專利名稱：診斷凝膠組合物、制造診斷凝膠組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及用于診斷元件(element)的診斷凝膠組合物，診斷元件在用于進行快速疾病檢測和更特別地在芯片上進行免疫分析的基于微流體芯片的平臺的開發(fā)和制造中是有用的。
背景技術(shù)：
分析物(包括蛋白質(zhì)、DNA/RNA以及來自體液和其它生物來源樣本的代謝物)的檢測對于各種應(yīng)用(包括醫(yī)學(xué)測試、毒素檢測和法醫(yī)學(xué)分析)是必不可少的。這種分析物的改進的現(xiàn)場即時測試是迫切的全球需求。為這種應(yīng)用而設(shè)計的當前的系統(tǒng)受到一些缺點的困擾，如成本高，笨重和延遲的結(jié)果。因此對于系統(tǒng)的發(fā)展有大量未得到滿足的需求成本低、 便攜、方便操作和顯示出檢測的高效率。這些系統(tǒng)還應(yīng)當能夠迅速鑒別廣泛的來自生物來源的樣本的分析物。在過去十年中，微流體(芯片實驗室方法)作為這種問題的解決已取得突出(的地位)。使用微流體免疫分析的蛋白質(zhì)測量已經(jīng)成為重點領(lǐng)域之一。而微流體技術(shù)作為這種問題的解決已取得突出(的進展)，其中的很多受到缺乏可以使想法從學(xué)術(shù)實驗室轉(zhuǎn)換至工業(yè)的成熟制造能力的阻礙。它們典型地使用與標準工業(yè)方法不兼容的實驗室規(guī)模的制造技術(shù)和材料，這也是不利于許多裝置快速生產(chǎn)的規(guī)模放大(I )。裝置的所有元件需要經(jīng)發(fā)展和調(diào)整來制造滿足此處描述的要求的裝置。

發(fā)明內(nèi)容
一方面中，本發(fā)明提供一種診斷凝膠組合物。本發(fā)明的診斷凝膠組合物具有范圍從大約250納米至大約1000微米的尺寸，以及范圍從大約10千帕至約200千帕的楊氏模量。診斷凝膠組合物源自具有式D-Sp-Po的化合物；其中D是診斷基團；Sp是親水間隔基團；以及Po是可聚合的基團。在另一方面中，本發(fā)明提供一種用于制造診斷凝膠組合物的方法。該方法包括提供包括致孔劑、引發(fā)劑和具有式D-Sp-Po的化合物的組合物；使組合物聚合來形成聚合的組合物；沖洗聚合的組合物來形成診斷凝膠組合物。在另一方面中，本發(fā)明提供一種包括本發(fā)明診斷凝膠組合物的診斷元件。在另一方面中，本發(fā)明提供一種包括診斷元件的診斷裝置，其中診斷元件包括本發(fā)明的診斷凝膠組合物。


當參考附加的附圖閱讀如下詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將變得更好理解，其中整個附圖中相似的特征代表相似的部分，其中圖I是根據(jù)本發(fā)明的一方面的示例性診斷元件的圖解示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的另一方面的示例性診斷裝置的圖解示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明的一方面的具有一個以上支持口(holding port)的另一示例性診斷裝置的圖解示意圖；圖4是另一示例性診斷裝置的圖解示意圖，其中支持口順序連接；圖5是顯示分析物附著至根據(jù)本發(fā)明一方面的診斷凝膠的診斷端的圖解示意圖；圖6是顯示支持根據(jù)本發(fā)明另一方面的分析物的兩個診斷端的圖解示意圖；圖7是用于制造診斷元件的方法的示例性步驟的流程示意圖；圖8是如圖7中所解釋的方法的結(jié)果的照片示意圖，其顯示在支持口中本發(fā)明的診斷凝膠的捕獲(capture)；圖9是用于提供用來制造診斷元件的成形通道的方法的示例性步驟的流程示意 圖；圖10是用于使用診斷元件的方法的示例性步驟的流程示意圖；圖11是用于根據(jù)本發(fā)明一方面的多路(multiplex)免疫分析的診斷元件的圖解示意圖；圖12是具有根據(jù)本發(fā)明一方面的多種分析物的圖10的診斷元件的圖解示意圖；圖13是具有根據(jù)本發(fā)明一方面的熒光標記的二抗的圖11的診斷元件的圖解示意圖；圖14是本發(fā)明的診斷凝膠的照片；圖15是用含有熒光團的蛋白質(zhì)溶液處理的本發(fā)明的診斷凝膠的熒光圖像；以及圖16是用含有熒光團的蛋白質(zhì)溶液處理的水凝膠的熒光圖像。
具體實施例方式如此處和權(quán)利要求中所用，除非上下文另有明確表示，否則單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括了復(fù)數(shù)指代。應(yīng)當注意，在如下詳細描述中，相同成分具有相同的附圖標記，無論它們是否顯示在本發(fā)明不同的實施方式中。還應(yīng)當注意，為了清楚和簡明地披露本發(fā)明，圖可能不一定成比例，并且本發(fā)明的具體特征可或多或少以示意性形式顯示。一方面中，本發(fā)明提供診斷元件和包括診斷元件的診斷裝置。本發(fā)明的診斷裝置也可能被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員稱為診斷芯片或簡稱芯片。本發(fā)明的診斷元件顯示于圖I中并由數(shù)字10表示。診斷元件包括成形通道，其在圖I中通常由數(shù)字12表示。成形通道包括至少一個支持口 14。支持口以長方形的二維示意圖顯示，但它可能是任何形狀，比如，但不僅限于梯形、正方形、圓柱、立方體等以及這些形狀的組合。成形通道還包括入口通路(inletpassage) 16和出口通路18。入口通路允許針對本發(fā)明的流體和其它材料的流進入支持口以及出口通路允許流體的流出來進入合適的容器或收集器。出口和入口通路的寬度的比可以不同以便將診斷凝膠安全地支持在支持口中。本發(fā)明的成形通道通常是由適于預(yù)期目的的材料制成的，如將在此后描述的。本發(fā)明的診斷元件還包括診斷凝膠20。用于本發(fā)明的典型診斷凝膠可源自包括具有如下式的化合物的組合物D-Sp-Po ；其中，D是診斷基團；Sp是親水間隔基團；以及
