專利名稱：：棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物保護(hù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：盲蝽蟓是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，在我國(guó)主要有綠盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Diir)、中黑盲蟲(chóng)春(AdelphocorissuturalisJakovlev)、苜猜盲蟲(chóng)春(AdelphocorislineolatusGoeze)、三點(diǎn)盲蟲(chóng)春(AdelphocorisfasciaticollisReuter)與牧草盲蟲(chóng)春(LyguspratensisL.)等幾種。20世紀(jì)后半葉，我國(guó)棉田盲蝽蟓的發(fā)生數(shù)量很低，其一直作為棉鈴蟲(chóng)(HelicoverpaarmigeraHiibner)化學(xué)防治的兼治對(duì)象進(jìn)行控制。90年代末，我國(guó)開(kāi)始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)Bt基因棉，棉鈴蟲(chóng)得到了有效控制，但是作為棉田次要害蟲(chóng)的盲蝽蟓的發(fā)生數(shù)量卻急劇增加、危害加重，成為當(dāng)前轉(zhuǎn)Bt棉上的主要害蟲(chóng)。而且不僅是棉田，盲蝽蟓種群暴發(fā)還波及到其他農(nóng)業(yè)作物，近年來(lái)盲蝽蟓對(duì)棗、葡萄、櫻桃、茶樹(shù)等的危害日益嚴(yán)重。由于我國(guó)盲蝽蟓的研究基礎(chǔ)比較薄弱，其防治技術(shù)體系也不太完善，目前，只能以化學(xué)防治為主。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近幾年在一些蟲(chóng)害嚴(yán)重地區(qū)每年為防治盲蝽蟓而施用化學(xué)農(nóng)藥20余次，出現(xiàn)了與90年代防治棉鈴蟲(chóng)類似的現(xiàn)象。植物抗蟲(chóng)性的利用一直被譽(yù)為最有效、最經(jīng)濟(jì)的害蟲(chóng)治理策略，其已在多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防控中發(fā)揮了重要的作用。目前，對(duì)棉花抗蟲(chóng)機(jī)制的研究主要集中在生化抗性和物理抗性的研究方面。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)和較為明確的抗蟲(chóng)活性生化物質(zhì)有萜烯類化合物(如棉酚)、黃酮類化合物(如蕓香苷)和單寧類化合物等3類次生物質(zhì)。1978年Chan等(Condensedtannin,anantibioticchemicalfromGossypiumhirsutum.JournalofInsectPhysiology,1978,24:113_118)公開(kāi)了從棉蕾中分離出的縮合單寧對(duì)玉米穗螟等害蟲(chóng)具有抗性潛能。但也有研究表明轉(zhuǎn)Bt棉的單寧含量低于常規(guī)品種，并且不同品種的棉花、同一品種棉花的不同生育期、不同組織中含有的萜烯類化合物、黃酮類化合物也有所差異，所起的抗蟲(chóng)作用也有所不同。為了選育抗盲蝽蟓棉花品種，需要對(duì)棉花抗盲蝽蟓的抗蟲(chóng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。然而，一方面盲蝽蟓屬于刺吸式害蟲(chóng)，只能夠攝食液體狀食物，其取食特征與咀嚼式害蟲(chóng)差異很大，導(dǎo)致對(duì)其進(jìn)行生物測(cè)定具有一定的難度，需要特殊的生物測(cè)定裝置；另一方面，大多數(shù)棉花抗蟲(chóng)次生物質(zhì)溶解度比較差，難以和基本飼料混溶，造成盲蝽蟓刺吸時(shí)難以有效攝取到棉花次生物質(zhì)，或者取食不均勻，從而導(dǎo)致生物測(cè)定數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏離，不能夠準(zhǔn)確判定生物測(cè)定效果。