專利名稱：：一種環(huán)丙沙星的檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)的檢測試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(Timeresolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)
技術領域：
，用于動物源性食品、血液、尿液及飼料中環(huán)丙沙星藥物殘留量的檢測。
背景技術：
：環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)，又稱環(huán)丙氟哌酸，屬于第三代喹諾酮類抗菌合成藥物，其抗菌譜廣、抗菌活性強，是現(xiàn)在臨床應用的氟喹諾酮類藥物中抗菌活性最強的藥物之一，已廣泛應用于人類臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)。由于這類藥易誘發(fā)細菌耐藥性，長期應用會出現(xiàn)蓄積中毒，從而可引起關節(jié)軟骨病、光敏反應、肝腎毒性及導致淋巴細胞染色體變異的基因毒性，以及可引起人肌腱破裂。它作為一種人畜共用藥，藥物殘留通過食物鏈對人體健康危害更大，不利于該類藥物對人類疾病的治療。因此加強對該藥在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)督就顯得非常必要。歐盟、美國、日本、中國等均對動物源性食品中環(huán)丙沙星最高殘留限量都作了禁用或限用的規(guī)定。目前檢測動物源性食品中環(huán)丙沙星殘留的主要方法有微生物法、熒光法、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)、毛細管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。常用的環(huán)丙沙星檢測方法是色譜檢測法和免疫學檢測法。色譜檢測法靈敏、準確，需要昂貴的儀器和專門的工作人員，而且樣品處理較煩瑣，其應用受到一定的限制，尤其是在基層大規(guī)模篩選和現(xiàn)場檢測中更加突出。免疫學檢測法靈敏、特異、快速、簡便，克服了以上的不足，適合大規(guī)模篩選。時間分辨熒光免疫分析檢測技術是近來發(fā)展迅速的高靈敏檢測手段。TRFIA其原理是利用具有雙功能基團結構的螯合劑，其一端和鑭系元素結合，另一端和抗體(抗原)上的自由氨基連接，制成Eu"標記抗體(抗原)，它與待測樣品中的抗原(抗體)結合成免疫復合物。理想情況下，測定復合物中鑭系元素的熒光強度就能確定樣品中抗原的含量，但實際上這種復合物的熒光強度相當弱，只有再加入一種增強溶液(Enhancementsolution)，使鑭系元素從復合物中解離下來，并與增強液中所含的e-奈甲酰三氟丙酮(e-NTA)重新形成微膠囊，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，即可確定樣品中抗原的量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)丙沙星檢測試劑盒及檢測方法，用于定性或定量地檢測動物源性食品、血液、尿液及飼料中環(huán)丙沙星的殘留量；檢測時間短、平均回收率高、批內(nèi)、批間誤差小，并具有簡便、快速、準確的特點。本發(fā)明的技術方案該環(huán)丙沙星檢測試劑盒是由1、多孔包被板，2、緩沖液，3、環(huán)丙沙星標準溶液，4、環(huán)丙沙星抗體，5、銪標記羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液所組成。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)來檢測CIP。采用TRFIA的技3術主要有兩個方面第一，特異性多克隆抗體的制備，利用人工抗原免疫家兔，獲得含有抗體的血清，經(jīng)過生化提純分離免疫球蛋白；第二，Eu"標記羊抗兔抗體的制備。測定方法為測定的基礎是標記免疫反應。包被有CIP-載體蛋白的微孔板，加入CIP標準溶液或樣品處理液到各自的微孔中、再加入CIP抗體，振蕩反應，游離的CIP與微孔板上的CIP-載體蛋白競爭CIP抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的CIP抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+_羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3+_羊抗兔抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中CIP的量。本發(fā)明的有益效果該試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.01ng/mL以上。圖1:環(huán)丙沙星檢測試劑盒示意圖。1、多孔包被板，2、緩沖液，3、環(huán)丙沙星標準溶液，4、環(huán)丙沙星抗體，5、銪標記羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液。圖2:CIP-TRFIA標準曲線圖。具體實施例方式實施例1:試劑盒的制備和動物源性食品檢測免疫抗原的制備本發(fā)明所述的免疫抗原為將環(huán)丙沙星采用混合酸酐法與大分子載體蛋白結合，以合成的CIP-BSA作為免疫抗原進行動物免疫。載體蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。稱取30mg300mg牛血清白蛋白，溶解于50X二氧六環(huán)水溶液6mL10mL中，調(diào)pH值為910，為A液；稱取10mg40mgCIP，溶于2mL二氧六環(huán)中，置4°C10min，依次加入三正丁胺20yL和氯甲酸異丁酯10yL，于4"攪拌30min，作為B液。將A液在4t:滴入B液，攪拌過夜。