專利名稱：：一種應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)定量評價藥物毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物毒性定量評價的新方法，具體涉及采用氣相色譜方法定量檢測人、動物或細(xì)胞中內(nèi)源性小分子化合物、采用多變量數(shù)據(jù)處理方法計算數(shù)學(xué)模型、計算給藥組與對照組相對距離作為藥物毒性定量評價的方法。
背景技術(shù)：
：長期以來，在藥理研究中，許多藥物的毒性依靠定性而非定量、主觀而非客觀、粗略而非準(zhǔn)確、片面而非全面的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，這些方法的具體不足主要體現(xiàn)在1.^iMIMM^毒性評價雖然采用了一些方便、有效的評價指標(biāo)，如轉(zhuǎn)氨酶、白血球數(shù)目等，但還有許多毒性缺乏明確量化指標(biāo)，以現(xiàn)有的方法難以實施精確檢測和評價。例如藥物對組織或器官如肝臟、腎臟的毒性、疼痛程度、過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)的強弱、致幻、眩暈等對神經(jīng)系統(tǒng)的興奮、抑制的程度等。2.主觀件因缺乏客觀定量指標(biāo),許多毒件的評價R能采取主觀的、外在的、人為的觀察方法進(jìn)行定性評價，如組織切片、成像技術(shù)、各種電鏡檢查、細(xì)胞染色，或依靠經(jīng)驗判斷或主觀感覺進(jìn)行分級量化，使得藥物毒性評判存在很大的主觀性和不確定性。3.許多指標(biāo)存在一定的片面性，只是反映了個別生化功能、器官/組織的狀態(tài)，缺乏整體的、系統(tǒng)的評價標(biāo)準(zhǔn)。如轉(zhuǎn)氨酶、肌酸酐、血沉等指標(biāo)。4.表面件許多指標(biāo)R反映了表象(如血壓、抽搐、流涎、瞳孔大小等)，沒有反映機體內(nèi)在本質(zhì)的改變。5.Jtt^毒性評價的指標(biāo)不夠靈敏，往往需要大劑量、長時間給藥才能觀察到相關(guān)毒性指標(biāo)。6.性一些評價方法對機體傷害大或費用昂貴，如活檢、介入、造影、斷層掃描等，缺少損傷性小、經(jīng)濟方便的方法?？傊?，現(xiàn)有的許多毒性評價的方法局限性較大，缺乏定量標(biāo)準(zhǔn)、缺乏客觀性、全面性、針對性，不利于對藥物毒性進(jìn)行定量、客觀和準(zhǔn)確評價，成為嚴(yán)重制約藥理/毒理學(xué)研究的巨大障礙。迫切需要尋找和創(chuàng)立新的藥物毒性評價方法。機體內(nèi)源性小分子物質(zhì)組是生命活動的基礎(chǔ)，機體的功能狀態(tài)必然反映在體內(nèi)代謝組(內(nèi)源性小分子化合物總稱)上。研究表明，在中毒狀態(tài)下，生物體的代謝和其中很多小分子化合物水平出現(xiàn)明顯異常。毒性越強，對生物體各項功能的影響也越大，機體的各項功能狀態(tài)/體內(nèi)小分子水平也越偏離正常狀態(tài)，在代謝組學(xué)上的表現(xiàn)就是用藥組遠(yuǎn)離正常組；而毒性越弱，對生物體各項功能的影響也越小，機體的各項功能狀態(tài)/體內(nèi)小分子水平也較少程度上偏離正常狀態(tài)，在代謝組學(xué)上的表現(xiàn)就是用藥組與正常組有少量偏離。而在毒性隨時間的變化過程中，隨著機體的各項功能逐漸恢復(fù)，體內(nèi)小分子和代謝水平也逐漸得到恢復(fù)，在代謝組學(xué)上的表現(xiàn)就是逐漸靠近正常組。因此采用代謝組學(xué)方法可定量評價藥物的毒性。利用合適的代謝組學(xué)檢測工具，可以一次檢測生物樣本中數(shù)百甚至上千個分子量小于1000的各類小分子化合物。以GC/TOFMS測定為例，對很多化合物檢測靈敏度高達(dá)IO-12Hiol(絕對檢測限)，相對靈敏度達(dá)10-9mol/mL。這些化合物包括幾乎所有氨基酸、糖醇類化合物、脂肪酸類、脂類、小分子有機酸類、核苷和嘌呤化合物、氨類化合物、神經(jīng)遞質(zhì)等等，它們既是生命活動必需的原料，也是機體代謝產(chǎn)物/中間體，還是機體生長、發(fā)育、生物信號傳導(dǎo)和代謝循環(huán)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。與生命活動中起著極為重要作用的糖代謝、脂代謝、三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)、氨基酸循環(huán)等密切相關(guān)。因此，檢測的體內(nèi)小分子的變化既可以系統(tǒng)綜合地體現(xiàn)藥物毒性作用的結(jié)果，還可以根據(jù)給藥前后樣品移動距離定量評價藥物毒性。