Po是可聚合的基團。用于制造本發(fā)明診斷凝膠的化合物包括可聚合的基團?？删酆系幕鶊F，如此處所用，表示能夠和互補化學(xué)實體反應(yīng)形成連接的鏈(本領(lǐng)域稱為重復(fù)單位)的任何化學(xué)實體。可聚合的基團的實例是乙烯基，由兩個碳原子之間的雙鍵表示。這種基團可以和另一乙烯基反應(yīng)形成碳-碳鏈。另一個示例性可聚合的基團是環(huán)氧基，其可以和另一環(huán)氧基反應(yīng)形成烷氧基鏈。如此處所用可聚合的基團還意味著包括一個以上的化學(xué)實體。因此，一種化合物可能具有一個以上乙烯基。當出現(xiàn)多個這樣的化學(xué)實體時，那么當聚合時產(chǎn)生交聯(lián)的網(wǎng)。這在本發(fā)明中是特別有利的。在一個示例性實施方式中，用于制造本發(fā)明診斷凝膠的組合物可分別以90:10的重量比包括僅具有一個可聚合的基團的第一化合物以及具有一個以上可聚合的基團的第二化合物。在另一個示例性實施方式中，第一和第二化合物的重量比是50 :50，而在另一個示例性實施方式中，重量比可能分別是0:100。在一些其它示例性實施方式中，可聚合的基團可能是二羧基。這種基團可能與例如二醇基反應(yīng)形成聚酯。在這種情況下，考慮的化學(xué)實體是羧酸基團，而互補化學(xué)實體是醇。同樣，二羧酸和二胺可用于形成二胺。其它示例性聚合部分包括聚氨酯、聚縮醛、聚醚等。在例如二羧酸和二醇的情況 下，這可能用于包括具有三羧酸或三醇或兩者的混合物的化合物，來形成診斷凝膠所源自的化合物。在這種情況下，可能存在約10重量百分比(相對于二羧酸)的三羧酸。本發(fā)明中有用的化合物還包括親水間隔基團，在式中表示為Sp。典型的在本發(fā)明中有用的親水基團包括但不僅限于醚、醇、二羥基醇、胺、酯、酰胺、醇、羧酸等。這些基團必須存在于最終的診斷凝膠組合物中，因而在診斷凝膠形成步驟期間必然不能經(jīng)歷任何化學(xué)轉(zhuǎn)化，或者如果它們經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)化，它們必須轉(zhuǎn)化成另一個親水基團。親水基團，如此處所用，是指能夠吸水的任何基團。描述親水基團的另一種方法是那些集團，當暴露于一滴水時，水和材料表面之間的接觸角往往是銳角。一個特別有用的間隔基團是醚基團?；衔镞€包括至少一個診斷端。診斷端，如此處所用，是指可用于某些其它部分的檢測的任何化學(xué)部分。例如，診斷端可意味著用來檢測特定類型的細胞或抗原的抗體。診斷凝膠是由此處所述的組合物形成的。在一個示例性實施方式中，診斷凝膠是通過暴露于光來固化本發(fā)明的組合物而形成一個其中尺寸在約IOOnm至約1000微米的范圍內(nèi)的具有三維架構(gòu)的結(jié)構(gòu)，其中組合物具有90重量百分比的化合物(具有單個可聚合基團、間隔基團和診斷端)以及10重量百分比的具有兩個可聚合基團的化合物。尺寸可能包括長、寬、高、體積、面積、周長(circumference)、周長(perimeter)等,尺寸的選擇取決于構(gòu)架的形狀。形成診斷凝膠的一個這種方法在US2007/0105972A1中給出。本發(fā)明中可用于制造診斷凝膠的組合物還包括致孔劑。致孔劑是添加至組合物來在組合物中誘導(dǎo)具有確切特征(比如孔的尺寸、孔密度等及其組合)的孔的外來化合物。有用的致孔劑是一種有能力產(chǎn)生具有范圍從5納米到約1000納米確切尺寸的孔的化合物。在一個實施方式中，致孔劑是碳酸氫鈉，而在另一個實施方式中，致孔劑是氯化鈉，而在另一個實施方式中，它是檸檬酸。在一些實施方式中，致孔劑是一種分散于整個用于制造診斷凝膠的組合物中的液體組合物。一些實例包括但不僅限于乙酸、聚乙二醇-200、乙二醇、甘油等。在另一些實施方式中，致孔劑是氣態(tài)流體比如二氧化碳，這種氣態(tài)流體可能使用適當?shù)幕衔?比如碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈣等)在原位產(chǎn)生。在其它一些實施方式中，可通過適當?shù)氖侄伪热缥綄鈶B(tài)流體限制在組合物中。
只要知道致孔劑不會影響診斷凝膠的性能，就可允許致孔劑留在本發(fā)明的組合物中。在這種情況下，診斷凝膠還包括致孔劑。或者，可在一個步驟中洗掉致孔劑來提供診斷凝膠。致孔劑和化合物的選擇、診斷凝膠生產(chǎn)中涉及的步驟將確定是否致孔劑被允許保留或被除去或在獨立的步驟中被洗掉來形成本發(fā)明的診斷凝膠。本發(fā)明的組合物可進一步包括引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑、催化劑、鏈轉(zhuǎn)移劑、緩凝劑、抑制劑、添加劑來提供強度或改善膠凝能力，例如，以及其它有用的成分。本發(fā)明的診斷凝膠通過固化此處所述的組合物而形成。如此處所用，固化意味著至少一個可聚合基團的聚合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解根據(jù)本發(fā)明的組合物的性質(zhì)，組合物的聚合可能產(chǎn)生線性聚合物、或分支聚合物、或交聯(lián)聚合物網(wǎng)。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物的固化產(chǎn)生交聯(lián)的聚合物網(wǎng)，當聚合物網(wǎng)暴露于合適的溶劑時將形成交聯(lián)的凝膠。光解方法可有利地發(fā)揮固化作用，其涉及將組合物暴露于合適波長的光。在一個示例性實 施方式中，組合物以液態(tài)形式存在，并流入到合適的容器中。在一個具體實施方式
