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一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法及其測定方法

文檔序號:5868669閱讀:331來源:國知局

專利名稱::一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法及其測定方法
技術領域
:本發(fā)明屬于生物多糖的提取,特別涉及一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法及其測定方法。
背景技術
:目前,提取食用菌多糖常用的方法有熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法和酸堿浸提法,這些方法均有一定的不足之處。其中,熱水浸提法需要溫度在80-10(TC,處理時間在60-180min,處理溫度比較高、時間比較長,容易使多糖發(fā)生變性失活;微波輔助法是利用微波的吸收性、穿透性和反射性使極性物質,如水等選擇性吸收,從而被加熱,增加物料的通透性,使得多糖等活性物質從組織中釋放出來,其實質也是利用加熱提取多糖,所以容易使多糖發(fā)生變性失活;超聲波輔助法是利用其在溶劑中產生的空化作用,導致溶液內空穴的形成、增長和爆破壓縮,從而是固體樣品破碎,增大樣品與萃取劑之間的接觸面積,提高目標產物從固相轉移到液相的傳質速率,其實質是破碎細胞壁,溶出目標產物,但是在實際操作的過程中,利用超聲波破碎食用菌細胞壁,效率非常低,致使多糖的提取率也比較低;酸堿浸提法雖然可以縮短提取時間,但由于酸、堿在濃度因子難以控制的情況下,容易使部分多糖發(fā)生水解,從而破壞多糖的活性結構,降低多糖得率。經(jīng)查閱文獻,以上提取方法的多糖提取率在9-15mg/g。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法。本發(fā)明的技術方案是—種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法,其特征在于使用原料鮮雙孢蘑菇;使用試劑苯酚、濃硫酸、葡萄糖、硫酸銨(NH》^(V聚乙二醇(PEG)6000、蒸餾水;使用儀器設備10mL離心管、50mL離心管、真空冷凍干燥器、離心機;分離方法及步驟(1)材料預處理將新鮮的雙孢蘑菇真空冷凍干燥24h;(2)熱水浸提粗多糖將干燥后的雙孢菇粉碎后稱取兩克,置于不銹鋼或玻璃容設備中,加入200mL蒸餾水,大火煮沸,文火維持1小時,離心取上清液,沉淀放回加熱設備中加水100mL繼續(xù)加熱致沸騰,文火維持30min,再離心取上清液;重復三次,將獲得的上清液裝入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL備用;(3)雙水相萃取操作精確稱取聚乙二醇(PEG)60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入樣品稀釋液20mL混勻;同時稱取PEG60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入蒸餾水20mL混勻,作為對照,在離心機中以3000r/min離心5min,讀取樣品管上下相體積,上相體積為9.5mL,下相體積為14.5mL;得到的雙孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。本從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法,最佳的條件為PEG6000的質量百分數(shù)為13.3%,(NH4)2S04的質量百分數(shù)為21.4X,pH值為7,溫度為25°C,在一個大氣壓條件下操作。本從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的測定方法,其特征在于使用儀器UV-722型紫外可見光分光光度計、分析天平;(1)苯酚-硫酸法測定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀釋10倍,再取lmL稀釋液加0.5mL6%苯酚和2.5mL濃硫酸,混勻后靜置30min,用UV-722紫外-可見分光光度計在490nm下測定吸光度值;上相吸光度為0.369,下相吸光度0.06;(2)標準曲線的制作準確稱取葡萄糖0.0210g用蒸餾水溶解,定容至500mL。取10支刻度試管,分別編號0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液O.lmL放入l號試管,取0.2mL到2號管,以此類推,取0.9mL放入9號管,0號管里不加葡萄糖溶液,蓋上試管,搖勻,再在每只試管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL,然后立即加入2.5mL濃硫酸,搖勻;靜置30min,后在紫外-可見分光光度計上490nm測其吸光度值,記錄數(shù)值并作圖;數(shù)據(jù)如表l表1標準曲線吸光度值試管號0123456789吸取量/mL00.10.20.30,40.50.60.70.80.9加水/mL10.90.80.70.60.50.40.30.20.1葡萄糖濃度/(mg/mL)01.052.13.154.25.256.37.358.49.45吸光度值00.0450.1050.1430.2170.2410.3210.3960.4250.462(3)數(shù)據(jù)計算計算得上相中多糖濃度為5.9mg/mL,下相中多糖濃度為2.Omg/mL。