迄今為止，還沒有利用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型、計算給藥組與對照組相對距離對藥物毒性進(jìn)行定量評價的報道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用代謝組學(xué)方法，全面、定量測定生物樣本中內(nèi)源性小分子，得到的數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)處理方法建立數(shù)學(xué)模型，計算給藥組與對照組的相對距離，以此定量數(shù)值作為藥物毒性評價的指標(biāo)，解決藥物毒性缺乏準(zhǔn)確定量評價方法的問題。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，步驟包括樣品采集和處理采集臨床病人、模型動物、組織/細(xì)胞的各類生物樣本，通常為血液、尿、體外培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)液；樣品經(jīng)過有機溶劑進(jìn)行液_液提取，有機溶劑包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或經(jīng)過蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包括加入有機溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇)、各種酸堿鹽沉淀、加熱沉淀、過濾/超濾、固相萃取等方法單獨或者綜合的方式進(jìn)行處理；樣品可不進(jìn)行干燥，或先干燥再利用各類含有機溶劑和水相(單獨或者綜合，含鹽或者不含鹽)的溶媒溶解；樣品不進(jìn)行衍生化或者利用試劑進(jìn)行衍生化處理。樣品分析和數(shù)據(jù)處理采用基于質(zhì)譜測定與色譜聯(lián)用的技術(shù)方法或核磁共振技術(shù)的測定方法對上述樣品進(jìn)行檢測，這些方法可以是液相色譜_質(zhì)譜、氣相色譜_質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳色譜_質(zhì)譜、核磁共振等；經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后得到色譜圖中各個峰的定量數(shù)據(jù)，這個數(shù)據(jù)可以是峰面積或峰高，或由峰面積或峰高計算得到的定量數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一個突出優(yōu)點是上述檢測方法能檢測體內(nèi)大量小分子化合物，并以此為基礎(chǔ)全面評價藥物作用效果/或機體的健康狀態(tài)。當(dāng)藥物毒性作用強時，整個代謝譜偏離正常較大，而藥物毒性較弱時，整個代謝譜偏離正常較小。圖1給出了正常SD大鼠和給予雷公藤內(nèi)酯醇后GC/T0F-MS測定血清樣本的總離子流色譜圖，從色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)給藥后樣品與對照組有明顯差異。但這種目測觀察的方法只能作一個粗略、主觀的判斷，無法實現(xiàn)定量評價。數(shù)學(xué)模型建立和相對距離值的計算上述數(shù)據(jù)采用各種多變量數(shù)據(jù)處理軟件，可以為SPSS、Matlab,SIMCA-P等，選擇偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)、主成分分析(PCA)、非線性映射(Nonlinemapping,NLM)、聚類分析(HCA)等方法建立數(shù)學(xué)模型，獲取模型參數(shù)和樣品在多維數(shù)學(xué)模型中的空間坐標(biāo)；計算給藥組樣品與對照組相對距離。這里的多維空間可以是1、2、3維，也可以是4、5、6甚至更多維空間。上述對照組可以是給藥前自身對照，也可以是未給藥的模型組平行對照，還可以是未給藥的正常組對照。上述空間相對距離可以先取各組樣品的坐標(biāo)平均值，再計算得到，也可以先計算各個樣品之間距離，再取平均值得到。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法_判別分析(PLS-DA)等投影分析的方法的突出優(yōu)點是能方便、直觀地觀察各個樣品在多維空間模型中的相對位置，圖2顯示高劑量雷公藤內(nèi)酯醇(2.4mg/kg)給藥引起SD大鼠代謝譜出現(xiàn)明顯異常，特別是給藥后1、3天，至第5、7天有恢復(fù)趨勢；而低劑量雷公藤內(nèi)酯醇(0.6mg/kg)給藥引起SD大鼠代謝譜在第一天出現(xiàn)異常，隨后(3、5、7天)較快趨向正常，體現(xiàn)出明顯的劑量和時間相關(guān)性。與上述總離子流圖一樣，這樣目視觀察的方法雖然被大量用于毒性的定性評判，但其主要問題是無法量化，且結(jié)果判斷帶有主觀性。本發(fā)明的有益效果機體內(nèi)源性小分子物質(zhì)組是生命活動的基礎(chǔ)，機體的功能狀態(tài)必然反映在體內(nèi)代謝組(內(nèi)源性小分子化合物總稱)上。