專利名稱：：一種用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細(xì)菌檢測試劑盒及制備方法，確切講是一種檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱原體抗體的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：衣原體(C/z/flm>^a)廣泛分布于世界各地，可以引起動物和人的多種疾病，特別是鸚鵡熱嗜性衣原體[CWflwj^op/n7afQJ戸故ad]和流產(chǎn)嗜性衣原體(Q.a6omw)，可由動物傳染給人，導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患性疫病(zoonoticinfections)發(fā)生。牛衣原體病中對養(yǎng)牛業(yè)危害最嚴(yán)重的是牛衣原體性流產(chǎn)，該病是由衣原體感染牛引起的一種地方流行性的接觸性傳染病，以妊娠母牛流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)無活力犢牛為主要特征。該病的同義名有牛流行性流產(chǎn)、牛地方流行性流產(chǎn)、牛新立克次體性流產(chǎn)。早在二十世紀(jì)二十年代，美國人首先報道了牛地方流行性流產(chǎn)綜合征；到1956年，德國人采用血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，證明原聯(lián)邦德國奶牛流行性流產(chǎn)是由衣原體感染所致。以后歐洲許多國家，加拿大、前蘇聯(lián)、日本、印度也相繼報道牛衣原體性流產(chǎn)。牛衣原體性流產(chǎn)雖然是一種地方流行性疫病，但分布廣泛，在流行區(qū)內(nèi)本病主要侵害處女母牛、頭胎母?；驈姆且邊^(qū)引進(jìn)的母牛，流產(chǎn)率高達(dá)25°/。-75%。目前，診斷家畜衣原體病的血清學(xué)方法主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、正向間接血凝試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等方法。這些方法所使用的抗原多為衣原體全菌體，由于動毒培養(yǎng)抗原，就存在散毒、感染人的危險存在。另外，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作復(fù)雜，不易推廣；間接血凝試驗(yàn)雖然操作簡單，但敏感性較差參見l.MarkeyBK，etal.ComparisonofserologicaltestsforthediagnosisofChlamydiapsittaciinfectionofsheep.VetMicrobiol.1993,36(3-4》233-52.;2.QiuC，etal.SeroprevalenceofChlamydiainfectioninbuffaloesinChina.IndianJournalofAnimalSciences,2001,71(1):27.;3.邱昌慶，才學(xué)鵬.動物疫病基因工程疫苗研究與進(jìn)展.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.;4.農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)動物衣原體病診斷技術(shù)(NY/T562-2002)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，可供家畜用的衣原體病快速、準(zhǔn)確的診斷試劑及檢測方法，以及這種檢測試劑的制備方法。本發(fā)明的用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的ELISA試劑盒中有a.橫向包被的流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體、縱向包被有作為二抗的兔抗牛IgG-HRP的酶標(biāo)板；b.洗滌液;；c.封閉液；d.底物緩沖液A和底物緩沖液B;e.終止液，其中包被的流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗原為流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA,特別是流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA的重組蛋白。本發(fā)明的用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒中OmpA抗原的最佳包被濃度為1:320，血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:40，酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1:2000。本發(fā)明所述的任一用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒的制備方法中OmpA抗原的一般包被條件下OD4so值在2.5-4.5之間，其最佳包被條件是1:320倍稀釋的重組蛋白加反應(yīng)板的小孔內(nèi)在37'C包被1小時，然后在4'C過夜繼續(xù)包被，在此條件下所得到的OD45o值為4.83。