相關的計算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R雙水相體系上下相的體積比Vt雙水相體系上相體積,mLVb雙水相體系下相體積,mLK雙孢燕多糖雙水相體系分配系數(shù)Ct雙水相系統(tǒng)上相雙孢燕多糖的質量濃度,mg/mLCb雙水相系統(tǒng)下相雙孢燕多糖的質量濃度,mg/mL5Y雙孢菇多糖在上相中的收率。本發(fā)明效果是雙水相萃取(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)技術始于20世紀60年代,由于其條件溫和,容易放大,可連續(xù)操作,目前已成功的應用于蛋白、核酸等生物產品的分離和純化。其主要優(yōu)勢有以下幾點(1)易于放大,各種參數(shù)可以按比例放大而產物收率并不降低,現(xiàn)已證明雙水相萃取的分配系數(shù)僅與分離體積有關,這是其他過程無法比擬的,這一點對于工業(yè)應用尤為有利;(2)由于雙水相系統(tǒng)之間的傳質過程和平衡過程快速,因此相對于某些分離過程來說,能耗較小,而且可以實現(xiàn)快速分離;(3)由于雙水相的相間張力大大低于有機溶劑與水相之間的相間張力,相分離過程溫和,使生化分子如酶不易受到破壞,而且可以直接在雙水相系統(tǒng)中進行生化轉化以消除產物抑制;(4)整個操作過程可以在室溫下進行操作條件溫和?;谝陨想p水相萃取的優(yōu)勢,我們可以在溫和的條件下,利用兩種水溶液的萃取操作提取雙孢蘑菇多糖,不僅可以提高產品的提取率和得率,而且可以將實驗室操作的結果直接放大到生產規(guī)模,省去了中試過程,為生物產品的研發(fā)和生產找到了一條捷徑。利用PEG/(NH4)2S04雙水相體系萃取雙孢蘑燕多糖最大收率為80.1%,得率可以達至lj17.45mg/g;圖l葡萄糖標準曲線圖具體實施例方式—種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法本發(fā)明創(chuàng)造的具體方案1實驗材料、試劑和儀器設備鮮雙孢蘑菇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、(NH山S(V聚乙二醇(PEG)6000、蒸餾水。10mL離心管、50mL離心管、真空冷凍干燥器、離心機、UV-722型紫外可見光分光光度計、分析天平。2實驗方法及步驟(1)實驗材料預處理將新鮮的雙孢蘑菇真空冷凍干燥24h。(2)熱水浸提粗多糖將干燥后的雙孢菇粉碎后稱取兩克,置于不銹鋼或玻璃容設備中,加入200mL蒸餾水,大火煮沸,文火維持1小時,離心取上清液,沉淀放回加熱設備中加水100mL繼續(xù)加熱致沸騰,文火維持30min,再離心取上清液。重復三次,將獲得的上清液裝入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL備用。(3)雙水相萃取操作精確稱取PEG60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入樣品稀釋液20mL混勻;同時稱取PEG60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入蒸餾水20mL混勻,作為對照,在離心機中以3000r/min離心5min,讀取樣品管上下相體積,上相體積為9.5mL,下相體積為14.5mL。6(4)苯酚-硫酸法測定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀釋10倍,再取lmL稀釋液加0.5mL6%苯酚和2.5mL濃硫酸,混勻后靜置30min,用UV-722紫外-可見分光光度計在490nm下測定吸光度值。上相吸光度為0.369,下相吸光度0.06。(5)標準曲線的制作準確稱取葡萄糖0.0210g用蒸餾水溶解,定容至500mL。取10支刻度試管,分別編號0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液O.lmL放入l號試管,取0.2mL到2號管,以此類推,取0.9mL放入9號管,0號管里不加葡萄糖溶液,蓋上試管,搖勻,再在每只試管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL,然后立即加入2.5mL濃硫酸,搖勻。靜置30min,后在紫外-可見分光光度計上490nm測其吸光度值,記錄數(shù)值并作圖。數(shù)據(jù)如表l,圖如圖1。表l標準曲線吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖1為葡萄糖標準曲線(6)數(shù)據(jù)計算計算得上相中多糖濃度為5.9mg/mL,下相中多糖濃度為2.Omg/mL。相關的計算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R雙水相體系上下相的體積比Vt雙水相體系上相體積,mLVb雙水相體系下相體積,mLK雙孢燕多糖雙水相體系分配系數(shù)Ct雙水相系統(tǒng)上相雙孢燕多糖的質量濃度,mg/mLCb雙水相系統(tǒng)下相雙孢燕多糖的質量濃度,mg/mLY雙孢菇多糖在上相中的收率利用PEG/(NH4)2S04雙水相體系萃取雙孢蘑燕多糖最大收率為80.1%,得率可以達到17.45mg/g。