研究表明，在中毒狀態(tài)下，生物體的代謝和其中很多小分子化合物水平出現(xiàn)明顯異常。毒性越強，用藥組偏離正常組越大；而毒性越弱，偏離正常組越小。因此采用代謝組學(xué)方法可定量評價藥物的毒性。1.利用代謝組學(xué)研究結(jié)果可以定量反映了藥物毒性，增強了客觀性和準(zhǔn)確性，避免了一些藥物毒性指標(biāo)只憑人為、主觀、和定性評價的問題。2.利用代謝組學(xué)研究結(jié)果可以全面綜合地反映藥物毒性，避免了一些藥物毒性指標(biāo)只反映局部藥物毒性的問題。3.代謝組學(xué)的量化指標(biāo)適用面廣，可適用于各類毒性的定量評價。4.代謝組學(xué)的藥物毒性評價方法采用血漿、尿等樣本，成本低、對機體傷害小。5.代謝組學(xué)的評價方法較常規(guī)方法更靈敏，可以節(jié)省藥物用量、減少對動物的傷害和死亡數(shù)，有利于降低研究成本和保護(hù)動物。圖1GC/T0F-MS測定正常SD大鼠和給予雷公藤內(nèi)酯醇后大鼠血清樣本的總離子流色譜圖?？梢钥闯鼋o藥后SD大鼠血清總離子流色譜圖出現(xiàn)明顯變化。A正常SD大鼠血清總離子流色譜圖；B給藥大鼠血清總離子流色譜圖。從色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)給藥后樣品與對照組有明顯差異。但這種目測觀察的方法只能作一個粗略、主觀的判斷，無法實現(xiàn)定量評價。圖中標(biāo)注色譜峰1-31為色譜圖中鑒定的部分化合物，具體為1，乳酸；2，丙氨酸；3，3_羥基丁酸；4，尿素；5，纈氨酸；6，磷酸；7，亮氨酸；8，甘氨酸；9，絲氨酸；10，蘇氨酸；11，氨基丙二酸；12，焦谷氨酸；13，半胱氨酸；14，鳥氨酸；15，谷氨酸；16，苯丙氨酸；17，甲基肉蔻酸；18，谷氨酰胺；19，[13C2]-肉蔻酸(內(nèi)標(biāo))；20，檸檬酸；21，葡萄糖；22，棕櫚酸；23，尿酸；24，肌醇；25，亞油酸；26，油酸；27，色氨酸；28，硬脂酸；29,6-磷酸葡萄糖；30,1-磷酸肌醇；31，膽固醇.圖2雷公藤內(nèi)酯醇給藥后引起SD大鼠代謝譜出現(xiàn)不同程度的變化。高劑量雷公藤內(nèi)酯醇(2.4mg/kg)給藥引起SD大鼠代謝譜出現(xiàn)明顯異常，特別是給藥后1、3天，至第5、7天有恢復(fù)趨勢；低劑量雷公藤內(nèi)酯醇(0.6mg/kg)給藥引起SD大鼠代謝譜在第一天出現(xiàn)異常，隨后(3、5、7天)較快趨向正常。與上述總離子流圖一樣，這樣目視觀察的方法雖然被大量用于毒性的定性評判，但其主要問題是無法量化，且結(jié)果判斷帶有主觀性。L低劑量；H:高劑量；0、1、3、5、7給藥前或給藥后1、3、5、7天。具體實施例方式本發(fā)明通過下面的實施例進(jìn)行詳細(xì)的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。實施實例雷公藤內(nèi)酯醇對SD大鼠毒性作用的代謝組學(xué)研究1.實驗方案、樣品采集8周齡SpragueDawley(SD)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，分組后分別按高、低(2.4和0.6mg/kg)劑量單次灌胃給藥，采集給藥前(0天)、給藥后1、3、5、7天的血液(采血前大鼠禁食12小時)，血液在37°C水浴靜置lh，3500rpm離心后收集上層血清，_80°C保存。同時采集肝、腎組織并切片，一部分用于代謝組學(xué)的測定；另一部分血清和組織切片用于臨床生化及組織病理學(xué)檢查。結(jié)果高劑量雷公藤內(nèi)酯醇給藥后肝臟組織切片可見肝細(xì)胞核固縮、嗜酸性染色增強，臨床生化檢查發(fā)現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、白細(xì)胞數(shù)增加，提示明顯毒性；而低劑量雷公藤內(nèi)酯醇未見明顯毒性，表1。2.樣品處理冷凍血清在37°C水浴解凍20min，渦旋振蕩后，取50μ1加入200μ1含有穩(wěn)定同位素13C的內(nèi)標(biāo)肉寇酸的甲醇溶液(12.5μg/ml)，渦旋振蕩3min，4°C冰箱靜置1小時，19600g和4°C離心lOmin，取100μ1上清液于GC小瓶中，減壓揮干。向GC小瓶中加入30μ1甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3min，室溫下靜置16h進(jìn)行肟化。加入30μ1三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA(含1%TMCS作為催化劑)，渦旋振蕩lmin，室溫靜置Ih進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后再加入30μ1外標(biāo)甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30μg/ml)，混合后進(jìn)行GC-T0F/MS檢測。