專利名稱：一種磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于熒光標(biāo)記細(xì)胞技術(shù)，具體說一種磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞 的方法。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末90年代初逐步建立并發(fā)展起來一門新興的技術(shù)，并 在21世紀(jì)得到了迅速發(fā)展。納米技術(shù)與生物技術(shù)、信息技術(shù)一起被看作是促進(jìn)21世紀(jì)發(fā)展 的三大重要技術(shù)。納米技術(shù)的應(yīng)用前景貫穿了從以原子、分子為主體的微觀領(lǐng)域、微觀與宏 觀的過渡區(qū)以及人類活動的宏觀世界。與此同時，納米尺度上的多學(xué)科交叉展現(xiàn)了納米技 術(shù)巨大的生命力，迅速成為一個有廣泛和潛在應(yīng)用前景的技術(shù)領(lǐng)域。1993年，國際納米科技 指導(dǎo)委員會將納米技術(shù)劃分為6個分支納米電子學(xué)、納米物理學(xué)、納米化學(xué)、納米加工學(xué)、 納米計(jì)量學(xué)和納米生物學(xué)。磁性熒光納米粒子不僅具有良好的超順磁性和表面易功能化等特點(diǎn)，而且利用熒 光可以定向識別并標(biāo)記目標(biāo)物質(zhì)。磁性熒光粒子表面引入如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等多種 反應(yīng)性功能基團(tuán)，還可以通過共價鍵結(jié)合配體，使其與生物受體特異性結(jié)合從而在熒光顯 微鏡下觀測其形態(tài)。目前，熒光標(biāo)記技術(shù)使用的熒光素是異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、德克薩斯紅、羅 丹明等?，F(xiàn)有技術(shù)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)Marsshall法，利用蛋白質(zhì)上的賴氨酸與熒光染料的N = C = S鍵結(jié)合形成復(fù)合物從而發(fā)出熒光?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是賴氨酸與熒光染料的N = C =S鍵結(jié)合反應(yīng)必須在pH8-9的堿性條件下進(jìn)行，一旦環(huán)境條件和pH值改變，熒光素很容 易從蛋白質(zhì)上解離下來，使得在熒光顯微鏡下難以準(zhǔn)確觀測其形態(tài)。因此發(fā)明一種利用磁性熒光納米粒子與生物受體結(jié)合，在中性條件下進(jìn)行熒光標(biāo) 記；保持熒光素長期穩(wěn)定的發(fā)光，提高標(biāo)記效率，使得在熒光顯微鏡下準(zhǔn)確觀察其形態(tài)的磁 性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法是十分重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用磁性熒光納米粒子與生物受體結(jié)合，在中性條件 下進(jìn)行熒光標(biāo)記；保持熒光素長期穩(wěn)定的發(fā)光，提高標(biāo)記效率；使得在熒光顯微鏡下準(zhǔn)確 觀察其形態(tài)的磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法，步驟如下(1)制備磁性熒光納米粒子復(fù)合物A稱取表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子，加入pH值6. 5-7. 5的磷酸緩沖液，超 聲分散5_15min ；B向步驟A產(chǎn)物中加入0. 1-0. 5mol/L的N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑；37°C孵 育 10-25min ；
C向步驟B產(chǎn)物加入0. 05-0. 5mol/L的Y -氨基丁酸溶液，37°C孵育10_20min ；D將步驟C產(chǎn)物加入磁場，依次用N，N- 二甲基甲酰胺和雙蒸水洗滌磁粒2遍；E將步驟D所得磁粒加入青霉素和鏈霉素混合液，-20°C保存?zhèn)溆茫?2)制備家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液A取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置5-8分鐘，浸入75%的酒精消毒；B將消毒過的家蠅，平放在表面皿上，切去頭，收集家蠅頭顱；C將家蠅頭顱置入pH6. 5-7. 5的磷酸緩沖液，制成家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液后通過80目篩，濾液備用；(3)磁性納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞A向家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液，加入配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液；置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15-30min ；B磁場下棄去清液，用pH6. 