專利名稱：蘇丹紅elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及檢測蘇丹紅含量的試劑盒，特別是檢測辣椒醬、 辣椒油、辣椒粉食品中蘇丹紅含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。 背景技術(shù)：
蘇丹紅(Sudani)屬于人工合成偶氮類化工染料之一，主要用于 機油、蠟和鞋油等工業(yè)產(chǎn)品的染色。國外動物實驗表明，蘇丹紅染料會導致鼠類患癌，其代 謝產(chǎn)物苯胺可直接作用于人體肝細胞，從而引起中毒性肝病，長期攝入苯胺可造成人體的 神經(jīng)系統(tǒng)損害，為此國際癌癥研究機構(gòu)將其列為第三類可致癌物質(zhì)。這類物質(zhì)雖缺乏足夠 的直接使人類致癌的證據(jù)，但是所具有的潛在致癌危險是無可置疑的，如果短期內(nèi)大量食 用則會引起死亡。因此世界各國都禁止將蘇丹紅作為食品生產(chǎn)中的添加劑，1995年歐盟禁 止將蘇丹紅作為食用色素在食品中添加，我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760-1996) 也不允許在食品中添加蘇丹紅。 目前國內(nèi)外有關(guān)食品中蘇丹紅檢測方法大都采用液相色譜法或液相與質(zhì)譜聯(lián)用 的方法進行檢測，但上述幾種檢測方法所使用的設(shè)備價格昂貴，檢測過程繁瑣，不適合現(xiàn)場 監(jiān)控和大量樣本篩查。(三)實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的蘇丹紅 含量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含 量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中蘇丹紅含量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。 本實用新型的技術(shù)方案是一種檢測食品中蘇丹紅含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒 體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一 份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯試劑板作為固相載體，酶標板由 外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8 個反應孔，在試劑盒酶標板微孔條上預包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原制成檢測板，放入真空鋁箔袋中， 盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將放入真空鋁箔袋中，將6瓶lml梯度濃度的標準品溶 液、lml高濃度標準品溶液、12ml酶標二抗、0. 8ml蘇丹紅抗體濃縮液、7ml顯色液A液、7ml顯 色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、20ml抗體稀釋液試劑用不同大小、不同顏色的塑料 瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)控報告一同 封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準 分析孔)，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁 箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準確性。檢測時，樣本中的蘇丹紅將和 酶標板微孔條上預包被的蘇丹紅偶聯(lián)抗原競爭抗蘇丹紅抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物 顯色，樣本吸光度值與樣本中所含蘇丹紅的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應的 稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中蘇丹紅含量，其操作簡便易行。 經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度水基質(zhì)樣本的最低檢測限為100 ii g/kg、 油基質(zhì)樣本的最低檢測限為100ii g/kg、粉末狀樣本的最低檢測限為120ii g/kg ;水基質(zhì)樣 本的回收率為85% ±15% ;油基質(zhì)樣本的回收率為85% ±15% ;粉末狀樣本的回收率為 85% ±20% ;相對于其他蘇丹紅檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、氮氣吹 干裝置、渦旋儀、離心機、振蕩機和微量加樣器，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。[0007] 本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于蘇丹紅含量的檢測。

圖1為本實用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm); 圖2為本實用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm); 圖3為本實用新型酶聯(lián)板的俯視圖； 圖4為本實用新型蓋板膜平面圖； 圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖； 圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖； 圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。
參見附圖酶標反應微孔條(2)預包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標板的外框 支撐架(1)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱 內(nèi)反應時封蓋酶標反應微孔條(2);透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗 滌液；藍色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝20ml抗體稀釋液；白色帽(6)的白色塑料 試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色 液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶 (8)用于封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝O. 8ml蘇丹紅抗體濃 縮液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝lml/瓶的標準品溶液及l(fā)ml高濃度標準品溶 液；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18) ，20ml抗 體稀釋液(11) ，7ml顯色液A液瓶位(14) ，7ml顯色液B液瓶位(13) ，7ml終止液瓶位(12)， 0. 8ml蘇丹紅抗體濃縮液瓶位(16) ， 12ml酶標二抗瓶位(15) ，6種lml/瓶各種濃度的標準 品溶液及1瓶lml高濃度標準品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。 本實驗新型的實施例 —、樣本的前處理 1.配液 配液1 :lmol/L氫氧化鈉溶液 稱取4. 0g氫氧化鈉，加去離子水溶解定容至100ml。 配液2:洗滌工作液 用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 : 19體積比進行稀釋(或按所需量稀釋)(1 份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌。 2.以蘇丹紅為食品添加劑的樣本(水基質(zhì)、油基質(zhì)及粉末狀)處理步驟稱取2g樣本至聚苯乙烯離心管中，加入10ml乙腈，劇烈震蕩10min，室溫3000rpm
以上離心10min ;移取lml上清液于5(TC環(huán)境下氮氣吹干；加入4ml正己烷渦動30s溶解干