3.GC/T0F-MS測定儀器氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/T0F-MS)檢測系統(tǒng)(GC=Angilent6890N氣相色譜儀，配備Angilent7683B自動進(jìn)樣器和G2614A型100位樣品進(jìn)樣盤；TOF-MS=PegasusIII，Leco,USA)。色譜條件色譜柱是DB-5石英毛細(xì)管柱(IOmXO.18mmi.d.，J&ffScientific,USA)，進(jìn)樣量1μ1，采用不分流進(jìn)樣模式；載氣氦氣；恒流速度lml/min；程序升溫模式70°C保持2.Omin，然后以35°C/min線性勻速線性升溫至305°C，保持2.Omin。質(zhì)譜條件進(jìn)樣口溫度250°C；清洗時間和流速lmin，20ml/min；傳輸管溫度2500C；離子源溫度200°C；離子源電壓和電流_70eV，3.OmA；MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；掃描范圍m/z50-800；掃描速度20Spectra/S；檢測電壓為-1690v。測定結(jié)果在上述檢測條件下可獲得樣品的GC/T0F-MS總離子流色譜圖(圖1)。利用儀器自帶的軟件(ChromaTOF2.00)可提取各個測定樣品色譜圖中每個色譜峰峰面積，組成一個由峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣，該數(shù)據(jù)矩陣包括高劑量雷公藤內(nèi)酯醇給藥組(1、3、5、7天)和低劑量雷公藤內(nèi)酯醇給藥組(1、3、5、7天)及給藥前組共60個樣品(為第一列)和195個色譜峰(為第一行)，保存在excel文件中。4.數(shù)學(xué)模型建立和相對距離值的計算將上述數(shù)據(jù)調(diào)入多元數(shù)據(jù)分析軟件SIMCAP-IKUmetricsAB，Umea,瑞典)中，利用數(shù)據(jù)內(nèi)在關(guān)系投影-偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)計算數(shù)學(xué)模型，確定模型的主成分?jǐn)?shù)目為2，該數(shù)學(xué)模型即為一個2維空間模型，每個樣品都是此空間中的一個點，其位置由χ和y坐標(biāo)參數(shù)所決定。由上述模型可以得到各個樣品在此模型的平面坐標(biāo)中的分布圖，圖2。提取每個樣品在模型中的空間坐標(biāo)參數(shù)，按照下列公式(1)計算每組樣品橫坐標(biāo)(χ)和綜坐標(biāo)(y)的平均值；按公式(2)計算每個/組樣品給藥前后變化距離，該距離值即表示了雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠體內(nèi)代謝組的影響程度，即毒性強弱。公式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>Xi,Yi分別為給藥組第i天橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)平均值。其中Xil6為16號樣品橫坐標(biāo)值；Yil6為16號樣品縱坐標(biāo)值。公式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>Si為給藥后i天與給藥前距離；\、Y0分別為給藥前X、Y坐標(biāo)值。按照上述公式可以分別計算出給藥前后樣品距離和組間距離，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可以看出，高劑量組1天、3天距離值最大，說明毒性最明顯，至5、7天逐漸減弱，并靠近給藥前組；而低劑量組只是在給藥后1天出現(xiàn)較大偏離，其后迅速靠近對照組。從上述結(jié)果還可以看出毒性的劑量和時間依賴性。由于常規(guī)毒性指標(biāo)沒有發(fā)現(xiàn)低劑量下出現(xiàn)異常變化，而代謝組學(xué)的相對距離法，因此代謝組學(xué)方法和相對距離方法可能比常規(guī)方法更為靈敏，并能定量地表示藥物對整個代謝組調(diào)節(jié)的強弱，即全面、定量反映藥物毒性大小。表ISD大鼠給予雷公藤內(nèi)酯醇前后生化檢查結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*P<0.05,**P<0.01,***P<0.OOlvs給藥前對照.ALT，谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST，谷草轉(zhuǎn)氨酶；NE，中性白細(xì)胞；WBC，白細(xì)胞.