本發(fā)明所述的任一試劑盒中所用的重組流產(chǎn)嗜性衣原體外膜蛋白OmpA的制備方法是以從流產(chǎn)嗜性衣原體提取細(xì)菌的總DNA為模板，設(shè)計兩對特異性引物進(jìn)行套式聚合酶鏈反應(yīng)。由于本發(fā)明是從組織中提取基因組，組織培養(yǎng)時衣原體所占得比例很小，采用套式PCR的方法可以提高它的敏感性。擴(kuò)增得到流產(chǎn)嗜性衣原體外膜蛋白A的完整基因(ww;^)，將該基因克隆到原核表達(dá)載體中，獲得重組表達(dá)載體；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，篩選出陽性克隆；將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到疫苗用抗原蛋白。本發(fā)明的制備方法中，制備重組流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA所用的兩對引物分別是5，-GAGGTGAGTATGAAAAAACTCTTG-3，，第一對引物的上游引物為Pl第一對引物的下游引物為P2第二對引物的上游引物為P5:，-CAAGGTTGTAATCTCTAGGTTTCA-3，；;，-ACGGAATTCTTGCCTGTAGGGAACC-3'(含-TGAGTCGACGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3'五coiI酶切位點(diǎn))第二對引物的下游引物為P6:(含Sa/I酶切位點(diǎn))本發(fā)明提供的牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體檢測試劑盒可實(shí)現(xiàn)快速檢測，同時由于本試劑盒所用的抗原為純化的重組牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體的外膜蛋白OmpA，這種蛋白的生產(chǎn)方法與常規(guī)的衣原體血清學(xué)診斷用抗原全菌體的生產(chǎn)方式完全不同，其優(yōu)點(diǎn)在于-1.本發(fā)明所用的OmpA抗原是免疫基因的表達(dá)產(chǎn)物，而不是活的衣原體全菌體，因此在生產(chǎn)過程中完全避免了人為的動毒、散毒等安全隱患。2.本發(fā)明用的OmpA抗原，由于o附7^基因序列高度保守，從理論上講，本發(fā)明除了適用于診斷牛衣原體感染外，可也用于檢測其它哺乳動物的衣原體病。為今后產(chǎn)業(yè)化開發(fā)本試劑盒奠定了基礎(chǔ)。為有效防控該病，提供有力的技術(shù)支持。3.本發(fā)明用的OmpA抗原，以大腸桿菌作為目的蛋白的表達(dá)載體，培養(yǎng)簡單，可以用發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)，可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的ELISA試劑盒的質(zhì)量一致性。除此以外，因本發(fā)明所有的表達(dá)目的蛋白OmpA的重組大腸桿菌，對人無危害性，可以用發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的ELISA的質(zhì)量一致。本發(fā)明操作簡單，既適用于田間大面積流行病學(xué)調(diào)査，也適用于實(shí)驗(yàn)室個例診斷，同時也可用于疫苗免疫狀態(tài)'、本發(fā)明還有如下優(yōu)點(diǎn)1)通過以前的間接血凝試驗(yàn)來判斷陰陽性會存在可疑，弱陽性不好區(qū)別的情況，而通過ELISA法運(yùn)用酶標(biāo)儀檢測，根據(jù)所測的數(shù)值與陰陽性臨界值的對比可以準(zhǔn)確的判斷出樣品的陰陽性，不會在出現(xiàn)可疑的情況。2)特異性強(qiáng)和敏感性高是ELISA檢測方法的最大優(yōu)點(diǎn)，微量的樣品就能引起高效的抗原抗體反應(yīng)。圖1.重組質(zhì)粒pGEX-4T-om/"在五.co/ZBL21(DE3)中的表達(dá)的電泳圖。圖2.表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測圖具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料l.l主要儀器，血清和試劑超聲裂解儀(美國)，Bio-Rad680型酶標(biāo)檢測儀購自上海基因公司，96孔高親和力酶標(biāo)板為Costar公司產(chǎn)品，純化的重組蛋白OmpA本實(shí)驗(yàn)室制備；牛衣原體病陽性血清、牛流行熱陽性血清、牛布氏桿菌病陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室提供；?？谔阋哧栃匝逵刑m州獸醫(yī)研究所病毒病實(shí)驗(yàn)室提供；檢測用牛血清樣品共60份，采自寧夏；羊血清樣品88份，采自內(nèi)蒙；豬血清樣品共30份，采自寧夏，置于-20。C保存?zhèn)溆?。辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和BSA為Sigma公司產(chǎn)品；間接血凝試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室提供；其它常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。1.2試驗(yàn)所用溶液及其配制1)包被液(pH9.6):1.465gNaHC03，0.795gNa2CO3，加蒸餾水至500mL，混勻后置4°C保存。2)洗滌液(0.01mol/LpH7.4PBST):4.0gNaCl，O.lgKH2P04，O.lgKC1，1.45gNa2HP0412H20,0.25mLTween-20，加蒸餾水至500mL。3)封閉液(含1%BSA的洗滌液)lg牛血清白蛋白BSA，lOOmL洗滌液，均勻混合后置4'C保存。4)TMB底物緩沖液A液(5mg/mLTMB緩沖液)50mgTMB溶于10mLDMSO中，4'C避光保存或棕色瓶保存。B液(磷酸-檸檬酸緩沖液pH5.0):①甲液3.58gNa2HP0412H20溶于50mL蒸餾水中。②乙液0.96g檸檬酸溶于50mL蒸餾水中。配制方法25.7mL甲液，24.3mL乙液，50mL超純水充分混勻后加入56^30%!"1202，置于棕色瓶中，4'C保存。按照A液與B液1:50倍的體積比配制。5)終止液(2MH2S04溶液)10mL(98%)濃硫酸緩沿容器壁慢滴加于60mL雙蒸水中，并不斷攪拌，然后加雙蒸水至90mL。二、制備方法(一)抗原制備抗原制備中使用的主要材料包括菌株為牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體SX5株。表達(dá)菌￡.co//BL21(DE3)購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。pGEX-4T-l表達(dá)載體購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。衣原體陽性血清本實(shí)驗(yàn)室制備，其效價在1:1024以上。引物所有基因擴(kuò)增和改造用的引物，均由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計，由商業(yè)性生物公司合成。酶和試劑RnaseA酶、蛋白酶K、Ex預(yù)混酶、///"dl11、Smal、SDS、IPTG、無水乙醇、DL2000DNAMarker、酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、瓊脂糖、DNA回收試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；pMD18-T克隆載體、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、A型質(zhì)粒小型快速提取試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，T4DNA連接酶、S"/1、I限制性內(nèi)切酶、丙烯酰胺、雙甲基丙烯酰胺、SDS(十二垸基硫酸鈉)均購自promega公司；蛋白Marker、其它常規(guī)試劑均由國內(nèi)生產(chǎn)。以下為抗原制備的具體試驗(yàn)步驟本實(shí)施例中選用菌株為牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體SX5，從中提取細(xì)菌總DNA,以該總DNA為模板，迸行套式聚合酶鏈反應(yīng)(nested-PCR)，所用引物對為一擴(kuò)引物對Pl5'-GAGGTGAGTATGAAAAAACTCTTG陽3'P25，-CAAGGTTGTAATCTCTAGGTTTCA-3'二擴(kuò)引物對P55,-ACGGAATTCTTGCCTGTAGGGAACC-3，(含I酶切位點(diǎn))P65，-TGAGTCGACGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3，(含1酶切位點(diǎn))擴(kuò)增片段包括om;^基因的完整閱讀框架(長度為U70bp)。目的基因的克隆首先將nested-PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-l表達(dá)載體連接，再將連接產(chǎn)物加入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可獲得帶有目的基因的重組質(zhì)粒pGE五coiI-4T-ompA。通過PCR鑒定和酶切鑒定予以確認(rèn)。鑒定陽性質(zhì)粒pGEX-4T-ompA為帶有完整om/W基因的重組質(zhì)粒。測序結(jié)果表明，陽性質(zhì)粒pGEX-4T-ompA含有流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白基因om/"的完整閱讀框架，用DNAStar軟件進(jìn)行分析顯示，與GeneBank登錄的其他分離株EBA株，BA1株，OCLH株，B11001株，CP/12株,C18/98株進(jìn)行序列比較，與EBA株，BA1株,OCLH株和C18/98株的同源性均為99.7%;與B11001株和CP/12株的同源性均為99.6%。