)性可疑樣品EPI掃描圖;圖4為恩諾沙星陽(yáng)性可疑樣品譜庫(kù)檢索結(jié)果圖;圖5-20分別為環(huán)丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘 啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯 霉素的二級(jí)質(zhì)譜掃描圖; 圖21為13種沙星類藥物標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖;圖22為3種氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖;圖23A和圖23B為沙拉沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖24A和圖24B為二氟沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖25A和圖25B為氧氟沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖26A和圖26B為單諾沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖27A和圖27B為環(huán)丙沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖28A和圖28B為氟甲喹重兩組構(gòu)離子色譜圖;圖29A和圖29B為萘啶酸兩組重構(gòu)離子色譜圖30A和圖30B為氟甲砜霉素兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖31A和圖31B為甲砜霉素兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖32A和圖32B為氯霉素兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖33A和圖33B為麻保沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖34A和圖34B為恩諾沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖35A和圖35B為培氟沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖36A和圖36B為諾氟沙星重構(gòu)離子色譜圖;圖37A和圖37B為惡喹酸兩組重構(gòu)離子色譜圖;圖38A和圖38B為洛美沙星兩組重構(gòu)離子色譜圖。
具體實(shí)施方式本發(fā)明檢測(cè)方法主要是用來檢測(cè)食物中的13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類 藥物,其中,13種氟喹諾酮類藥物為環(huán)丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻 保沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹,3種氯霉素類藥 物為氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素。在本說明書中,二級(jí)質(zhì)譜掃描圖都是EPI掃描圖。[檢測(cè)過程]參見圖1本發(fā)明檢測(cè)方法包括以下步驟1、樣品處理提取準(zhǔn)確稱取5. Og樣品(準(zhǔn)確至0. Olg)至50mL離心管中,加入100 μ g/L的同 位素標(biāo)記的氯霉素內(nèi)標(biāo)(ChloramphenicoI-D5)溶液和1000 μ g/L的同位素標(biāo)記的環(huán)丙沙 星內(nèi)標(biāo)(Ciprofloxacin-D8)和1000 μ g/L的同位素標(biāo)記的諾氟沙星內(nèi)標(biāo)(Norfloxacin-D5) 混合溶液各20yL,再加入25mL N,N-二甲基甲酰胺-乙腈(2+8,V/V),均質(zhì)30s,水浴超聲 IOmin, 12000r/min高速離心5min ;吸取IOmL上清液,45 50°C氮?dú)鉂饪s至1ml,加入5mL 水,于渦旋振蕩器振蕩30s,待凈化。凈化將上述提取液以約1 2mL/min的流速全部過Oasis HLB(6ml,200mg)固相 萃取小柱,先后以6mL水、6mL 20%甲醇淋洗,棄去淋洗液,抽干,用6mL 5%氨甲醇溶液洗 脫,收集洗脫液于25mL雞心瓶,50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,上述殘?jiān)觢mL10%乙腈溶解,于渦旋 振蕩器振蕩lmin,過0. 22 μ m濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。2、液相色譜條件儀器設(shè)備=Agilent 1200液相色譜色譜柱YMCC18 2. 1 X 150mm, 3 μ m ;保護(hù)柱zorbax xdb_c8 2. 1 X 12. 5mm ;流動(dòng)相溶劑A是5mmol/L乙酸銨緩沖溶液,溶劑B是純乙腈;梯度洗脫在O至5min內(nèi),溶劑A體積分?jǐn)?shù)從95 %線性減少到55 %,溶劑B體積分 數(shù)相應(yīng)地從5%線性升到55% ;然后保持8min,在13. Imin時(shí)溶劑A的體積分?jǐn)?shù)改至95% 和溶劑B體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)地改至5%,并平衡7min ;流動(dòng)相流速0·3mL/min ;柱溫35°C ;柱溫是指柱溫箱的溫度,色譜柱和保護(hù)柱在柱溫箱里。進(jìn)樣量10μ L。
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3、質(zhì)譜條件儀器設(shè)備API4000QTrap掃描方式正負(fù)掃描方式監(jiān)測(cè)方式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源(Ion Source)電噴霧離子源(Electron spray Ionization ESI);霧化氣氮?dú)猓魉?5mL/min ;氣簾氣氮?dú)?,流?0mL/min ;輔助加熱氣氮?dú)?,流?0L/min,溫度700°C ;碰撞氣氮?dú)?,流?mL/min ;電離電壓5.5kV;16種物質(zhì)的MRM具體參數(shù)包括去簇電壓(declustering potential,DP)、碰撞能 (collision energy, CE)見表一。表一氟喹諾酮類藥物、氯霉素類藥物的質(zhì)譜參數(shù)