中，容器是診斷元件的支持口。在另一個具體實施方式
中，容器是診斷裝置的獨立部分，比如此處所述的制備口。在另一個具體實施方式
中，容器是可獨立于本發(fā)明的診斷裝置而獲得的不同的凝膠形成裝置，從此處形成的診斷凝膠分別收集并用于診斷元件中。固化通常通過組合物的暴露發(fā)揮作用，即以預(yù)先確定的一段時間通過成形罩(shaped mask)以便僅固化組合物暴露的部分。用于起到固化作用的光通常是紫外線輻射，通常具有特定波長、幅和強度，但其它輻射比如8&_&輻射也可用于固化化合物來形成診斷凝膠。起到固化作用所需的時間取決于化合物的性質(zhì)、光引發(fā)劑的量等，并且范圍可從約0. 5秒到約30秒。隨后用合適的溶劑或溶劑混合物洗滌診斷凝膠來從診斷凝膠中洗掉未固化的組合物部分。在另一個實施方式中，具有至少一個可聚合基團的單體通過部分暴露于光被部分固化?？赏ㄟ^單體在光源下暴露比完全固化所必需的時間更短的時間(例如3秒以下)來起到部分固化作用?；蛘撸部赏ㄟ^單體暴露于具有與完全固化所用光的強度不同的強度的光來起到部分固化作用。此外，也可通過使用相對于單體濃度更低濃度的光引發(fā)劑來起到不完全固化作用。隨后，本發(fā)明的化合物隨著包含有診斷端和可聚合端的化合物一起流入?？赏ㄟ^將本發(fā)明組合物進一步暴露于光源任選地以預(yù)先確定的一段時間通過成形罩來起到混合物完全固化的作用。這導(dǎo)致診斷端添加到診斷凝膠的表面。必要時最終固化產(chǎn)物可然后進行洗滌步驟?；蛘?，含有可聚合端和第一反應(yīng)基團的組合物可經(jīng)固化形成包括反應(yīng)基團的可聚合材料。這種可聚合材料可然后與包含能夠與可聚合材料上的反應(yīng)基團反應(yīng)的診斷端和共反應(yīng)基團的診斷分子反應(yīng)?？删酆喜牧仙系姆磻?yīng)基團和診斷分子之間的反應(yīng)將產(chǎn)生在本發(fā)明的診斷凝膠中。在一個示例性實施方式中，可聚合材料上的反應(yīng)基團是馬來酰亞胺基團，診斷分子上的C-反應(yīng)基團是巰基。本發(fā)明的組合物可能在其中已經(jīng)包含孔。這些孔本領(lǐng)域技術(shù)人員也稱為孔隙體積(void volume)或空洞。這些孔通常采取兩個交聯(lián)點之間的平均距離。洗滌步驟也可從診斷凝膠中洗掉致孔劑而留下診斷凝膠中的孔?？椎某叽鐚⒅苯訉?yīng)沖洗步驟之前存在的致孔劑的尺寸?；蛘?，致孔劑可被允許留在本發(fā)明的診斷凝膠內(nèi)，而仍然形成診斷凝膠內(nèi)的孔。在另一個實施方式中，來自不同光源的干擾模式可用于在本發(fā)明的診斷組合物中誘導(dǎo)孔，如Jang等人Angew Chem. 2007中描述的。這種技術(shù)省去了在組合物中對致孔劑的需要。
形成的診斷凝膠具有范圍從大約250納米到約1000微米的尺寸。如此處所用，尺寸意味著給定的幾何形狀的任何標準測量特征，并可能包括，但不僅限于長、寬、高、對角線長度、周長、直徑、半徑、或其組合。診斷凝膠的特征還在于孔的尺寸。本發(fā)明中最有用的孔的尺寸通常范圍從約5納米到約1000納米。本發(fā)明的診斷凝膠的特征還在于楊氏模量。楊氏模量的測量方法是本領(lǐng)域眾所周知的，用于測量楊氏模量的一個示例性裝置是萬能測試機(Universal Testing Machine),它采用應(yīng)力-應(yīng)變(Stress-Strain)之間的測繪來估計楊氏模量。如前所述，診斷凝膠可在前面的步驟中形成，其然后分別收集和純化、化學(xué)修飾并然后通過用合適的流動流體流動弓I入成形通道。在另一個替代實施方式中，可在成形通道單獨的區(qū)段(section)中形成診斷凝膠并 隨后流入支持口。在另一個實施方式中，組合物流入支持口，使用此處所述方法在支持口中形成診斷凝膠。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的流動方法實現(xiàn)本發(fā)明組合物的流動?；蛘?，通過使組合物流入已經(jīng)流動的不互溶的第二流體中形成本發(fā)明組合物的液滴，其中組合物以相對于第二流體流向呈直角地流入第二流體。不受任何理論的約束，液滴的尺寸和形狀通常被認為取決于組合物的粘度、第二流體造成的剪切速率(shear rate)、通道幾何以及其它因素。這些液滴可然后在支持口或成形通道單獨的區(qū)段中被固化?？紤]幾個因素以確保本發(fā)明的診斷凝膠或組合物包囊于支持口中。不受任何理論的約束，本發(fā)明的診斷凝膠或組合物流入或包囊于支持口中的能力正比于診斷凝膠的尺寸；診斷凝膠或組合物的楊氏模量；流體流動的粘度；流體流動的流動速度；形成成形通道的材料的楊氏模量；溫度；入口通路的尺寸；出口通路的尺寸；診斷凝膠或組合物的壓縮因子(compressibility factor);壓力，比如在給定表面區(qū)域的真空度等。可能有其它因素影響診斷凝膠或組合物流入其支持口和包囊的能力。因此，在一個實施方式中，成形通道由具有低楊氏模量的軟材料制成，并且診斷凝膠很硬。可用于制造成形通道的軟材料的一個實例是PDMS。在這種情況下的流動期間，軟的成形通道變形來允許診斷凝膠的流進入支持口。在另一個實施方式中，成形通道由剛性硬材料制成。硬的剛性材料的一個實例可能是聚(甲基丙烯酸甲酯)，其為各種在商業(yè)上可獲得的商品名稱為，比如Plexiglass 、Gavrieli > Vitroflex > Limacryl > R-Cast ^ Per-Clax 、Perspex 、Plazcryl .