將反應液對蒸餾水透析72小時，期間換蒸餾水5次?；蛱丫厶悄zG50(S印hadexG50)柱提純，以0.05mol/LpH8.0碳酸鹽緩沖溶液洗脫。收集透析純化液或第1峰的柱洗脫液，分裝保存于-2(TC作免疫原用。環(huán)丙沙星多克隆抗體的制備將上述合成的環(huán)丙沙星-牛血清白蛋白結合物(CIP-BSA)作免疫抗原，采用皮內(nèi)或皮下多點注射方式，接種lkg1.5kg雄性新西蘭兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫時，在免疫原中加等量弗氏完全佐劑混勻制成乳劑，以后免疫均加等量福氏不完全佐劑；自第二次免疫開始，每次免疫后810天采血測試抗血清效價。觀察抗血清效價增長情況，達滿意效價時取全血分離血清?？寡褰?jīng)過3次硫酸銨沉淀后，再用層析柱分離純化，對磷酸鹽緩沖溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室溫，加入等量的0.01mol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，加入20mL飽和硫酸銨溶液(以濃氨水調(diào)至pH7.8)，搖勻，4"靜止1小時后，以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液。沉淀物用20mLO.Olmol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解，然后加入10mL飽和硫酸銨溶液(pH7.8)，搖勻，4"靜止30分鐘后，以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液。重復鹽析兩次。最終以2mL0.01mol/LpH7.8磷酸鹽緩沖溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，裝入透析袋，對2000mL0.Olmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖溶液透析12小時。將上述透析液，加入到約25克濕重的纖維素DEAE-52(取纖維素DEAE-52干粉10克，用500mL0.Olmol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液浸泡過夜，抽濾)中，4。C平衡1小時，每IO分鐘攪拌一次，傾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗濾。收集濾液，再對O.01mo1/LpH7.4磷酸鹽緩沖溶液透析12小時，最后加入適量甘油-lSt:保存。Eu3+_羊抗兔抗體的制備取溶解于50mmol/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗體lmL2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.15mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A28。-0.74A26。)，用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L。取500iiL1000iiL稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2mg0.4mg的Eu3+_N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30。C磁力攪拌反應20小時。反應液經(jīng)用80,1/LTris-HClpH7.8緩沖液平衡的S印haroseCL-6B柱(1X40cm)層析，A28。監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。固相抗原包被板制備將環(huán)丙沙星_卵清白蛋白結合物(CIP-OVA)用50mmol/LNa2C03-NaHC03pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100yL，4。C放置過夜。棄去包被液，洗滌三次，加150iiL含3g/L0VA的上述緩沖液封閉，4t:放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(rc冷凍保存。試劑的配制(1)環(huán)丙沙星標準溶液(Ong/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，100ng/mL)，從CIP純品中稀釋得到，稀釋液為0.lmol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液。(2)緩沖液8mmol/LNaC1、0.2%0VA、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lmL/LTween-80禾P0.1%NaN3的Tris—HClpH7.8。(3)洗滌液:14.5mmol/LNaC1、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50,1/LTris-HClpH7.8。(4)增強液lLpH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15ymo1P-萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)，50iimol三正辛基氧化膦(TOPO)，lmL曲拉通X-100(TritonX-100)。試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8條X12孔，可以拆分為單孔)包被有CIP-OVA。(2)6XCIP標準溶液，1.OmL/瓶，標準溶液濃度為0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，100ng/mL。