5-7. 5的磷酸緩沖液洗滌磁粒2次；C向上述磁粒加入pH6. 5-7. 5的磷酸PBS緩沖液、搖勻、制片、吹干，熒光顯微鏡下 觀察細(xì)胞形態(tài)。本發(fā)明的要點(diǎn)是制備磁性熒光納米粒子復(fù)合物，在中性條件下通過熒光標(biāo)記家蠅 神經(jīng)細(xì)胞表面的配體Y“氨基丁酸受體蛋白而標(biāo)記家蠅的神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明磁性熒光納米粒子復(fù)合物制備路線如下圖所示 首先在N，N- 二環(huán)己基碳酰亞胺DCC催化下氨基修飾的磁性熒光納米粒子與配體 Y “氨基丁酸GABA結(jié)合形成復(fù)合物；然后利用磁性熒光納米粒子復(fù)合物標(biāo)記并分離家蠅的神經(jīng)細(xì)胞；標(biāo)記過程在ρΗ =6. 5-7. 5的磷酸緩沖液媒介中進(jìn)行。本發(fā)明熒光標(biāo)記細(xì)胞的方法是通過熒光標(biāo)記細(xì)胞壁表面特定的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)對 整個細(xì)胞的熒光標(biāo)記。本發(fā)明使用的配體Y-氨基丁酸GABA的濃度為0.05-0. 5mol/L;N，N-二環(huán)己基碳 酰亞胺縮合劑DCC的濃度為0. 1-0. 5mol/L ；粒子孵育時間為10-30min。本發(fā)明向磁粒納米粒子加入青霉素和鏈霉素混合液，是為了安全無菌保存。本發(fā)明的特點(diǎn)在于
(1)本發(fā)明制備的磁性熒光納米粒子復(fù)合物表面經(jīng)氨基功能化后與γ-氨基丁酸 GABA配體結(jié)合，根據(jù)配體與生物受體特異性結(jié)合原理與家蠅神經(jīng)細(xì)胞表面的γ-氨基丁酸 GABA受體結(jié)合。(2)該熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)過程在中性條件下進(jìn)行。(3)該磁性熒光納米粒子復(fù)合物能特異性的結(jié)合分離表面帶有γ－氨基丁酸GABA 受體的家蠅的神經(jīng)細(xì)胞，分離效率高。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、中性條件熒光標(biāo)記，能保持熒光素長期穩(wěn)定發(fā)光；2、受體神經(jīng)細(xì)胞，分離效率高；3、提高標(biāo)記效率，熒光顯微鏡下形態(tài)觀察準(zhǔn)確。


圖1為明光狀態(tài)下磁性熒光納米粒子標(biāo)記的家蠅神經(jīng)細(xì)胞圖。圖2為熒光激發(fā)狀態(tài)下磁性熒光納米粒子標(biāo)記的家蠅神經(jīng)細(xì)胞圖。圖3是磁性熒光納米粒子復(fù)合物的原子力顯微鏡圖。圖4是磁性熒光納米粒子復(fù)合物的透射電鏡圖。圖5是磁性熒光納米粒子復(fù)合物的振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)測試結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。實(shí)施例1 制備氨基修飾的磁性熒光納米粒子復(fù)合物。稱取一定量的表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子MFNP-NH2,加少量pH = 7. 4的 磷酸PBS緩沖液，超聲分散5min后加入0. 2mol/L的N，N- 二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑DCC， 37°C孵育IOmin后，加入0. 2mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育15min后磁場 下依次用DMF和雙蒸水洗滌磁粒2遍；磁粒加青霉素和鏈霉素混合液，-20°C保存待用。取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置數(shù)分鐘后浸沒于75%的酒精中消毒，小心 將家蠅平放在表面皿上去頭。收集家蠅頭顱，往其中加入pH = 7. 4的磷酸PBS緩沖液，制 成懸液后通過80目的篩子，濾液待用。取家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液加少量配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15min，磁場下棄去清夜，用pH =7.4的磷酸PBS緩 沖液洗滌磁粒2次后加少量磷酸PBS緩沖液，搖勻，制片，吹干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形 態(tài)，見圖1。結(jié)果顯示表面有γ－氨基丁酸溶液GABA受體的家蠅的神經(jīng)細(xì)胞被磁性熒光納米 粒子分離并標(biāo)記出來，明光下未見有未標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞，見圖1 ；表明分離標(biāo)記概率為100%。 在熒光顯微鏡下可見與MNFP結(jié)合的神經(jīng)細(xì)胞因粒子中含有紅色熒光素而顯示紅色。見圖 2 ；被標(biāo)記出來的細(xì)胞形態(tài)上為神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞輪廓清楚，能看到明顯的神經(jīng)細(xì)胞軸突結(jié) 構(gòu)。實(shí)施例2:
稱取一定量的表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 6. 8 的磷酸PBS緩沖液，超聲分散15min后加入0. 5mol/L的隊(duì)^二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑00， 37°C孵育20min后加入0. 5mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁場 下依次用DMF和雙蒸水洗滌磁粒。磁粒加青霉素和鏈霉素混合液，_20°C保存待用。取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置數(shù)分鐘后浸沒于75%的酒精中消毒，小心 將家蠅平放在表面皿上去頭。收集家蠅頭顱，往其中加入pH = 7. 0的磷酸PBS緩沖液，制成懸液后通過80目的篩子，濾液待用。
取家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液加少量配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20min，磁場下棄去清夜，用pH =7.0的磷酸PBS緩 沖液洗滌磁粒3次后，加少量磷酸PBS緩沖液，搖勻，制片，吹干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形 態(tài)。分離效率80%。實(shí)施例3 稱取一定量的表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 7. 5 的磷酸PBS緩沖液，超聲分散15min后加入0. lmol/L的N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑DCC， 37°C孵育25min后加入0. 5mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育IOmin后磁場 下依次用N，N- 二甲基甲酰胺和雙蒸水洗滌磁粒。磁粒加青霉素和鏈霉素混合液，-20°C保 存待用。取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置數(shù)分鐘后浸沒于75%的酒精中消毒，小心 將家蠅平放在表面皿上去頭。收集家蠅頭顱，往其中加入pH = 7. 5的磷酸PBS緩沖液，制 成懸液后通過80目的篩子，濾液待用。取家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液加少量配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，磁場下棄去清夜，用pH = 7. 5的磷酸PBS緩 沖液洗滌磁粒3次后加少量磷酸PBS緩沖液，搖勻，制片，吹干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形 態(tài)。分離效率90%。實(shí)施例4 稱取一定量的表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 6. 5 的磷酸PBS緩沖液，超聲分散15min后加入0. 3mol/L的N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑DCC， 37°C孵育20min后加入0. lmol/L的Y -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁場 下依次用N，N- 二甲基甲酰胺和雙蒸水洗滌磁粒。磁粒加青霉素和鏈霉素混合液，-20°C保 存待用。取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置數(shù)分鐘后浸沒于75%的酒精中消毒，小心 將家蠅平放在表面皿上去頭。收集家蠅頭顱，往其中加入pH = 6. 5的磷酸PBS緩沖液，制 成懸液后通過80目的篩子，濾液待用。取家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液加少量配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，磁場下棄去清夜，用pH-6. 5的磷酸PBS緩沖液 洗滌磁粒2次后，加少量磷酸PBS緩沖液，搖勻，制片，吹干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 分離效率90%。實(shí)施例5 稱取一定量的表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 7. 2的磷酸PBS緩沖液，超聲分散15min后加入0. 2mol/L的N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑DCC， 37°C孵育15min后加入0. 05mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁場 下依次用DMF和雙蒸水洗滌磁粒。磁粒加青霉素和鏈霉素混合液，_20°C保存待用。取活的家蠅成蟲，置于4°C冰箱中放置數(shù)分鐘后浸沒于75%的酒精中消毒，小心 將家蠅平放在表面皿上去頭。收集家蠅頭顱，往其中加入pH = 7. 2的磷酸PBS緩沖液，制 成懸液后通過80目的篩子，濾液待用。