綜上所述，傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法難以真實(shí)反映棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果，因此，建立適用于棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果生物測(cè)定方法，是棉花抗盲蝽蟓的抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià)和選育抗盲蝽蟓棉花品種工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人發(fā)明了一種適用于刺吸式害蟲(chóng)取食的生物測(cè)定方法，并對(duì)棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果進(jìn)行生物測(cè)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)刺吸式害蟲(chóng)的棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法，包括如下步驟1)將供試的棉花次生物質(zhì)與脫脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后與基本飼料混合均勻，制得生物測(cè)定飼料；2)將無(wú)底透明管豎直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物測(cè)定飼料，然后用另一封口膜覆蓋并封口，制成飼料囊；3)將盲蝽蟓放入無(wú)底透明管中，使其取食飼料，記錄盲蝽蟓的致死情況或體重抑制效果。其中，步驟1)中所述棉花次生物質(zhì)與脫脂奶粉的重量比為0.15112；所述乳化溶液為含有0.3%0.6%(重量)二甲基亞砜(DMS0)和0.0.5%(重量)吐溫80的水溶液，其用量可以根據(jù)供試棉花次生物質(zhì)的溶解性等理化性質(zhì)，以及生物測(cè)定時(shí)所需濃度確定，例如可以配制成含棉花次生物質(zhì)510mg/g的乳化次生物。所述棉花次生物質(zhì)為萜烯類化合物(如棉酚等)、黃酮類化合物(如蕓香苷等)或單寧類化合物等3類次生物質(zhì)。所述基本飼料是將無(wú)農(nóng)藥污染、無(wú)腐爛的四季豆洗凈，粉碎成勻漿，過(guò)濾并擠壓制得四季豆豆汁，然后加入防腐劑制成。所述防腐劑為山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸甲酯，其加入量分別為四季豆豆汁重量的0.0.3%。上述制得的基本飼料在48°C的溫度下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間不超過(guò)3天。步驟2)中所述無(wú)底透明管為直徑35cm，高68cm的玻璃管；所述封口膜為47cmX47cm的正方形Parafilm膜；在膜中央滴加0.20.4mL生物測(cè)定飼料。所述步驟3)具體是指，將無(wú)底透明管置于直徑58cm玻璃平皿上，透明管底部?jī)?nèi)置12條4mmX3cm濾紙以增加容器內(nèi)部空間異質(zhì)性，保障供試?yán)ハx(chóng)的相對(duì)活動(dòng)空間，將盲蝽蟓置于濾紙上，使其取食飼料，觀察盲蝽蟓取食飼料情況，并記錄盲蝽蟓的致死情況或體重抑制效果，根據(jù)致死情況或體重抑制效果評(píng)價(jià)棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓的效果。本發(fā)明中所述盲蝽蟓包括綠盲蝽、苜蓿盲蝽、三點(diǎn)盲蝽、中黑盲蝽或牧草盲蝽。具體地說(shuō)，本發(fā)明的棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法，包括如下步驟1)將無(wú)農(nóng)藥污染、無(wú)腐爛的四季豆洗凈，用攪拌機(jī)粉碎成勻漿，過(guò)濾并擠壓制得豆汁，然后加入防腐劑制成基本飼料；2)將DMS0、吐溫80溶于水中制成乳化溶液；將供試的棉花次生物質(zhì)與脫脂奶粉混合均勻后，溶于上述乳化溶液中，制成乳化次生物母液，然后按照試驗(yàn)要求的比例加入到基本飼料中，制得生物測(cè)定飼料；生物測(cè)定飼料中供試棉花次生物質(zhì)的濃度(即乳化次生物母液與基本飼料的加入比例)，可以根據(jù)不同棉花品種中含有的棉花次生物質(zhì)的不同含量、濃度選擇合適的濃度范圍及濃度梯度。3)將無(wú)底透明管豎直放置，然后將預(yù)先裁剪好的封口膜置于上端管口，拉伸四周使其封在上端管口上，在膜中央滴加0.20.4mL生物測(cè)定飼料，然后覆蓋同樣大小的封口膜并拉伸封口制成飼料囊，使裝盛飼料的飼料囊形成薄薄一層的狀態(tài)，其內(nèi)部的豆汁飼料保持均勻。