(3)IXCIP抗體，用時0.5mL蒸餾水溶解。(4)1XEu3+_羊抗兔抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(5)IX增強液15mL。(6)IX洗滌液30mL，用時以蒸餾水1:25稀釋。(7)1X緩沖液30mL。實驗室應自備的試劑(1)蒸餾水或去離子水；(2)二氯甲烷；(3)正己烷；(4)0.lmol/L氫氧化鈉溶液；(5)乙腈-0.lmol/L氫氧化鈉溶液取無水乙腈84mL加入0.lmol/L氫氧化鈉溶液16mL混合均勻；(6)磷酸鹽緩沖工作液PH7.2，取1.45g磷酸氫二鈉(含12個結晶水)、0.lg磷酸二氫鉀(無水)、8.0g氯化鈉，溶解于水中并定溶至lOOOrnL。測定之前注意事項(1)使用之前將所有試劑回升至室溫(18°C30°C)。(2)使用之后立即將所有試劑放回2°C8°C。(3)如果樣品量大，建議使用多通道移液器。(4)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。(5)取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中，并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2°C8°C。具體檢測步驟如下稱取豬肉試樣3.0g(精確至0.Olg)，置于50mL離心管中，加入乙腈_0.lmol/LNa0H溶液9mL，充分混合10min，3800r/min以上、15。C離心10min，取上清液3mL，加入0.02mol/LPB緩沖液3mL，加入二氯甲烷8mL，充分混合10min，3800r/min以上、15。C離心10min，去除上清液，取下層有機相4mL至干燥容器中，5(TC氮氣吹干，用緩沖工作液lmL溶解干燥的殘留物，加入正己烷lmL混合2min，3800r/min以上、15t:離心5min，輕吸掉上層和中間部分液體，取下層液50i！L用于分析。取CIP-OVA板條，加入50iiL的CIP標準溶液或樣品處理液的到各自的微孔中，每個標準和樣品溶液必須使用新的吸頭，加緩沖液l:20稀釋的CIP抗體50iiL，25t:振蕩l小時，洗滌液洗三次，加緩沖液1:20稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100iiL，25t:振蕩1小時，用洗滌液洗六次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量。根據(jù)標準曲線計算樣品中的CIP含量，見表l，該例的樣品處理液中CIP濃度為3.28ng/mL。表1CIP標準溶液點CIP濃度(ng/mL)0102060100豬肉樣品熒光值(cps)620445498754418407361147246081187262558012實施實例2試劑盒的制備CIP-BSA抗原制備稱取12mgCIP40mg、N-羥基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亞胺(EDC)溶于N，N'-二6甲基甲酰胺(DMF)中，室溫攪拌24h，制成A液；稱取50mgBSA溶于3mL0.Olmol/mLpH7.4PBS中，制成B液。將A液逐滴加入B液，邊加邊攪拌，室溫反應3h，將反應液蒸餾水中透析72小時，期間換蒸餾水5次。或經(jīng)萄聚糖凝膠G50(S印hadexG50)柱提純，以0.05mol/LpH8.0碳酸鹽緩沖溶液洗脫。收集透析純化液或第1峰的柱洗脫液，分裝保存于-2(TC作免疫抗原用。多克隆環(huán)丙沙星抗體的制備與實施例1相同。Eu3+_羊抗兔抗體的制備與實施例1相同。固相抗原制備與實施例1相同。試劑的配制與實施例1相同。試劑盒提供的試劑與實施例1相同。實驗室應自備的試劑與實施例1相同。測定之前注意事項同實施例1。具體檢測步驟同實施例1。實施實例3試劑盒提供的試劑與實施例1相同，用于檢測蜂蜜樣品。實驗室應自備的試劑(1)蒸餾水或去離子水；(2)二氯甲烷；(3)0.02mol/L的PB緩沖液稱取Na2HP0412H205.16g、NaH2P040.87g至容量瓶中，加水溶解并定容至1L;;(4)磷酸鹽緩沖工作液pH7.2，取1.45g磷酸氫二鈉(含12個結晶水)、0.lg磷酸二氫鉀(無水)、8.Og氯化鈉，溶解于水中并定溶至lOOOmL。測定之前注意事項同實施例1。具體檢測步驟如下準確稱取1.0g±0.Olg蜂蜜試樣于50mL離心管中，加入0.02mol/L的PB緩沖液2mL，震蕩至蜂蜜全部溶解，加入二氯甲烷8mL，震蕩提取5min，3800r/min以上離心5min，輕吸掉上層液，取下層有機相至干燥容器中，5(TC氮氣吹干，用緩沖工作液lmL溶解干燥的殘留物，再用緩沖工作液按比例稀釋，取50i！L用于分析。取CIP-OVA板條，加入50iiL的CIP標準溶液或樣品處理液到各自的微孔中，每個標準和樣品溶液必須使用新的吸頭，加緩沖液1:20稀釋的CIP抗體50iiL，25t:振蕩1小時，洗滌液洗三次，加緩沖液l:20稀釋的Eu"-羊抗兔抗體100i!L，25t:振蕩l小時，用洗滌液洗六次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量。從標準曲線計算樣品中的CIP含量，見表2和圖2，該例的樣品溶液中CIP濃度為2.42ng/mL。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求一種檢測環(huán)丙沙星的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是由多孔包被板(1)，緩沖液(2)，環(huán)丙沙星標準溶液(3)，環(huán)丙沙星的抗體(4)，銪標記的羊抗兔抗體(5)，洗滌液(6)和增強液(7)所組成。2.