本試驗(yàn)所選用的流產(chǎn)衣原體SX5株o附7^基因沒有任何突變，同時與其它株的omA4基因同源性高度一致，說明該基因在種間比較保守。提取質(zhì)粒用滅菌槍頭在培養(yǎng)板上挑取單個白色菌落，接種于5mL含氨芐抗性的的LB培養(yǎng)液中，220r/m，37'C培養(yǎng)12-16h。按照北京博大泰克公司生產(chǎn)的A型質(zhì)粒小型快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，操作步驟1)收集1.5-3mL菌液，8000r/m離心lmin，棄去上清，加入100nL溶液l，振蕩至徹底懸浮。2)加入15(HiL溶液2，立即輕輕顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮，隨后將離心管放到冰上l-2min。3)加入150^iL溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5min后，12000r/m離心12min。4)將420pL結(jié)合緩沖液加入到離心吸附柱中，然后將3)中的上清倒入A型離心吸附柱中，混勻，12000r/m離心30s，倒掉廢液收集管中的廢液。5)加入750^iL濃縮漂洗液于離心吸附柱中，靜置lmin后，12000r/m離心15s，倒掉廢液收集管中的廢液，重復(fù)一次。倒掉廢液后，再次于12000r/m離心2min，盡量除去漂洗緩沖液。6)小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5mLEppendorf離心管中，加入30pL洗脫緩沖液，室溫放置2-5min后，12000r/m離心lmin。7)再取20pL洗脫緩沖液，室溫放置l-3min后，12000r/m離心lmin，最后合為一管。重組質(zhì)粒pGEM-4T-ompA的鑒定1)電泳鑒定取重組質(zhì)粒5pL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，同時加入空載體作為對照，挑選泳動速度較空載體慢的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。2)酶切鑒定用&/1和￡coRI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為40^L:質(zhì)粒20pL12juL五coiI2|jL10XHbuffer爭雙蒸去離子水12pL充分混勻后，37'C水浴3h。以DNA2000Marker為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。3)PCR鑒定重組質(zhì)粒1:10倍稀釋后，作為模板，加入表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖電泳，觀察目的片段的有無，以及是否符合預(yù)期大小。4)測序鑒定將通過上述步驟鑒定為陽性克隆的菌種重新接種到含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，220r/m培養(yǎng)4h,吸取lmL菌液至無菌Eppendorf管中，并加入少量甘油，封口，寄送寶生物工程(大連)有限公司測序。鸚鵡熱衣原體ompA基因在大腸桿菌中的表達(dá)將測序正確的陽性菌株100pL接種于10mL含Amp的LB液體培養(yǎng)液中，37°C，220r/m振蕩3h后，取20nLIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于第2h，3h，4h，5h，6h各取100pL樣。將收集的菌液分別放入500|iLEppendorf管中，12000r/m離心3min，棄去上清，將離心得到的沉淀溶于100pL蒸餾水中，加入100pL2XSDSBuffer中，煮沸5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測表達(dá)情況。表達(dá)產(chǎn)物的檢測(1)SDS層PAG1)制膠將電泳玻璃板清洗、干烤好后，按照操作說明固定在配膠架上，確定在兩玻璃板間不漏液體的情況下開始配膠。先配下層的分離膠，配好混勻后迅速加入兩玻璃板之間，然后馬上在其上層小心加入少量去離子水封頂(此時可用手指輕輕彈擊玻璃板以排除產(chǎn)生的氣泡，并且要盡量保證水和膠之間的界限平行于水平桌面)。靜置30min，待分離膠凝固后棄去上層封頂水，并且倒置控干殘留的液體，隨即配置5%的濃縮膠，配好混勻后立即加在分離膠上層，并快速插入梳子(小心插入，以防產(chǎn)生氣泡)，待其凝固。2)安裝小心移去梳子，用去離子水沖洗加樣槽幾次后，放入電泳槽，然后往電泳槽中加入IXTris-甘氨酸電泳緩沖液。3)樣品的制備及上樣取適量上述全菌菌體蛋白液12000r/m離心2min，棄去上清，之后用去離子水懸浮洗滌離心沉淀物，同樣按照上述離心條件獲得菌體蛋白。然后，用適量去離子水懸浮沉淀物，并且加入等量2XSDS上樣緩沖液，使二者混勻，水浴煮沸5-8min，待冷卻之后，用微量加樣器上樣5-10pL/孔。加樣完畢后，開始電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠之后，即可將電壓調(diào)升至120V，繼續(xù)恒壓電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底層。