、Acrylex 、Acrylite 、Acryiplast 、Akuglas 、Polycast 、Oroglass > Optix 和Lucite 。對于這種應(yīng)用另一個有用的材料是環(huán)烯烴共聚物，商業(yè)上可獲得，例如，來自Polyplastics的Topas 。在這種情況下，正壓或負壓可用于推或拉診斷凝膠使其通過包含支持口的通道。通過在所需的位置施加真空可實現(xiàn)負壓。此外，在這種情況下，診斷凝膠要足夠軟以便它可以變形而通過入口通路進入至支持口中并在其中進行包囊(圖8 )。通過使用適當?shù)氖湛s幾何結(jié)構(gòu)阻止凝膠沿著流動的方向流出支持口，其中入口通路寬度大于出口通路寬度。在一個實施方式中，對于本發(fā)明診斷凝膠有用的楊氏模量的值范圍從約IkPa至約200kPa。一個示例性的診斷凝膠可能源自附著有胰島素抗體的聚乙二醇-二丙烯酸酯。在另一個示例性實施方式中，診斷凝膠可能是具有針對抗體的抗原的聚乙二醇二丙烯酸酯衍生凝膠，其中抗體是暴露于HIV病毒所產(chǎn)生。在一些實施方式中，通過適當使用正和負壓將診斷凝膠保持在特定位置中。正壓可用于迫使流通過通道，而負壓可用于延緩流通過通道。通過在所需的位置施加真空可實現(xiàn)負壓。因此，診斷凝膠可流經(jīng)通道，然后通過在經(jīng)過通道壁的位置施加真空來留在特定位置中。這還將意味著通道壁由適于向其中施加真空的材料制成，而同時對流經(jīng)它的流體是不通透的。回至圖I,本發(fā)明的診斷元件還包括入口通路上的第一凹槽(recess)22和位于出口通路的第二個凹槽24。第一和第二凹槽以這種方式定位從而支持口位于兩個凹槽之間。提供凹槽從而有助于僅去除支持口而留下入口通路和出口通路不動。含有診斷凝膠并已經(jīng)在凹槽處被去除的支持口可然后用于各種診斷目的。在一個示例性的實施方式中，診斷凝膠經(jīng)受顯微觀察以確定存在或缺乏某些顯微鏡下可見的顆粒。在其它示例性實施方式中，診斷凝膠經(jīng)受預(yù)先確定的提取方法步驟來提取附著至診斷端的任何外來的顆粒。在一個示例性的實施方式中，診斷凝膠經(jīng)受合適波長和已知強度和幅度的輻射用于定量的目的。在一個實施方式中，本發(fā)明診斷元件可包括一個以上的診斷凝膠。每個診斷凝膠具有用于鑒別一個特定部分的特異性目的的不同診斷端。每個診斷凝膠可具有組合物的其它方面，比如相同或不同的間隔基團和可聚合基團。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇 適當?shù)膮⑴c組合物的成分組合，來制造診斷凝膠而不產(chǎn)生非常不適當?shù)膶嶒?。多個診斷凝膠的存在將允許多路檢查并使用單個芯片進行診斷，從而大大減少了涉及的時間和精力。在另一個實施方式中，本發(fā)明的診斷元件可包括含有空間上隔離的診斷端的診斷凝膠，其中每個診斷端可能是相同或不同的。制造這樣的診斷凝膠的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，例如(圖 4, [2] 43) Dendukuri, D. , Pregibon, D. C. , Collins, J. , Hatton, T. A.和Doyle, P. S. "Continuous Flow Lithography for High-Throughput MicroparticleSynthesis", Nat. Mater. , 5, 365-369，May 2006。圖2顯示本發(fā)明的診斷裝置26。診斷裝置包括至少一個支持口 12，入口通路16和出口通路18。為方便起見，視覺目的此處只顯示支持口而診斷凝膠14此處未顯示。相似地，第一凹槽22和第二凹槽24此處未顯示，然而它們可能還出現(xiàn)在本發(fā)明的診斷裝置中。診斷裝置還包括至少一個進入口 28。進入口可能是用于向裝置中引入合適的流體的容器。適用于裝置的流體可能包括用于分離和鑒別的任何溶劑。流體有時本領(lǐng)域中也稱為流動相。在一個實施方式中，引入裝置的流體可能是磷酸鹽緩沖液。裝置還包括樣本引入口，通過引入口待分析的樣本引入到裝置中。進入口可用作樣本引入口，或者分開的口可用于基于診斷裝置的預(yù)期應(yīng)用的目的。含有興趣實體的樣本，本領(lǐng)域也作分析物，典型地作為流動相中的溶液弓I入至裝置中，通常其中樣本的濃度未知。在一些實施方式中，一個或多個進入口也可作為樣本引入口用于樣本向診斷裝置中的合適引入。用于樣本引入的典型方法包括樣本溶液的注射。如圖2中所示，一個以上的進入口可出現(xiàn)在給定的裝置中。裝置可能夠僅利用對于給定應(yīng)用必須數(shù)目的進入口而封閉裝置其余部分的進入口以確保裝置的運作順利進行。裝置然后包括入口臂(inlet arm) 30，其將進入口連接至裝置的其余部分。每個進入口連接一個入口臂。然后裝置包括制備口 32。制備口可具有很多功能，這取決于最終的應(yīng)用。在一個示例性的實施方式中，制備口攪動流動流體為了更好地混合來自各種進入口的流體。在另一個示例性實施方式中，制備口用于流動相脫氣。在另一個示例性實施方式中，制備口可用于從樣本中濾出超過I微米閾值尺寸的細胞或其它顆粒。裝置然后包括排出口 34(outlet port)，其連接至出口通路。排出口可以是廢物處置的槽，或它是一個容器以收集所有通過裝置的流體。流體通常通過本領(lǐng)域已知的方法流入裝置。在一個典型的實施方式中，使用流速可控的計量泵將流體泵入裝置。在另一個實施方式中，在裝置的排出口側(cè)施加吸入壓力，其允許流體的流動。在其它一些實施方式中，在裝置特定點上施加電磁力，其使得流動成為可能。用于發(fā)揮流體流動作用的其它方法包括但不僅限于毛細管流、聲學(xué)驅(qū)動的流、離心驅(qū)動的流、壓電泵等。在一個示例性的實施方式中，本發(fā)明的診斷凝膠是在高的壓力下被迫使進入支持口，并然后使用比它流入的壓力更低的壓力保持在支持口內(nèi)。這使得診斷凝膠在操作期間能夠牢固地安置在支持口內(nèi)。在一個說明性的實施方式中，當裝置處于其功能狀態(tài)時，它包括一個進入口，通過進入口樣本以預(yù)先確定的流速泵入裝置。樣本通過入口臂，并隨后在制備口被過濾。樣本然