根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將CIP-0VA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100iiL，4t:放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150iiL含3g/LOVA的上述緩沖液封閉，4t:放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-i8t:冷凍保存。3.根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其中的環(huán)丙沙星標準溶液(3)，從CIP純品中稀釋得到，稀釋液為0.lmol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液，共6瓶，CIP濃度分別為0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，100ng/mL。4.根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其中的環(huán)丙沙星的抗體(4)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2mL混合2mgCIP-BSA，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600iiL制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔和BALB/c小白鼠身上多位點地進行皮下注射，在免疫34次后，可進行鑒定，血清和腹水合格后稀釋、分裝、凍干備用。5.根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗兔抗體(5)，將購得的羊抗兔抗體，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉(zhuǎn)換的羊抗兔抗體加入Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]_二乙烯三胺四乙酸，反應過夜，反應液經(jīng)柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗兔抗體(5)，取溶解于50mmol/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗體lmL2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mo1/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.59.0緩沖液，收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L，取500iiL1000iiL稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2mg0.4mg的Eu3+_N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28°C30°C磁力攪拌反應16小時，反應液經(jīng)用80mmol/LTris-HClpH7.8緩沖液平衡的S印hadex-G50柱(1X40cm)層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。7.—種用權利要求1所述的試劑盒檢測環(huán)丙沙星的方法，其特征是取包被有CIP-OVA的微孔包被板，加入CIP標準溶液或樣品處理液到各自的微孔中，再加入CIP抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加銪標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的CIP含量。8.根據(jù)權利要求8所述的檢測環(huán)丙沙星的方法，其操作為取包被有CIP-OVA的微孔包被板，加入50iiL的CIP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50iiL以緩沖液(2)作稀釋劑，l:20稀釋CIP抗體，25t:37t:振蕩0.51小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1:20稀釋的100iiLEu"-羊抗兔抗體，25t:37t:振蕩0.5l小時，用洗滌液洗六次，加200i！L增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中CIP的含量。全文摘要一種檢測環(huán)丙沙星的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術領域：
，用于對動物源性食品、血液、尿液及飼料中環(huán)丙沙星(CIP)含量的檢測。本發(fā)明配制的試劑盒，采用TRFIA檢測CIP，測定的基礎是標記免疫反應。微孔板包被有CIP-載體蛋白，加入CIP標準或樣品，再加入CIP抗體。游離的CIP與微孔板上的CIP-載體蛋白競爭CIP抗體，沒有連接的CIP抗體被洗滌除去，加入Eu3+-羊抗兔抗體，標記免疫反應后沒有連接的Eu3+-羊抗兔抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的CIP濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中CIP的含量。本發(fā)明提供的檢測CIP試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.01ng/mL以上。文檔編號G01N33/543GK101713778SQ20091023265公開日2010年5月26日申請日期2009年12月4日優(yōu)先權日2009年12月4日發(fā)明者儲敏,宓曉黎,張六六,李利東,李英,陸茂林,黃麗俊申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司