4)將上口覆有飼料囊的無(wú)底透明管置于直徑略大的玻璃平皿上，無(wú)底透明管底部?jī)?nèi)置12條濾紙以增加容器內(nèi)部空間異質(zhì)性，保障供試盲蝽蟓的相對(duì)活動(dòng)空間，即可制成生物測(cè)定容器。5)將供試盲蝽蟓置于無(wú)底透明管內(nèi)濾紙上，使其取食飼料，觀察盲蝽蟓取食飼料的情況，調(diào)查記錄盲蝽蟓的致死情況或體重抑制效果，評(píng)價(jià)棉花次生物質(zhì)對(duì)盲蝽蟓的生物測(cè)定效果。評(píng)價(jià)棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果是選育抗盲蝽蟓棉花品種的關(guān)鍵之一。本發(fā)明的生物測(cè)定方法，其結(jié)果能夠真實(shí)反映棉花抗蟲(chóng)次生物質(zhì)的實(shí)際抗盲蝽蟓活性，且數(shù)據(jù)具有規(guī)律性，為選育抗盲蝽蟓棉花品種提供依據(jù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的生物測(cè)定方法解決了刺吸式害蟲(chóng)難以喂食，以及多數(shù)次生物質(zhì)不易與人工飼料混溶等問(wèn)題，并且適用廣泛，對(duì)胃毒、內(nèi)吸同時(shí)作用的藥劑均能夠進(jìn)行有效測(cè)定，能準(zhǔn)確測(cè)定出棉花次生物質(zhì)對(duì)于盲蝽蟓等刺吸式害蟲(chóng)的控制效果，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1取無(wú)農(nóng)藥污染、無(wú)腐爛的新鮮四季豆洗凈，用攪拌機(jī)粉碎成勻漿，然后過(guò)濾并擠壓制得新鮮豆汁，每次制備約200mL，然后分別按豆汁重量的0.加入山梨酸及對(duì)羥基苯甲酸甲酯，攪拌均勻，制成基本飼料，將其放入冰箱中，在4°C的溫度下儲(chǔ)存、備用。分別將DMS0、吐溫80溶于水中，制得含有0.6%(重量)DMS0、0.(重量)吐溫80的乳化溶液，備用。稱取2g蕓香苷和4g脫脂奶粉充分混勻，然后從中稱取1.5g混合物(含有0.5g蕓香苷)于100mL容量瓶中，用上述乳化溶液定容至100mL，得到5mg/g的乳化蕓香苷溶液。然后把該乳化蕓香苷溶液按下述濃度加入到基本飼料中，分別制備0.8mg/g、0.4mg/g、0.2mg/g、0mg/g濃度梯度的含蕓香苷的生物測(cè)定飼料。取四個(gè)相同的無(wú)底玻璃管(直徑5cm、高8cm)，分成三個(gè)蕓香苷處理組及一個(gè)對(duì)照組(CK)。將玻璃管豎直放置，把預(yù)先裁剪好的5cmX5cmParafilm封口膜置于玻璃管上口，拉伸四周使其封在上口上；在膜中央分別加入0.3mL各濃度梯度的含蕓香苷的生物測(cè)定飼料，然后覆蓋同樣大小的封口膜并拉伸封口制成飼料囊，使裝盛飼料的飼料囊形成薄薄一層的狀態(tài)，內(nèi)部的豆汁飼料保持均勻。將上口覆有飼料囊的玻璃管置于直徑7cm玻璃平皿上，玻璃管底部?jī)?nèi)置1條4mmX3cm的濾紙條，制成生物測(cè)定容器。處理組和對(duì)照組(CK)分別接入5頭2齡綠盲蝽若蟲(chóng)，每隔一天更換一次豆汁飼料，并記錄玻璃管中的綠盲蝽剩余數(shù)目，第6天記錄剩余蟲(chóng)數(shù)并回收剩余若蟲(chóng)，重復(fù)9次，評(píng)價(jià)蕓香苷對(duì)盲蝽蟓的生物測(cè)定效果。結(jié)果如表1所示。實(shí)施例2取無(wú)農(nóng)藥污染、無(wú)腐爛的新鮮四季豆洗凈，用攪拌機(jī)粉碎成勻漿，然后過(guò)濾并擠壓得到新鮮豆汁，每次制備約200mL，然后分別按豆汁重量的0.3%加入山梨酸及對(duì)羥基苯甲酸甲酯，攪拌均勻，制成基本飼料，將其放入冰箱中，在8°C的溫度下儲(chǔ)存、備用。分別將DMS0、吐溫80溶于水中，制得含有0.3%(重量)DMS0、0.5%(重量)吐溫80的乳化溶液，備用。稱取0.8g棉酚與5.2g脫脂奶粉充分混勻，然后從中稱取3.75g混合物(含有0.5g棉酚)于50mL容量瓶中，用上述乳化溶液定容，充分震蕩，使其成均勻懸濁液，得到10mg/g的棉酚混合懸濁液。然后把該棉酚混合懸濁液按下述濃度加入到基本飼料中，分別制備4mg/g、2mg/g、0.75mg/g、0mg/g濃度梯度的棉酚生物測(cè)定飼料。取四個(gè)相同的無(wú)底玻璃管(直徑5cm、高8cm)，分成三個(gè)棉酚處理組及對(duì)照組(CK)。