燥的殘留物；加入lmol/L NaOH溶液lml，渦動15s，室溫3000rpm離心10min ;移取lml上
清液于5(TC環(huán)境下氮氣吹干，加入lmlDMF充分溶解干燥的殘留物，取100 yl加入900 yl
去離子水中混勻，得到待測樣品溶液。 二、使用試劑盒的操作步驟 1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫(20_25°C )平衡30min以上，注意每種液 體試劑使用前均須搖勻。[0027] 2、取出板架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗滌液在使用前也需要回溫。 4、濃縮抗體用抗體稀釋液11倍稀釋(1份抗體濃縮液加入10份抗體稀釋液)。 5、編號將樣本溶液和標準品工作液對應微孔按序編號，每個樣品溶液和標準品 工作液做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。 6、加標準品工作液/樣本溶液加標準品工作液/樣本溶液50 ii 1到各自的微孔 中，然后加抗體工作液50ia/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25t:環(huán)境中反應30min。 7、取出微孔板，甩出孔內(nèi)液體，用洗滌液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭剌破)。 8、加入酶標二抗工作液100 iU/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板置于25t:環(huán)境 反應30min，取出重復步驟7。 9、顯色每孔先加入底物液A液50 iU，再加B液50 y 1，輕輕振蕩混勻，25。C環(huán)境 中避光顯色15min。 10、測定每孔加入終止液50 ii 1，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用 雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD (若無酶標儀，則不加終止液用 目測法可進行判定)。 三、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第l種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與蘇丹紅含量成負相關(guān)。 1、用樣本的平均吸光度值與標準品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(P g/L)。 假設(shè)樣本1的吸光度值為0. 211，樣本2的吸光度值為0. 785，標準液吸光度值分別是 0 ii g/L為2. 100 ;0. 5 ii g/L為1. 580 ; 1. 5 ii g/L為1. 010 ;4. 5 ii g/L為0. 580 ; 13. 5 ii g/L為 0. 308 ;40. 5 ii g/L為0. 120。則樣本1的濃度范圍是13. 5 y g/L_40. 5 y g/L乘以其對應的 稀釋倍數(shù)；樣本2的濃度范圍是1. 5 ii g/L-4. 5 y g/L乘以其對應的稀釋倍數(shù)。 2、定量分析 (1)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) = - x 100%
BO B-標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L標準溶液的平均吸光度值 (2)標準曲線的繪制與計算 以標準品百分吸光率為縱坐標，以蘇丹紅標準品濃度(P g/L)的半對數(shù)為橫坐 標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應 的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中蘇丹紅實際含量。 四、測定前的注意事項 1、室溫低于2(TC或試劑及樣本沒有回到室溫(20_25°C )會導致所有標準的OD值 偏低。[0048] 2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性， 重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。 3、試劑混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。 4、反應終止液為2mol/L硫酸，避免接觸皮膚。 5、儲存條件 保存試劑盒于2-『C，不要冷凍；將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、0D值的變化。
不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。 7、試劑變質(zhì)的跡象 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5(A450nm < 0. 5)時，表示試劑可能變質(zhì)。 8、加A、 B液后一般顯色15min即可，若顏色較淺，可延長顯色時間，但不能超過 30min。 9、該試劑盒最佳反應溫度為25t:，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權(quán)利要求一種檢測食品中蘇丹紅含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準品溶液、酶標二抗、抗體濃縮液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、抗體稀釋液，下凹瓶位共15個。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標 板，放于真空鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體濃縮液用綠色帽的白色PE塑料 瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液 用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，抗體稀釋液用藍色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔 預包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液6瓶，lml/瓶， 濃度分別為0ii g/L，0. 5ii g/L，l. 5ii g/L，4. 5ii g/L，13. 5ii g/L，40. 5ii g/L ;高濃度標準品 溶液1瓶，lml ;酶標二抗1瓶，12ml ;抗體濃縮液1瓶，0. 8ml ;顯色液A液1瓶，7ml ;顯色液 B液1瓶，7ml ;終止液1瓶，7ml ;濃縮洗滌液1瓶，40ml ;抗體稀釋液1瓶，20ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測食品中蘇丹紅含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、蘇丹紅抗體濃縮液、蘇丹紅6個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、抗體稀釋液、高濃度標準品、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的蘇丹紅將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗蘇丹紅抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中蘇丹紅的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在辣椒醬、辣椒油、辣椒粉食品中蘇丹紅的含量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK201488998SQ20092010667
公開日2010年5月26日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者萬宇平, 何麗霞, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 汪善良, 羅曉琴, 趙正苗 申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司