后通過含有診斷凝膠或其它吸收材料(比如在其中含有生理包囊的、熒光標記的檢測抗體的基于多糖的材料)的第一支持口。這些抗體結(jié)合特異的分析物，比如樣本中存在的HIV病毒誘導(dǎo)的抗體，形成復(fù)合物，其然后濾出診斷凝膠，并而后向下游轉(zhuǎn)運至第二診斷凝膠。第二診斷凝膠含有在其表面上化學(xué)結(jié)合的一抗種類，一抗種類對興趣分析物也是特異性的。然后在第二診斷凝膠的位置形成一抗-分析物-二抗的三重復(fù)合物。分析物的剩余部分然后通過出口通路流出進入排出口。通過檢查從三重復(fù)合物發(fā)出的熒光信號可推斷感興趣分析物的存在和濃度。在一個示例性的實施方式中，診斷元件包括具有分析物吸附部分的診斷凝膠，其然后在第一和第二凹槽處切斷。這種切斷的診斷元件然后進行分析來確定例如疾病傳播的性質(zhì)和程度。在另一個示例性實施方式中，診斷工具，如顯微鏡，用來分析作為診斷裝置的一部分而存在的診斷元件，其中將診斷工具帶到距離診斷元件合適的距離以便發(fā)揮適當診斷的作用。在對上述說明性實施方式的變化中，現(xiàn)在吸附至分析物的本發(fā)明的診斷凝膠的診斷部分現(xiàn)在通過使用合適的溶劑混合物使其流出而從原始診斷凝膠中分離出來，然后流入隨后的包括不同診斷凝膠的支持口，該不同診斷凝膠具有可以吸附含有分析物的第一診斷端的不同診斷端，來形成第二診斷元件。第二診斷元件然后用于診斷。圖3顯示本發(fā)明的一個示例性診斷裝置，其包括一個以上支持口，其中的每個由數(shù)字12表示，每個支持口與其自己的入口通路16和出口通路18連接。在這個具體的實施方式中，支持口彼此平行連接。流動相利用適當?shù)氖侄瘟魅朊總€支持口，比如通過在特定的點使用吸入或施加真空以確保流入所需的支持口。圖4顯示本本發(fā)明的另一個示例性診斷裝置，其中裝置包括一個以上支持口，以及其中支持口中的每個與其它串連。方便起見，圖3和圖4都不顯示支持口內(nèi)所載的診斷凝膠。圖5顯示診斷凝膠發(fā)揮功能的方式的簡單可視化，由數(shù)字40表示。診斷凝膠包括診斷端42，合適的分析物44附著于此診斷端。這樣選擇診斷端從而它對一種類型分析物是選擇性且特異性的。因此，包括除分析物以外任何物質(zhì)的流動相通過并環(huán)繞診斷端，而特異性分析物由診斷凝膠支持。圖6顯示另一方式的可視化46，其中兩個不同診斷凝膠42用于在位置上支持分析物44。利用這種可視化的一個典型示例性情況是夾心ELISA，其中分析物在兩個不同互補診斷端之間被支持在位置上?？墒褂冒ㄒ粋€以上支持口的本發(fā)明的診斷裝置有利地進行這種分析形式，其中支持口串行方式排列?？墒褂帽景l(fā)明的診斷裝置進行的其它已知技術(shù)，如以ELISA技術(shù)為例，包括競爭性ELISA、夾心ELISA、化學(xué)發(fā)光免疫分析、PCR擴增的ELISA、ELONA (酶聯(lián)寡核苷酸分析)、DNA微陣列等?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的適當技術(shù)實現(xiàn)有分析物連接至其上的診斷凝膠的檢測。標準技術(shù)包括但不僅限于光學(xué)顯微鏡、突光、化學(xué)發(fā)光、電致磷光、電位法、比色法、吸收、表面等離子體共振等及其組合。在另一方面中，本發(fā)明提供制造診斷元件的方法。方法步驟涉及圖7中顯示的診斷元件的制造并通常由數(shù)字48表示。方法包括提供成形通道50的步驟。方法還包括診斷凝膠52通過入口通路進入支持口流入的步驟?？赏ㄟ^以預(yù)先確定的流速泵送流體(比如流動相)起到流動的作用，為的是在診斷凝膠上采用合適的壓力從而其可以擠過入口通路并進入支持口，但是不通過出口通路。因此，如在步驟54中所示，診斷凝膠被包囊在支持口中。在替代的實施方式中，診斷凝膠在支持口內(nèi)形成，并隨后流體流入支持口來洗掉與診斷凝膠無關(guān)的所有外來成分。洗滌步驟還可誘導(dǎo)診斷凝膠膨脹至其最大容量來使得診斷凝膠 能夠發(fā)揮更好的功能。在替代的實施方式中，診斷凝膠流入支持口，并隨后通過適當?shù)氖褂脤χС挚诒谒┘拥恼婵帐顾谖恢蒙媳恢С衷谥С挚趦?nèi)。包括診斷凝膠的診斷元件被施加分析物之后，診斷元件可被切出，如在步驟56中所示?？稍诘谝缓偷诙疾郯l(fā)生切割。或者，只在第一凹槽處切割診斷元件，因此診斷元件連同出口通路被移除，并且適用時，連同排出口和其它部分。圖8顯示使用本發(fā)明方法將本發(fā)明診斷凝膠捕獲在支持口中的過程中拍攝的圖像。圖8 (a)顯示通過入口通路16進入支持口 12之前，在制備口 32中的診斷凝膠14。圖8 (b)顯示通過入口通路16被擠入支持口 12的診斷凝膠14。在這種具體的例子中，通過使用合適流速的流動相的流迫使診斷凝膠進入支持口。圖8 (c)顯示診斷凝膠14現(xiàn)在被困于支持口 12中。不允許診斷凝膠穿入出口通路18，因為出口通路的尺寸是這樣的，其不利于診斷凝膠的通過。一個用于提供成形通道的示例性方法，由圖7中數(shù)字50表示，還顯示于圖9中并由數(shù)字50表示，其中方法包括提供包括圖式的通道的硅晶片58。包括圖式的通道的硅晶片可就如此購自商業(yè)來源，或可能通過使用本領(lǐng)域已知的標準精細加工(microfabrication)技術(shù)通過蝕刻或光刻的適當使用以容易的方式產(chǎn)生。