專利名稱：一種基于uplc-ms技術(shù)診斷乙型肝炎的模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷乙型肝炎的模型，為乙型肝炎的診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎(hePatitis B)簡稱乙型肝炎、乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的傳染病。通過血液與體液傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。因其可能通過性生活傳播，國際上將其列入性傳播疾病。臨床表現(xiàn)多樣化，包括急性、慢性、淤膽型和重癥型肝炎，容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病例可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌。本病在中國廣泛流行，人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35%以上，HBsAg陽性率約為10-15%。是當(dāng)前危害人民健康最嚴(yán)重的傳染病。多見于兒童及青壯年。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化， 少數(shù)病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。代謝組學(xué)(metabonomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測(cè)技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別和專家系統(tǒng)等計(jì)算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。 UPLC-MS (超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)技術(shù)是代謝組學(xué)的分析技術(shù)之一。色譜主要是讓混合物由流動(dòng)相攜帶通過一根長長的內(nèi)壁涂有薄薄的一層液膜(液態(tài)固定相)的毛細(xì)柱。由于混合物的不同組分與固定相的結(jié)合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各個(gè)組分會(huì)逐個(gè)地洗脫出來而達(dá)到分離的目的。質(zhì)譜則是先將物質(zhì)離子化，變?yōu)闅鈶B(tài)離子混合物，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的。具有較高的靈敏度和專屬性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)化合物的同時(shí)快速分析與鑒定。本發(fā)明利用代謝組學(xué)中UPLC-MS這一技術(shù)，建立了一種可用于診斷乙型肝炎的模型，為乙型肝炎的診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用Waters ACQUITY UPLC-MS系統(tǒng)，檢測(cè)乙型肝炎患者和健康人血清的代謝物輪廓，利用軟件分析乙型肝炎與正常人血清中不同的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)新的乙型肝炎相關(guān)性有機(jī)物，用于診斷乙型肝炎。本發(fā)明將乙型肝炎和健康人血清分別利用Waters公司UPLC-MS系統(tǒng)上機(jī)檢測(cè)，得到原始數(shù)據(jù)，從機(jī)器附帶的質(zhì)譜庫中找出相匹配的化合物。采用峰面積歸一化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，數(shù)據(jù)校正后運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法計(jì)算每種化合物在不同組樣品中差異的顯著性，以P 值0. 05為閾值，判斷P值小于閾值的化合物為檢測(cè)含量有顯著性差異的化合物，篩選出在兩組中有顯著差異的Peak。然后進(jìn)行PCA分析，PCA是可以將分散在η維變量上的代謝指紋圖譜信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)(主成分)上的統(tǒng)計(jì)分析方法。通過這個(gè)分析可以初步判斷樣品之間的關(guān)系，并可以判斷是否有個(gè)別樣品的數(shù)據(jù)偏離較大而需要被剔除掉。最后確定出差異的標(biāo)志性代謝峰有3個(gè)，其質(zhì)荷比分別為m/Z203、m/Z250、m/Z996。利用這3種代謝物，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型的平均濃度逐一進(jìn)行比對(duì)，可為乙型肝炎的診斷提供指導(dǎo)。模型的檢測(cè)方法如下1.樣品采集分別采集乙型肝炎組和正常對(duì)照組外周靜脈血，離心后，取上清液置于_80°C保存2.色譜條件優(yōu)化包括色譜流動(dòng)相的選擇，流動(dòng)相梯度條件的優(yōu)化，以及色譜柱溫度和最佳流速的優(yōu)化，以達(dá)到最佳的分離效果。3.質(zhì)譜條件優(yōu)化包括離子源類型的選擇及其參數(shù)的設(shè)定，使得峰圖更加優(yōu)化。4.預(yù)實(shí)驗(yàn)及上樣檢測(cè)取預(yù)處理后的血清樣品注入進(jìn)樣孔，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的設(shè)置。5.測(cè)試報(bào)告的分析獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)校正后，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出含量明顯差異的物質(zhì)，運(yùn)用 PCA分析，將偏離較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到標(biāo)志性差異代謝物。


圖1三個(gè)峰在各樣本中的峰高灰色直線左側(cè)為正常組，灰色直線右側(cè)為乙型肝炎組。peak2. 78表示m/z250的代謝物，peak9. 526表示m/z996的代謝物，Peak2. 409表示m/z203的代謝物。圖2發(fā)現(xiàn)的三個(gè)特征峰對(duì)正常組(normal)和乙型肝炎組(hePatitis B)的分類圖中圓圈為正常組，棱形為乙型肝炎組。
具體實(shí)施例方式1.材料1. 1樣品采集分別使用抗凝管采集正常組和乙型肝炎組外周靜脈血anl，在4°C冰箱中靜置 30min后離心(4000rpm，5min).取200ul上清液分裝于低吸附離心管中，_80°C冰箱中保存，1. 2所需主要試劑與儀器甲醇、醋酸銨溶液、甲酸、丙酮等均購自上海化學(xué)試劑公司。ACQUITY UPLC-MS系統(tǒng)購自Waters公司。2.方法2.1高豐度蛋白的去除樣品室溫下融化，加入1. Oml的甲醇，渦旋混勻Imin后，超聲波萃取2min。形成的懸浮液再離心14000rpm，IOmin, 10°C。最后取200ul上清液分裝于LC-MS進(jìn)樣瓶中。2. 2樣品吹干
將進(jìn)樣瓶置于液氮吹干儀中吹干。2. 3預(yù)實(shí)驗(yàn)取20ul的樣品量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整相關(guān)系數(shù)，得到最佳的質(zhì)譜圖。2. 4正式實(shí)驗(yàn)將樣品一個(gè)一個(gè)地注入U(xiǎn)PLC-MS系統(tǒng)，打出圖譜，得到原始數(shù)據(jù)。2. 5數(shù)據(jù)分析對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，以0. 05的ρ值為閾值，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找出差異明顯的物質(zhì)，利用PCA分析，將偏差較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到3種標(biāo)志性差異代謝物分別為m/ Z203、m/Z250、m/Z996。利用這3種物質(zhì)，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型逐一進(jìn)行比對(duì)，可為乙型肝炎的診斷提供輔助指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)實(shí)例取受檢者血清，經(jīng)檢驗(yàn)得到其代謝產(chǎn)物圖譜，得到質(zhì)荷比分別為m/Z203、m/Z250、 m/z996的三種特異代謝物的峰高，與本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)應(yīng)樣品的平均峰高進(jìn)行比較，若峰高近似為本模型平均峰高的2倍，則為乙型肝炎組，否則為正常組。以上是對(duì)本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.用于乙型肝炎診斷的模型，其特征在于由超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)的代謝物圖譜，經(jīng)過軟件統(tǒng)計(jì)分析得到乙型肝炎患者多個(gè)特異代謝物的峰高，所說的特異代謝物的質(zhì)荷比分別為m/z203、m/z250、m/z996。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷乙型肝炎的模型。本發(fā)明運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，檢測(cè)正常人及乙型肝炎患者的外周血清樣品，找出與乙型肝炎患者差異顯著的特異代謝產(chǎn)物，根據(jù)正常人中三種特定代謝產(chǎn)物的峰高平均值，建立一個(gè)診斷模型。只要將檢測(cè)人血清中三種相應(yīng)的代謝產(chǎn)物的峰高與本發(fā)明的模型進(jìn)行比較分析，就可以初步用于乙型肝炎診斷。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102207496SQ20101025811
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者曾華宗 申請(qǐng)人:上海聚類生物科技有限公司