4)固定電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，從電泳槽中小心取出凝膠板，用蒸餾水沖洗。然后用起膠板小心取出膠片用蒸餾水沖洗，之后加入固定液，將其置于水平搖動的搖床上固定10-15min。5)染色固定完畢后，將固定液倒入回收瓶中以備下次使用。然后倒入染色液，將其置于水平搖動的搖床上染色30-60min。6)脫色染色結(jié)束后，同樣將染色液倒入回收瓶中以備下次使用。然后倒入脫色液，將其置于水平搖動的搖床上脫色l-2h。待藍(lán)色背景完全脫凈后，將凝膠浸入去離子水中終止反應(yīng)。7)結(jié)果的觀察及判定以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker的條帶作對照，觀察并判定結(jié)果。(2)Western-blot1)蛋白分離按照上述的方法進(jìn)行SDS-PAGE，待電泳結(jié)束后，取下電泳板，切下分離膠置于平皿內(nèi)。2)轉(zhuǎn)印剪10塊濾紙和1塊硝酸纖維素膜(NC膜)，大小與凝膠相等，置轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3min。在正極板上按5層濾紙、NC膜、凝膠、5層濾紙的順序疊放整齊，確定各層間無氣泡和保證帶負(fù)極的蛋白質(zhì)向正極NC膜移動后，裝好電泳轉(zhuǎn)移裝置，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，接通電源，在160mA轉(zhuǎn)移4-6h。3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker染色轉(zhuǎn)移完成后，取下NC膜，切取標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker置于氨基黑染色液中浸染3min，取出NC膜用蒸餾水漂洗至水清亮，然后棄去蒸餾水，加入氨基黑漂洗液脫色至條帶清晰且藍(lán)色背景脫盡。晾干備用。4)封閉將切取標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker剩余的NC膜用PBS沖洗幾遍，然后將其置于盛有封閉液的玻璃平皿內(nèi)，室溫下輕輕振搖5h。5)抗原抗體反應(yīng)封閉結(jié)束后，用PBS沖洗NC膜4-5次，加入用PBST1:50倍稀釋的牛衣原體陽性血清，37'C結(jié)合1.5h，用PBST沖洗4-5次，每次在搖床慢慢搖動5min，再加入用PBST1:500倍稀釋的兔抗牛IgG-HRP，37。C孵育1.5h，取出用PBST沖洗4-5次，每次10min。6)底物顯色抗原抗體反應(yīng)全部結(jié)束后，將NC膜轉(zhuǎn)移到底物顯色液中染色(避光)并及時觀察，以控制染色程度，防止出現(xiàn)非特異性條帶，當(dāng)特異性條帶達(dá)到最佳染色程度后，立即將NC膜轉(zhuǎn)入PBST中終止反應(yīng)，室溫避光保存。7)結(jié)果觀察與判定以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker為參照，在預(yù)期分子量大小出呈現(xiàn)黑色染色條帶者為陽性，無此條帶者為陰性。表達(dá)蛋白的純化(1)大量誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的陽性菌株10(VL接種于10mL含Amp的LB液體培養(yǎng)液中，37°C,220r/m振蕩過夜。將6mL的菌液轉(zhuǎn)入600mL含Amp的LB液體培養(yǎng)液中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6，加入600^LIPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。將菌液于4°C6500r/m離心15min，棄上清，收集沉淀。(2)包涵體的提取1)洗滌將每克濕重沉淀重懸浮于4-6mL洗滌緩沖液中，12000r/m離心30min收集沉淀，重復(fù)洗滌3-4次，直到上清變得清亮，最后用不含尿素和Tritonx-lOO的洗滌緩沖液洗滌沉淀一次。2)變性和復(fù)性將每克濕重的沉淀物溶解到lmL提取緩沖液中，室溫作用使沉淀充分溶解直至液體完全變清亮，除去不溶性雜質(zhì)，分別在變性液中各加入等體積的復(fù)性液(20mmol/LTris-Cl、2mmol/LEDTA)，加入還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使其終濃度分別達(dá)到lmmol/L和0.1mmol/L，室溫放置20h進(jìn)行復(fù)性，用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)緩沖液透析24h，每6h換液一次。PEG6000濃縮復(fù)性包涵體蛋白液，過濾除菌，4'C放置待用。(3)電洗脫純化經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察，在洗滌后的沉淀中目的蛋白的含量最高。進(jìn)行SDS-PAGE電泳。