一個示例性光刻方法涉及光阻材料SU-8的使用。然后，該方法包括將第一可固化材料60傾注到含有陽性(positive)特征的硅晶片上來形成陰刻(negative relief )中的可固化通道。典型的可固化材料包括當暴露于高溫或具有合適波長的合適輻射時固化的那些?？捎糜谶x擇可固化材料的特征中的一些可包括可固化材料的流動性、當暴露于固化條件時的固化時間、固化材料的性質(zhì)比如透明度、強度等。一些示例性材料包括但不僅限于PDMS、聚氨酯等。在一些實施方式中，材料的組合可用作第一可固化材料。用于形成成形通道的方法然后涉及固化可固化的材料，如圖9中由數(shù)字62表示?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適方法起到固化的作用。示例性方法包括加熱、暴露于UV輻射等。固化導(dǎo)致圖式材料從可固化材料的形成。隨后圖式材料從硅晶片上剝離，如圖9中由數(shù)字64表示。從硅晶片上剝離的圖式材料封閉到至少一個表面上，如圖9中由數(shù)字72表示。在一個示例性實施方式中，當可固化材料是PDMS時，可能通過對其進行加熱約60分鐘來起到固化作用，而后將其從硅晶片上剝離，通過按壓至玻片上進行可逆地封閉或通過血衆(zhòng)激活的粘附(plasma-activated adhesion)不可逆地封閉至玻片上。在另一個實施方式中，通過將可注射成型的或熱壓紋(embossable)的材料注射成型來提供封閉的通道，比如熱塑材料。典型的可注塑成型的塑料包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰亞胺、環(huán)烯烴共聚物(COC)等。這種塑料典型地從各種商業(yè)來源可獲得。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明有用的塑料是聚(甲基丙烯酸甲酯)。然后使用適當?shù)恼澈戏椒ū热鐭嵴澈匣蛘澈蟿┗罨恼澈蟻硖峁┩耆忾]的裝置將復(fù)制的塑料裝置封閉至相似塑料的平板。在另一方面中，本發(fā)明提供一種用于使用本發(fā)明的診斷元件的方法。這種方法在圖10中以圖解方式表示，并由數(shù)字76表示。方法包括使樣本78流經(jīng)入口通路進入包括至少一個診斷凝膠的診斷元件來提供分析物診斷元件。然后分析分析物診斷元件來檢測和分析物有關(guān)的屬性80。包含在具有分析物的本發(fā)明診斷裝置中的診斷凝膠的診斷端之間的相互作用的確切性質(zhì)形象地顯示于圖3和4中。
在一個說明針對多路免疫分析的診斷元件形成的示例性實施方式中，其中診斷元件包含如下特征如US2007/105972A1中所述，使用獨特的微流體方法學(xué)形成含有三條水凝膠84的診斷元件，其在圖11中顯示并指定為數(shù)字82。簡言之，該方法涉及使用層流來形成空間上分隔的水凝膠84的條，然后通過成形光罩使用UV光聚合來形成具有形狀定義的固體水凝膠。水凝膠84的每個條包括特異性的捕獲抗體86、88和90。在這個示例性的實施方式中，水凝膠的每個條約100 μ m寬且200-330 μ m長。圖12顯示診斷元件用于多路免疫分析的用途，由數(shù)字92表示。自動化流體控制然后用于將特定的體液提供到含有這些水凝膠條84 (水凝膠條包括特異性的捕獲抗體86、88和90)的芯片上，芯片然后被允許孵育一段預(yù)先確定的時間。孵育所需的時間將取決于抗體和抗原性質(zhì)、物理特征如溫度、壓力等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。孵育幾分鐘后，抗體86、88和90將自身結(jié)合至特異性抗體，其中特異性抗體在圖12中由數(shù)字92、94和96表示。隨后，進行洗滌步驟以允許任何未結(jié)合的抗原被洗掉。圖13顯示針對分析步驟的診斷元件的制備，由數(shù)字98表示。在這一步中，在圖13中由數(shù)字100表示的熒光標記的二抗然后流經(jīng)芯片，并在未結(jié)合的熒光標記的抗體被洗掉之前孵育幾分鐘。通常熒光標記的二抗的附著是非特異性的，并能夠結(jié)合給定系統(tǒng)中的任何抗原或抗體。或者，熒光標記的二抗僅能夠結(jié)合至特異性抗原或抗體的特異性基團。然后從每個道讀取熒光信號，使用熒光信號推導(dǎo)出樣本中存在的各抗原的量。這種分析系統(tǒng)提供的巨大優(yōu)勢是僅僅小體積的血清Γ μ I)就是進行分析所全部需要的。熒光信號靈敏度將取決于所用的檢測器，并可以潛在地讀至皮摩爾(10-12Μ)水平。該方法此處僅顯示了 3條的情況，但可以很容易地擴展直至10種蛋白質(zhì)，并且通過使用蛋白質(zhì)陣列而不是它們的條可甚至擴展至更大的數(shù)目。本發(fā)明還解決了給定的興趣顆粒包囊和定位在特定區(qū)域內(nèi)的普遍問題，所述問題已由Becker等人Anal. Bioanal. Chem.(2008)390:89-111中描述。本發(fā)明的方法可進一步被用作一種用于在閥、電極中流動以及用于控制合適的對象(比如細胞)在特定給定區(qū)域定位的技術(shù)。實施例水凝膠形成