將玻璃管豎直放置，把預(yù)先裁剪好的5cmX5CmParafilm封口膜置于玻璃指形管上口，然后拉伸四周使其封在上口上，然后在膜中央分別加入0.4mL各濃度梯度的含棉酚的生物測(cè)定飼料后，覆蓋同樣大小的封口膜并拉伸封口制成飼料囊，使裝盛飼料的飼料囊形成薄薄一層的狀態(tài)，內(nèi)部的豆汁飼料保持均勻。將上口覆有飼料囊的玻璃管置于直徑7cm玻璃平皿上，指形管底部?jī)?nèi)置2條4mmX3cm的濾紙條，制成生物測(cè)定容器。處理組和對(duì)照組(CK)分別接入15頭2齡綠盲蝽若蟲(chóng)，每隔一天更換一次豆汁飼料，并記錄玻璃管中的綠盲蝽剩余數(shù)目，第6天記錄剩余蟲(chóng)數(shù)并回收剩余若蟲(chóng)，重復(fù)3次，評(píng)價(jià)棉酚對(duì)盲蝽蟓的生物測(cè)定效果。結(jié)果如表1所示。表1棉花次生物質(zhì)蕓香苷和棉酚對(duì)綠盲蝽的生物測(cè)定效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以看出，綠盲蝽的死亡率隨著次生物質(zhì)處理濃度的提高而提高，表明兩類次生物質(zhì)具有很好的抗蟲(chóng)效果，數(shù)據(jù)具有規(guī)律性，能夠真實(shí)反映棉花抗蟲(chóng)次生物的實(shí)際抗蟲(chóng)活性。棉花抗蟲(chóng)次生物質(zhì)對(duì)照組(CK)的死亡率在2.5%5.9%之間，符合生物測(cè)定要求的對(duì)照死亡率控制在20%以內(nèi)的要求，進(jìn)一步說(shuō)明了本方法的可靠性和有效性。下面通過(guò)本發(fā)明方法與傳統(tǒng)生物測(cè)定方法的對(duì)比試驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。試驗(yàn)例1傳統(tǒng)生物測(cè)定方法通常是采用固體形式混入法進(jìn)行生物測(cè)定，即按照濃度梯度設(shè)置稱取一定重量的棉花抗蟲(chóng)次生物質(zhì)，不經(jīng)過(guò)乳化過(guò)程直接加入到基本飼料中并攪拌混勻待測(cè)。由于多數(shù)棉花抗蟲(chóng)次生物質(zhì)可溶性差，難以和基本飼料混溶，往往很快出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，造成盲蝽蟓刺吸時(shí)難以有效攝取到棉花次生物質(zhì)，或者取食不均勻，從而導(dǎo)致生物測(cè)定數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏離。例如，按表2所示濃度梯度將蕓香苷加入到基本飼料中，配制成生物測(cè)定飼料，然后將上述生物測(cè)定飼料投入裝有5頭2齡綠盲蝽若蟲(chóng)的燒杯中，每隔一天更換一次飼料，并記錄燒杯中的綠盲蝽剩余數(shù)目，第6天記錄剩余蟲(chóng)數(shù)并回收剩余若蟲(chóng)，重復(fù)9次，評(píng)價(jià)蕓香苷對(duì)盲蝽蟓的生物測(cè)定效果。將該結(jié)果與實(shí)施例1方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。表2綠盲蝽在蕓香苷不同處理濃度和不同處理方法下的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注同列數(shù)據(jù)后有相同字母表示差異不顯著(P>0.05，新復(fù)極差法)，不相同字母表示差異顯著(P<0.05,新復(fù)極差法)。從表2可以看出，本發(fā)明方法處理的綠盲蝽的死亡率隨著次生物質(zhì)處理濃度的提高而提高，而固體形式混入法不同處理濃度之間無(wú)明顯差異，且沒(méi)有規(guī)律性，不能夠真實(shí)反映棉花抗蟲(chóng)次生物的實(shí)際抗蟲(chóng)活性。這是由于盲蝽蟓屬于刺吸式口器害蟲(chóng)，只能夠攝食液體狀食物，不能像棉鈴蟲(chóng)等咀嚼式害蟲(chóng)那樣用咀嚼式口器直接吞食飼料，因此，不能將抗蟲(chóng)次生物質(zhì)直接以固體形式均勻混入人工飼料的方法進(jìn)行生物測(cè)定。雖然，上文中已經(jīng)通過(guò)一般性說(shuō)明、實(shí)施例與實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)能理解，在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明生物測(cè)定的飼料組分、生物測(cè)定裝置與制備方法的步驟或條件所作的修改或替換，均落入本發(fā)明的范圍之中。