表2各組樣品在數(shù)學(xué)模型中的平均坐標(biāo)和雷公藤內(nèi)酯醇給藥后與對照組的相對距離<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行毒性定量評價的方法所依賴的是儀器測定所得到的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，其特征包括以下幾個方面a)采用血清作為樣本進(jìn)行檢測；b)采用甲醇沉淀蛋白的方法對血清中小分子進(jìn)行提??；c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法對樣本進(jìn)行衍生化；d)采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析；e)應(yīng)用SIMCAP-11軟件和偏最小二乘一判別分析(PLS-DA)建立數(shù)學(xué)模型；f)從多維空間數(shù)學(xué)模型中提取參數(shù)，計算用藥組和對照組之間相對距離。2.除權(quán)利要求1中血清作為生物樣本外，生物樣本還可來源于人、動物、細(xì)胞、菌類、組織切片等，具體包括全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、淚液、汗液、組織勻漿、細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液/基、細(xì)菌和細(xì)菌培養(yǎng)液/基。3.權(quán)利要求2中上述生物樣本至少其中一組為用藥后采集生物樣本(給藥組)，一組為對照組；對照組可以是給藥前自身對照，也可以是未給藥的模型組平行對照，還可以是未給藥的正常組對照。4.除權(quán)利要求1中的動物除大鼠外，還可以為蟾蜍、青蛙、魚、小鼠、豚鼠、狗、兔、、猴雞、豬、羊、牛；細(xì)胞可以為各種來源的病理性、遺傳改變型或正常細(xì)胞；細(xì)菌可以為各類有報導(dǎo)的遺傳改變型、轉(zhuǎn)基因型或正常細(xì)菌。5.除權(quán)利要求1中采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析外，還包括其它任何基于質(zhì)譜測定技術(shù)、核磁共振測定技術(shù)和其它代謝組學(xué)測定技術(shù)的分析方法。6.權(quán)利要求1中所得到的數(shù)據(jù)可以是絕對定量數(shù)據(jù)，也可以半定量數(shù)據(jù)，如峰面積、峰高，或由此采用數(shù)學(xué)方法計算得到的數(shù)據(jù)。7.除權(quán)利要求1中應(yīng)用SIMCAP-Il軟件和偏最小二乘一判別分析(PLS-DA)建立數(shù)學(xué)模型的方法外，還包括其它代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，如SPSS、Matlab、SIMCA-P等各類版本；包括選擇除偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)、主成分分析(PCA)、非線性映射(N0nlinemapping，NLM)、聚類分析(HCA)等方法建立的數(shù)學(xué)模型。8.權(quán)利要求1中的數(shù)學(xué)模型可以為任意維空間模型，這里的多維空間可以是1、2、3維，也可以是4、5、6甚至更多維空間。9.權(quán)利要求1中用藥組和對照組之間相對距離可以有兩種計算方式，先取各組樣品的坐標(biāo)平均值，再計算得到；在有自身對照樣品時，也可先計算每個樣品給藥前后變化距離，再取平均值得到。10.權(quán)利要求9中藥物毒性表示可以采用藥組和對照組之間相對距離，也可以是相對距離的函數(shù)計算值，如常有對數(shù)值、自然對數(shù)值、平方值、平方根值等任何數(shù)學(xué)計算方式所得結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了“一種應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)定量評價藥物毒性的方法”。其特征在于利用基于質(zhì)譜、核磁共振等測定技術(shù)的代謝組學(xué)方法全面、定量測定生物樣本中小分子化合物，再采用多變量數(shù)據(jù)處理方法建立多維空間數(shù)學(xué)模型，計算給藥組與對照組的相對距離，以此作為藥物毒性評價的定量指標(biāo)，解決藥物毒性評價缺乏定量評價指標(biāo)的難題。與常規(guī)毒性評價的方法相比，該方法適應(yīng)面廣、靈敏、取樣簡便、對機體無傷害，可更全面、綜合地體現(xiàn)了毒性作用，可以為新藥研發(fā)和藥理研究中的毒性評價提供一種全面、可靠的定量評價方法。文檔編號G01N30/72GK101813680SQ20101014184公開日2010年8月25日申請日期2010年4月8日優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日發(fā)明者嚴(yán)蓓,劉林生,張穎,曹蓓,李夢婕,查偉斌,王廣基,王新文,石建,趙春艷,邵鳳,鄭天,阿基業(yè),顧勝華,黃青,龔平申請人:中國藥科大學(xué)