包括以下成分的組合物用于形成本發(fā)明的診斷凝膠12. 3微升(μ I)聚乙二醇二丙烯酸酯-700 (PEG-DA-700)來自(Sigma Aldrich),O. 4ul 光引發(fā)劑DAR.OCUR 1173,5毫克(mg) NaHCO3 (O. 62M)和87 μ I磷酸鹽緩沖液(PBS)。暴露條件_10秒。光強度25-100mW/cm2的光。H=75微米(μπι)。W=200_400 μ m。暴露期間使用矩形罩。本發(fā)明診斷凝膠的尺寸如下300 μ m長、200 μ m寬和75 μ m厚。圖14顯示本發(fā)明診斷凝膠的照片，由數(shù)字102表示。致孔劑引起的孔此處清晰可見。在一個比較實施例中，包含如下成分 的組合物用于形成水凝膠12. 3 μ lPEG-DA-700Sigma Aldrich,O. 4 μ I DAROCUR 1173 光引發(fā)劑和 87 μ I PBS 用于制造水凝膠。比較實施例制造的水凝膠的尺寸與本發(fā)明的診斷凝膠的相似。此處描述的來自實施例的診斷凝膠和來自比較實施例的水凝膠然后用FITC標記的胰島素抗體(是一種含有熒光團的150千道爾頓的蛋白質(zhì))的100μ g/ml水溶液進行處理。圖15顯示用含有熒光團的蛋白質(zhì)溶液處理的診斷凝膠的熒光圖像，由數(shù)字104表示?？梢钥闯?，含有熒光團的蛋白質(zhì)能夠滲透有孔的本發(fā)明的診斷凝膠，因此掩蔽了診斷凝膠的輪廓。圖16顯示用含有熒光團的蛋白質(zhì)溶液處理的比較實施例的水凝膠。由數(shù)字106表示的水凝膠顯示蛋白質(zhì)不能滲透水凝膠，正如凝膠的深色所證實的。實施例的有孔的水凝膠還顯示能夠以適當?shù)膲毫?真空值“擠”入支持口的性質(zhì)。如在比較實施例中所述的未使用NaHCO3制備的水凝膠，是剛性的且不能隨意擠入支持口。裝置的制造通過將聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184,Dow Corning)傾至含有在SU-8光阻(Microchem)中的圖式的陽刻(positive relief )通道的娃晶片上制造裝置。PDMS裝置的厚度始終保持在5mm或更大。通過使用手術(shù)刀切下PDMS通道、使用活檢鉗(biopsy punch)在一端打孔來制取進入口來制造裝置。將PDMS的薄祭層單獨放置在通道上和放置在剛好位于通道下方的玻片區(qū)域上之后，PDMS裝置而后用血漿封閉至旋涂有PDMS的玻片上。這是為了確保低聚物僅暴露于非-血漿處理的PDMS表面，同時確保該裝置仍然是有效的封閉。在AUTOCAD 2007 中設(shè)計并使用來自 Fineline Imaging (Boulder, CO)的高分辨率打印機打印含有閥形(valve shapes)的光罩。每個罩插入至待用于投影光刻法的顯微鏡場闌中。100W HBO汞燈用作UV光源。提供寬的UV激發(fā)的濾鏡組(11000v2:UV，Chroma)用于選擇所需波長的光，并且由計算機控制的VCM-Dl快門驅(qū)動器所驅(qū)動的VS25快門系統(tǒng)(Uniblitz)提供UV光的特定脈沖。所用的典型暴露時間是100-1000毫秒(ms)以及壓力為0. I和I磅每平方英寸(psi)之間。裝置被安裝在倒置顯微鏡上(Ti-S，Nikon)，使用CXD相機(Micropublisher3. 3RTV, Qimaging)觀察凝膠結(jié)構(gòu)的形成。微流體裝置的設(shè)計和制造微流體裝置的設(shè)計顯示于圖2中。微流體裝置具有組合而形成通道的三個入口(用于蛋白質(zhì)的多路化)以及在另一端有單個出口。通道尺寸為5000 μ m長度、300 μ m寬度和75μπι高度。在一端被收縮的通道寬度稱為收縮區(qū)或擠壓凝膠的入口通路。收縮(區(qū))的左側(cè)被稱為凝膠形成區(qū)或制備口，在其中抗體使用層流理論以多路的方式被聚合來形成有孔的水凝膠。凝膠擠過收縮(區(qū))并困在稱為捕獲(trap)區(qū)或支持口的收縮(區(qū))的另一側(cè)。三種具有不同寬度收縮的不同裝置被指定為200 μπι、150 μ和100 μπι。出口通道的寬度是收縮區(qū)通道寬度的一半，即分別為100 μ m、75 μ m和50 μ m。
試劑包囊過程需要兩個步驟-首先是水凝膠的制造，且第二個是水凝膠捕獲(trapping)。使用之前設(shè)計的停流光刻技術(shù)制備水凝膠結(jié)構(gòu)。對于水凝膠捕獲一個重要的要求是制造的結(jié)構(gòu)足夠柔軟以便能夠擠過收縮(區(qū))。為了實現(xiàn)這一目標，使用此前所述技術(shù)制造大孔水凝膠結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)顯示出必要的機械性能，以允許它們流經(jīng)比它們未受限的尺寸小的通道收縮。裝置交界使用D771-11 BTC-IIS系列微型泵(Hargraves，USA)產(chǎn)生的真空和壓力源來控制流經(jīng)微流體通道的流體。源通過Tvgon管連接至微流體裝置，并且使用Labview軟件控制的微型化“Ten Millimeter”螺線管閥(Pneumadyne, USA)自動化流體運行。檢測使用通過Coolsnap EZ CO)相機(Photometries, Singapore)捕獲的圖像測量從水凝膠發(fā)出的熒光信號的檢測。定量前使用ImageJ軟件對來自每個條的信號強度取平均。通過減去來自對照條(不含一抗)的信號進行噪音過濾。 壓力對水凝膠捕獲的作用水凝膠捕獲依賴這樣的前提，即需要特定的最小閡值壓力(Pmin)來擠壓結(jié)構(gòu)通過比它寬度更小的通道。此外，一旦捕獲，顆粒在其向相反方向擠出之前可以承受特定的最大壓力(Pmax)。因此,在生產(chǎn)過程中，使用壓力Pman其中(Pmin < Pman < Pmax)。分析期間，所用壓力(Peli)必須是這樣的從而顆粒不按照其進入的方向擠出，所以我們令Peli