取家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液加少量配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物雙抗懸濁液，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20min，磁場下棄去清夜，用pH = 7. 2的磷酸PBS緩 沖液洗滌磁粒3次后加少量磷酸PBS緩沖液，搖勻，制片，吹干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形 態(tài)；分離效率88%。實(shí)施例6 實(shí)施效果經(jīng)過實(shí)施例1中幾個步驟進(jìn)行處理的配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物復(fù)合物，經(jīng) 過原子力顯微鏡和透射電鏡觀察，測定磁性熒光納米球的粒徑相對均勻，粒子表面光潔，可 作為載體和探針用于研究；見圖3、圖4。實(shí)施例7 實(shí)施效果經(jīng)過實(shí)施例3中幾個步驟進(jìn)行處理的配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物復(fù)合物，經(jīng) 過振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)測試，磁相應(yīng)良好，可用于磁分離。見圖5。實(shí)施例8 實(shí)施效果經(jīng)過實(shí)施例4中幾個步驟進(jìn)行處理的配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物復(fù)合物，經(jīng) 過振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)測試，磁相應(yīng)良好，可用于磁分離。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn) 等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法，步驟如下(1)制備磁性熒光納米粒子復(fù)合物A 稱取表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子，加入pH值6.5-7.5的磷酸緩沖液，超聲分散5-15min；B 向步驟A產(chǎn)物中加入0.1-0.5mol/L的N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺縮合劑；37℃孵育10-25min；C 向步驟B產(chǎn)物加入0.05-0.5mol/L的γ-氨基丁酸溶液，37℃孵育10-20min；D 將步驟C產(chǎn)物加入磁場，依次用N，N-二甲基甲酰胺和雙蒸水洗滌磁粒2遍；E 將步驟D所得磁粒加入青霉素和鏈霉素混合液，-20℃保存?zhèn)溆茫?2)制備家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液A 取活的家蠅成蟲，置于4℃冰箱中放置5-8分鐘，浸入75％的酒精消毒；B 將消毒過的家蠅，平放在表面皿上，切去頭，收集家蠅頭顱；C 將家蠅頭顱置入pH6.5-7.5的磷酸緩沖液，制成家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液后通過80目篩，濾液備用；(3)磁性納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞A向家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液，加入連有配體的磁性熒光納米粒子復(fù)合物的雙抗懸濁液；置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育15-30min；B磁場下棄去清液，用pH6.5-7.5的磷酸緩沖液洗滌磁粒2次；C向上述磁粒加入pH6.5-7.5的磷酸PBS緩沖液、搖勻、制片、吹干，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明屬于熒光標(biāo)記細(xì)胞技術(shù)，一種磁性熒光納米粒子標(biāo)記家蠅神經(jīng)細(xì)胞的方法?，F(xiàn)有熒光標(biāo)記技術(shù)的缺點(diǎn)是熒光素很容易從蛋白質(zhì)上解離下來，使得熒光顯微鏡下難以準(zhǔn)確觀測其形態(tài)。本發(fā)明方法如下制備磁性熒光納米粒子復(fù)合物；制備家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液取活的家蠅成蟲，浸入75％的酒精消毒；將家蠅切去頭；放入pH中性磷酸緩沖液，制成家蠅神經(jīng)細(xì)胞懸液，通過80目篩，濾液備用；加入雙抗懸濁液；置于培養(yǎng)箱中孵育15-30min；洗滌磁粒；加入磷酸緩沖液、搖勻、制片、吹干，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能保持熒光素長期穩(wěn)定發(fā)光；受體神經(jīng)細(xì)胞分離效率高；熒光顯微鏡下形態(tài)觀察準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/533GK101858908SQ20101017985
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者任天瑞, 周健, 李興玉 申請人:上海師范大學(xué)