權(quán)利要求一種棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟1)將供試的棉花次生物質(zhì)與脫脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后與基本飼料混合均勻，制得生物測(cè)定飼料；2)將無(wú)底透明管豎直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物測(cè)定飼料，然后用另一封口膜覆蓋并封口，制成飼料囊；3)將盲蝽蟓放入無(wú)底透明管中，使其取食飼料，記錄盲蝽蟓的致死情況或體重抑制效果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，步驟1)中棉花次生物質(zhì)與脫脂奶粉的重量比為0.15112；所述乳化溶液為按重量百分?jǐn)?shù)含有0.3%0.6%二甲基亞砜和0.0.5%吐溫80的水溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，所述棉花次生物質(zhì)為萜烯類化合物、黃酮類化合物或單寧類化合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，步驟1)中所述基本飼料是將無(wú)農(nóng)藥污染、無(wú)腐爛的四季豆洗凈，粉碎成勻漿，過(guò)濾并擠壓制得四季豆豆汁，然后加入防腐劑制成。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，所述防腐劑為山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸甲酯，其加入量分別為四季豆豆汁重量的0.0.3%。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，所述基本飼料在48°C的溫度下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間不超過(guò)3天。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，步驟2)中所述無(wú)底透明管為直徑35cm，高68cm的玻璃管；所述封口膜為47cmX47cm的正方形Parafilm膜。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，步驟2)中在膜中央滴加0.20.4mL生物測(cè)定飼料。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟3)為將無(wú)底透明管置于直徑58cm玻璃平皿上，透明管底部?jī)?nèi)置12條4mmX3cm濾紙，將盲蝽蟓置于濾紙上，使其取食飼料。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物測(cè)定方法，其特征在于，所述盲蝽蟓包括綠盲蝽、苜蓿盲蝽、三點(diǎn)盲蝽、中黑盲蝽或牧草盲蝽。全文摘要本發(fā)明提供了一種棉花次生物質(zhì)抗盲蝽蟓效果的生物測(cè)定方法，其包括如下步驟將供試的棉花次生物質(zhì)樣品與脫脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后與基本飼料混合均勻，制得生物測(cè)定飼料；將無(wú)底透明管豎直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物測(cè)定飼料，然后用另一封口膜覆蓋并封口，制成飼料囊；將盲蝽蟓放入無(wú)底透明管中，使其取食飼料，記錄盲蝽蟓的致死情況或體重抑制效果。本發(fā)明的生物測(cè)定方法解決了多數(shù)次生物質(zhì)不易與人工飼料混溶，以及刺吸式害蟲(chóng)難以喂食等問(wèn)題，并且適用廣泛，對(duì)胃毒、內(nèi)吸同時(shí)作用的藥劑均能夠進(jìn)行有效測(cè)定，能準(zhǔn)確測(cè)定出棉花次生物質(zhì)對(duì)于盲蝽蟓等害蟲(chóng)的控制效果，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。文檔編號(hào)G01N33/00GK101813684SQ20101014534公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年4月9日優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日發(fā)明者吳孔明,張永軍,林鳳敏,趙秋劍,郭予元,陸宴輝申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所