雙孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。最佳的條件為PEG6000的質量百分數(shù)為13.3%,(NH4)2S04的質量百分數(shù)為21.4X,pH值為7,溫度為25",在一個大氣壓條件下操作。權利要求一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法,其特征在于使用材料鮮雙孢蘑菇;使用試劑苯酚、濃硫酸、葡萄糖、硫酸銨(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸餾水;使用儀器設備10mL離心管、50mL離心管、真空冷凍干燥器、離心機;分離方法及步驟(1)材料預處理將新鮮的雙孢蘑菇真空冷凍干燥24h;(2)熱水浸提粗多糖將干燥后的雙孢菇粉碎后稱取兩克,置于不銹鋼或玻璃容設備中,加入200mL蒸餾水,大火煮沸,文火維持1小時,離心取上清液,沉淀放回加熱設備中加水100mL繼續(xù)加熱致沸騰,文火維持30min,再離心取上清液;重復三次,將獲得的上清液裝入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL備用;(3)雙水相萃取操作精確稱取聚乙二醇(PEG)60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入樣品稀釋液20mL混勻;同時稱取PEG60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入蒸餾水20mL混勻,作為對照,在離心機中以3000r/min離心5min,讀取樣品管上下相體積,上相體積為9.5mL,下相體積為14.5mL;得到的雙孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。2.根據(jù)權利要求1所述的一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法,其特征在于最佳的條件為PEG6000的質量百分數(shù)為13.3%,(NH4)2S04的質量百分數(shù)為21.4%,pH值為7,溫度為25t:,在一個大氣壓條件下操作。3.根據(jù)權利要求1所述的一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的測定方法,其特征在于使用儀器UV-722型紫外可見光分光光度計、分析天平;(1)苯酚_硫酸法測定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀釋10倍,再取lmL稀釋液加0.5mL6%苯酚和2.5mL濃硫酸,混勻后靜置30min,用UV-722紫外-可見分光光度計在490nm下測定吸光度值;上相吸光度為0.369,下相吸光度0.06;(2)標準曲線的制作準確稱取葡萄糖O.0210g用蒸餾水溶解,定容至500mL。取10支刻度試管,分別編號0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.lmL放入1號試管,取0.2mL到2號管,以此類推,取0.9mL放入9號管,0號管里不加葡萄糖溶液,蓋上試管,搖勻,再在每只試管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL,然后立即加入2.5mL濃硫酸,搖勻;靜置30min,后在紫外-可見分光光度計上490nm測其吸光度值,記錄數(shù)值并作圖;數(shù)據(jù)如表1<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>計算得上相中多糖濃度為5.9mg/mL,下相中多糖濃度為2.0mg/mL。相關的計算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R雙水相體系上下相的體積比Vt雙水相體系上相體積,mLVb雙水相體系下相體積,mLK雙孢菇多糖雙水相體系分配系數(shù)Ct雙水相系統(tǒng)上相雙孢燕多糖的質量濃度,mg/mLCb雙水相系統(tǒng)下相雙孢菇多糖的質量濃度,mg/mLY雙孢燕多糖在上相中的收率。全文摘要一種從雙孢蘑菇中分離雙孢蘑菇多糖的方法,將雙孢蘑菇真空冷凍干燥24h;熱水浸提粗多糖加入蒸餾水,大火煮沸,文火維持,離心取上清液,沉淀放回加熱設備中加水繼續(xù)加熱致沸騰,文火維持,再離心取上清液;重復三次,將獲得的上清液用蒸餾水定容備用;雙水相萃取操作精確稱取聚乙二醇(PEG)60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入樣品稀釋液20mL混勻;同時稱取PEG60002.66g,硫酸銨4.28g,加入到50mL離心管中,加入蒸餾水20mL混勻,得到的雙孢蘑菇多糖被分配在PEG相中。利用雙水相體系萃取雙孢蘑菇多糖最大收率為80.1%,得率可以達到17.45mg/g。文檔編號G01N21/33GK101787085SQ20101012289公開日2010年7月28日申請日期2010年3月12日優(yōu)先權日2010年3月12日發(fā)明者吳疆,孫少起,楊紅澎,王玉,班立桐,黃亮申請人:天津市金三農農業(yè)科技開發(fā)有限公司
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