專利名稱：檢測尿中安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物的柱切換lc-ms/ms分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測尿中安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物的柱切換LC-MS/MS分析方 法，具體涉及一種檢測尿樣中32種安眠鎮(zhèn)靜藥及其代謝物的柱切換LC-MS/MS分析方法。
背景技術(shù)：
安眠鎮(zhèn)靜藥物能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，引起鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥，主要用以治 療焦慮、失眠和驚厥，同時(shí)由于其藥理作用廣泛，是臨床治療中廣泛應(yīng)用且不可缺少的藥 物，自問世以來其用量不斷增加。但是，安眠鎮(zhèn)靜藥物可產(chǎn)生依賴，從而導(dǎo)致濫用，已成為全 球性藥物依賴問題。由于安眠鎮(zhèn)靜藥物品種多、易獲得、應(yīng)用廣，其危害性超過阿片類藥物。 目前常見的安眠鎮(zhèn)靜藥物口服量安全范圍大，與酒類飲料共用可增強(qiáng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑 制作用，其中，有些安眠鎮(zhèn)靜藥物還可能造成暫時(shí)性記憶缺失，因此，常被用于麻醉后搶劫、 強(qiáng)奸或致人昏睡后殺人，也有人因服用該類藥物導(dǎo)致交通肇事，或服用大量藥物自殺。安眠 鎮(zhèn)靜藥物具有用量少、代謝快、半衰期短等特點(diǎn)，在體內(nèi)組織和體液中濃度很低，絕大部分 轉(zhuǎn)變?yōu)榇x物并很快隨尿液排出體外，而司法鑒定中的受檢樣品通常是受檢人服藥數(shù)小時(shí) 后乃至數(shù)十小時(shí)后的尿液或血液，故安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物含量均較低，需要具備高靈 敏度的檢測方法。樣品前處理是生物樣品分析方法中非常重要的步驟，也是一個(gè)比較費(fèi)時(shí)、工作量 很大的過程。對于非揮發(fā)性化合物，液液提取和固相萃取是較常用的樣品前處理方法，目前 研究的方向是在如何減少樣品體積、縮短分析時(shí)間、降低成本、減少有機(jī)溶劑的使用體積、 提高自動(dòng)化程度等方面。樣品的在線前處理不僅增加了處理樣品的安全性，而且減少了人 為因素影響，提高了準(zhǔn)確度和精密度。鑒于氣相色譜儀對提取后的樣品要求苛刻，例如必須使用有機(jī)溶劑溶解樣品、進(jìn) 樣體積小、需要衍生化等，所以，液相色譜儀和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀更適于實(shí)現(xiàn)樣品在線前 處理。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)將高效液相色譜法HPLC的高分離性能和質(zhì)譜MS的高 選擇性、高靈敏度及豐富的結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合，使得樣品前處理簡便，不需衍生化步驟，分析 范圍廣，還可以直接分析不揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子化合物， 也可以分析復(fù)雜基質(zhì)體系中的待測物，已成為體內(nèi)毒(藥)物分析中強(qiáng)有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測尿中安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物的柱 切換LC-MS/MS分析方法，具體涉及一種檢測尿樣中32種安眠鎮(zhèn)靜藥及其代謝物的柱切換 LC-MS/MS分析方法。本發(fā)明通過儀器改裝，將柱切換技術(shù)與LC-MS/MS聯(lián)用，待測尿樣只需 簡單處理即可進(jìn)樣，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了分析時(shí)間，降低了成本，同時(shí)，本發(fā)明的柱切換 LC-MS/MS分析方法快速、靈敏、可靠，已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際案例的分析。本發(fā)明所述的柱切換LC-MS/MS分析方法，包括如下步驟
1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)為了實(shí)現(xiàn)柱切換，本發(fā)明的分析方法至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥 系統(tǒng)，所述系統(tǒng)具體包括十通切換閥1、四元梯度泵2、高壓二元泵3、進(jìn)樣器4、預(yù)處理柱5、 分析柱6和檢測器7。其中，十通切換閥1的接口⑤與四元梯度泵2連接；十通切換閥1的 接口⑩與高壓二元泵3通過進(jìn)樣器4連接；十通切換閥1的接口④、⑨分別與預(yù)處理柱5的 兩端相連；分析柱6的一端與十通切換閥1的接口⑧相連，另一端與檢測器7連接。所述四元梯度泵2為Waters Alliance 2695泵，高壓二元泵3為Watersl525泵， 檢測器7為Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜。所述的雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)的具體流路過程如下a.初始狀態(tài)1(參見