<Pmin0所述的閡值壓力是水凝膠機械性質(zhì)和通道結(jié)構(gòu)幾何的函數(shù)。描述閾值壓力對這些參數(shù)的定量依賴性的等式可基于常識和用戶技能、經(jīng)驗和裝置的歷史數(shù)據(jù)而產(chǎn)生。在我們的實驗中，向用于試劑的流(其構(gòu)成水凝膠的結(jié)構(gòu))的口施加正壓，并向拉進(draw in)制造的水凝膠結(jié)構(gòu)所需的口施加真空。使用計算機控制的螺線管閥交替施加壓力和真空。通道數(shù)目的作用所述的包囊方案可擴展到制造含有包囊的水凝膠的大量通道。在一個實施例中使用PDMS墊片并通過單獨的通道進行控制，根據(jù)需要向通道施加壓力和真空來分別關(guān)閉和打開墊片。通過微型3-路螺線管閥(Pneumadyne)施加壓力或真空，并使用LabviewTM編寫的程序進行控制。雖然此處僅說明和描述了本發(fā)明的具體特征，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員仍將想到很多改造和變化。因此，應(yīng)當理解隨附的權(quán)利要求意圖涵蓋落入本發(fā)明真正精神內(nèi)的所有這些改造和變化。參考文獻I. Becker，H. and C. Gariner3 Polymer microfabrication technologies formicrofluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008. 390 (I)p. 89-111.2. Dendukuri , D.，e t a I.，Con t i nuou s_f I ow lithography forhigh-throughputmicroparticle synthesis. Nat Mater,2006. 5(5) p. 365-369.
權(quán)利要求
1.一種診斷凝膠組合物，其具有范圍從大約250納米到大約1000微米的尺寸，以及范圍從大約10千帕至大約200千帕的楊氏模量，其中診斷凝膠組合物源自具有下式的化合物D-Sp-Po ； 其中D是診斷基團； Sp是未水間隔基團；以及 Po是可聚合的基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷凝膠組合物，其中D是通過抗病毒表面抗原的體所生產(chǎn)的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷凝膠組合物，其中Sp是基于聚乙二醇的基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷凝膠組合物，其中Po是乙烯基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷凝膠組合物，其中還包括具有范圍從大約5納米到大約1000納米孔的尺寸的孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷凝膠組合物，其中Po是乙烯基并且Sp是基于聚乙二醇的基團。
7.一種包括I的診斷凝膠組合物的診斷元件。
8.一種包括權(quán)利要求6的診斷元件的診斷裝置。
9.一種制造診斷凝膠組合物的方法，所述方法包括 提供包括致孔劑、引發(fā)劑和具有下式的化合物的組合物；D-Sp-Po ； 使組合物聚合來形成聚合的組合物； 洗滌聚合的組合物來形成診斷凝膠組合物； 其中D是診斷基團；Sp是親水間隔基團；以及Po是可聚合的基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中聚合是通過光聚合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中通過光罩發(fā)揮聚合作用。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中致孔劑是碳酸氫鈉。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中引發(fā)劑是光引發(fā)劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中D是特異于特定抗原的HIV-抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中D是適配子。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中D是寡核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中Sp是基于聚乙二醇的基團。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中Po是乙烯基。
19.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中還包括洗掉致孔劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作診斷裝置中診斷元件的診斷凝膠組合物。診斷凝膠組合物源自具有式D-Sp-Po的化合物，其中D是診斷基團；Sp是親水間隔基團；以及Po是可聚合的基團。本發(fā)明的診斷凝膠組合物具有范圍從大約250納米至大約1000微米的尺寸，以及范圍從大約10千帕至約200千帕的楊氏模量。本發(fā)明還提供制造診斷凝膠組合物的方法。該方法包括提供包括致孔劑、引發(fā)劑和具有式D-Sp-Po的化合物的組合物；使組合物聚合來形成聚合的組合物；以及沖洗聚合的組合物來形成診斷凝膠組合物。
文檔編號G01N33/543GK102812361SQ200980163137
公開日2012年12月5日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者D·登達克日, R·卡提亞, L·P·西梵庫馬蘭 申請人:阿茨拉實驗室有限公司