權(quán)利要求
一種同時(shí)檢測(cè)食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法,其特征在于,所述方法按如下步驟進(jìn)行1)提取稱取樣品至離心管中,加入內(nèi)標(biāo)物溶液,再加入N,N 二甲基甲酰胺 乙腈,經(jīng)均質(zhì)、水浴超聲、12000r/min離心后,吸取上清液,在45~50℃氮?dú)獗Wo(hù)下濃縮,再加入水,于渦旋振蕩器振蕩,得提取液;2)凈化將所述提取液過HLB固相萃取小柱,先后以水、20%甲醇淋洗,棄去淋洗液,抽干,用5%氨甲醇溶液洗脫,收集洗脫液于瓶,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,上述殘?jiān)?0%乙腈溶解,于渦旋振蕩器振蕩,過濾膜,得凈化液;3)將所述凈化液進(jìn)行液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,31)液相色譜條件C18色譜柱,xdb c8保護(hù)柱,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,流動(dòng)相流速0.3mL/min,流動(dòng)相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成,采用線性梯度流動(dòng)相洗脫;32)質(zhì)譜條件掃描方式正負(fù)掃描方式,離子源電噴霧離子源;霧化氣氮?dú)?,流?5mL/min;氣簾氣氮?dú)猓魉?0mL/min;輔助加熱氣氮?dú)?,流?0L/min,溫度700℃;碰撞氣氮?dú)?,流?mL/min;電離電壓5.5kV;監(jiān)測(cè)方式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè);33)檢測(cè)模式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)→自動(dòng)信息關(guān)聯(lián)掃描→增強(qiáng)離子掃描→譜庫(kù)檢索。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法,其特征在于,步驟1)中的內(nèi)標(biāo)物溶液具體為 100 μ g/L的同位素標(biāo)記的氯霉素內(nèi)標(biāo)Chloramphen Icol-D5溶液和1000 μ g/L的同位 素標(biāo)記的環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)CiprofloxaCin-D8和1000 μ g/L的同位素標(biāo)記的諾氟沙星內(nèi)標(biāo) Norfloxacin-D5 混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法,其特征在于,步驟3)中的線性梯度流動(dòng)相洗脫具 體為在O至5min內(nèi),乙酸銨緩沖溶液體積分?jǐn)?shù)從95%線性減少到55%,純乙腈體積分?jǐn)?shù) 相應(yīng)地從5%線性升到55% ;然后保持8min,在13. Imin時(shí)乙酸銨緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)改 至95%和純乙腈體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)地改至5%,并平衡7min。
4.一種建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的液質(zhì)譜庫(kù)的方法,其特征在于,所述方 法按如下步驟進(jìn)行1)將氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,液相色譜條件C18色譜柱,xdb-c8保護(hù)柱,柱溫35°C,進(jìn)樣量10 μ L,流動(dòng)相流速0. 3mL/min,流動(dòng)相 乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成,采用線性梯度流動(dòng)相洗脫;質(zhì)譜條件掃描方式正負(fù)掃描方式,離子源電噴霧離子源;霧化氣氮?dú)?,流?5mL/min ;氣簾 氣氮?dú)猓魉?0mL/min ;輔助加熱氣氮?dú)?,流?0L/min,溫度700°C ;碰撞氣氮?dú)?,流?5mL/min ;電離電壓5. 5kV ;監(jiān)測(cè)方式多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè);2)分別用30eV、20eV、IOev三種碰撞能量對(duì)氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品分 別進(jìn)行EPI掃描,分別得出二級(jí)質(zhì)譜掃描圖,從而建立液質(zhì)譜庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明建立了13種沙星類藥物和3種氯霉素類藥物的液質(zhì)譜庫(kù)和LC-MS/MS檢測(cè)方法,該前處理簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,結(jié)合本發(fā)明建立的液質(zhì)的譜庫(kù),能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)13種氟喹諾酮類藥物類藥物和3種氯霉素類藥物的快速定量定性分析,分析時(shí)間縮短了一倍,非常適合進(jìn)出口快速確證工作。
文檔編號(hào)G01N30/06GK101957348SQ20101028518
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者馮家望, 周新朋, 彭玉芬, 梁玉英, 蔡勤仁, 蔡杰, 薛良辰, 錢振杰 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局
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