圖1)四元梯度泵2輸送分析流動(dòng)相，依次通過十通切換閥1 的接口⑤、⑥、⑦、⑧，進(jìn)入分析柱6;高壓二元泵3輸送預(yù)處理流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器4，通過十 通切換閥1的接口⑩、⑨，流入預(yù)處理柱5，即當(dāng)樣品通過進(jìn)樣器4進(jìn)樣時(shí)，預(yù)處理流動(dòng)相將 樣品帶入預(yù)處理柱5，樣品在預(yù)處理柱5上凈化和富集，廢液通過十通切換閥1接口④、③排 出；經(jīng)過預(yù)處理時(shí)間后，十通切換閥1切換為進(jìn)樣狀態(tài)II。b.進(jìn)樣狀態(tài)II (參見圖2)分析流動(dòng)相通過十通切換閥1的接口⑤、④進(jìn)入預(yù)處 理柱5并把樣品通過十通切換閥1的接口⑨、⑧，沖入分析柱6，并最終進(jìn)入到檢測器7中進(jìn) 行檢測。其中，在進(jìn)樣狀態(tài)II情況下，高壓二元泵3繼續(xù)持續(xù)不斷的輸送預(yù)處理流動(dòng)相，此 時(shí)十通切換閥1通過接口⑩、①、②、③直接將預(yù)處理流動(dòng)相排出；經(jīng)過切換時(shí)間后，十通切 換閥1切換成初始狀態(tài)I，平衡準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。2.液相色譜條件a.預(yù)處理柱型號Oasis HLB 25 μ m 2. 1 X 20mm (Waters 公司)預(yù)處理柱柱溫室溫預(yù)處理流動(dòng)相水流速1· OmL · mirT1預(yù)處理時(shí)間36s切換時(shí)間0·60-3. OOminb.分析柱型號Xterra MS C18 3. 5ym 2. ImmX 150mm(Waters 公司)分析柱柱溫35°C分析流動(dòng)相包括A和B，其中A為2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的水溶液(0. 126克甲 酸胺和500 μ L甲酸，加水至IOOOmL)，B為2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的乙腈(0. 126克甲酸 胺和500 μ L甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。流速0· 2mL · mirT1梯度流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。表1流動(dòng)相梯度洗脫條件
權(quán)利要求
一種檢測尿中安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物的柱切換LC MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步驟1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)所述系統(tǒng)包括十通切換閥(1)、四元梯度泵(2)、高壓二元泵(3)、進(jìn)樣器(4)、預(yù)處理柱(5)、分析柱(6)和檢測器(7)；其中，所述十通切換閥(1)的接口⑤與所述四元梯度泵(2)連接；所述十通切換閥(1)的接口⑩與所述高壓二元泵(3)通過所述進(jìn)樣器(4)連接；所述十通切換閥(1)的接口④、⑨與所述預(yù)處理柱(5)的兩端分別相連；所述分析柱(6)的一端與所述十通切換閥(1)的接口⑧相連，另一端與所述檢測器(7)連接；2)樣品處理取尿樣1.0mL加入50ng內(nèi)標(biāo)地西泮 D5混勻，高速離心16000rpm、5min，取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣；3)按設(shè)定的LC MS/MS條件分析樣品；4)結(jié)果分析根據(jù)色譜圖和回歸方程，計(jì)算各化合物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述四元梯度泵(2)為Waters Alliance 2695泵，所述高壓二元泵(3)為Waters 1525泵，所述檢測器(7)為Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色譜條件如下i)預(yù)處理柱柱溫室溫 預(yù)處理流動(dòng)相水 流速1. OmL · mirT1 預(yù)處理時(shí)間36s切換時(shí)間36s-3minii)分析柱柱溫35°C分析流動(dòng)相包括A和B，其中A為2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的水溶液，B為2mM甲酸胺 和0. 05%甲酸的乙腈 流速0. 2mL · mirT1iii)進(jìn)樣量100μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述MS條件如下 檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式正離子掃描 電噴霧電壓3200V 霧化氣流速N2600L/hr 錐孔反吹氣流速N250L/hr 離子源溫度105°C 碰撞氣氬氣 內(nèi)標(biāo)地西泮-D5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色譜采用流動(dòng)相梯度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的分析方法，其特征在于，所述安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代 謝物選白7_氨基硝基安定、哌唑嗪、7-氨基氯硝安定、唑匹坦、延胡索乙素、氯氮平、氟西泮、咪達(dá)唑侖、苯海拉明、多塞平、α-羥基咪達(dá)唑侖、苯海索、阿米替林、氯丙嗪、α-羥基三 唑侖、α -羥基阿普唑侖、卡馬西平、艾司唑侖、奧沙西泮、硝西泮、阿普唑 侖、勞拉西泮、三唑 侖、氯硝西泮、安眠酮、氟硝西泮、去甲基安定、羥基安定、異安定酮、甲基勞拉西泮、地西泮、 普拉西泮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測尿中安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物的柱切換LC-MS/MS分析方法，包括如下步驟1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)；2)按設(shè)定的LC-MS/MS條件分析樣品；3)結(jié)果分析。本發(fā)明方法對尿中各安眠鎮(zhèn)靜藥物或代謝物的檢測限為0.01～10ng·mL-1；線性范圍2～3個(gè)數(shù)量級，相關(guān)系數(shù)γ均在0.991以上，線性關(guān)系良好。本發(fā)明方法的待測尿樣只需簡單處理即可進(jìn)樣，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了分析時(shí)間，降低了成本。本發(fā)明的柱切換LC-MS/MS分析方法快速、靈敏、可靠，可以分析尿中的共32種常見安眠鎮(zhèn)靜藥物及其代謝物，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際案例分析中。
文檔編號G01N30/20GK101963602SQ20101027848
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者丁敏菊, 葉海英, 張潤生, 張玉榮, 梁晨, 汪蓉 申請人:上海市公安局刑事偵查總隊(duì)