待電泳進(jìn)行完畢后，縱切下一小條凝膠進(jìn)行常規(guī)染色及脫色，與剩余未染色的凝膠進(jìn)行比對，判斷目的條帶的位置，切下目的條帶。將切下的目的條帶放入透析袋中，按1:1比例加入蛋白電泳緩沖液，封好透析袋，將其放于水平電泳槽的中間隔檔上，使電泳槽中的電泳液剛好沒過透析袋。80V電泳6h，透析袋中的液體即為純化的表達(dá)蛋白。將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定后取樣測定蛋白濃度。(4)免疫初步試驗(yàn)衣原體抗體陰性16~18g昆明系小鼠15只，由本所實(shí)驗(yàn)動物場提供，分為3組，每組5只，I和II組為免疫組，III組為對照組不免疫。純化的OmpA蛋白濃度調(diào)整為0.lmg/ml，I和II組小鼠分別按0.2ml/只和0.4ml/只接種，免疫后2周，用衣原體強(qiáng)毒株SX5按每只小鼠0.2ml(含菌量0.5x109ELDso)腹腔攻擊。結(jié)果1表達(dá)產(chǎn)物的檢測結(jié)果(1)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析結(jié)果表明，經(jīng)0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌獲得表達(dá)，產(chǎn)生約68ku的特異性蛋白條帶，與預(yù)測的分子質(zhì)量相符。按lX接種誘導(dǎo)表達(dá)4h的表達(dá)量最高。結(jié)果見圖1。圖1中1為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2為pGEX-4T-ompA對照；3-7為.pGEX-4T-ompA經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)2，3，4，5，6h的表達(dá)產(chǎn)物(2)表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白能夠被牛陽性血清所識別，具有良好的反應(yīng)原性，結(jié)果見圖2。圖2中l(wèi)為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2為誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物(3)蛋白濃度的測定利用紫外分光光度計測定的純化后蛋白的濃度為0.26mg/mL。(二)試劑盒包被1抗原OmpA最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定1)將純化后的OmpA蛋白用包被液l:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280稀釋，橫向包被酶標(biāo)板，100pL/孔，每個濃度包被1歹U。2)加蓋，在微型振蕩器上振蕩3-5min，置于37i:溫箱內(nèi)溫育lh，轉(zhuǎn)入4。C過夜。3)用洗滌液洗滌3次，每次5min。洗滌時孔內(nèi)要加滿洗液，洗滌完畢將板子在吸水紙上拍干。4)用封閉液封閉，50nL/孔，37'C溫育lh，洗滌。5)將陽、陰性血清分別以1:40、1:80、1:160、1:320比例縱向稀釋，做方陣滴定確定表達(dá)產(chǎn)物最佳包被濃度，100pL/孔，每個濃度包被l行。37t:溫育45min，洗滌3次，甩干。6)再加入1:2000兔抗牛IgG-HRP，100pL/孔，37。C反應(yīng)45min。洗滌，甩干。7)加入TMB底物緩沖液100nL/孔，37"C反應(yīng)10min。8)加入100piL/孔終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定OD45o腦值。2酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定采用最佳包被度和最佳血清稀釋度縱向包被酶標(biāo)板，兔抗牛IgG-HRP從1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀釋，來確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。3抗原最佳包被條件的確定以①37。Clh加4。C過夜；②37。C2h加4。C過夜；③37。C2h;④4。C過夜，4種不同的條件下包被的重組蛋白OmpA,用牛衣原體病陽性血清和陰性血清進(jìn)行ELISA測定，確定抗原的最佳包被條件。4血清和酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定用重組蛋白以其最佳抗原包被濃度條件下包被酶標(biāo)板，37°Clh加4'C過夜，將血清及其酶標(biāo)二抗都做最佳稀釋倍數(shù)，分別在37。C下反應(yīng)2h，1.5h，lh，0.5h進(jìn)行ELISA測定，確定一抗，二抗的結(jié)合時間。5.ELISA的操作步驟上述條件確定后本ELISA試驗(yàn)的操作步驟如下將重組蛋白抗原用包被液稀釋至最佳濃度后包被96孔酶標(biāo)板，100pL/孔，37°Clh加4'C過夜。甩去包被液，用洗滌液洗板3次，每次2-3min。然后加入100pL/孔的封閉液于37'C封閉2h，取出洗板同上。用PBST將血清樣品稀釋至最佳稀釋度后，100nL/孔，每份血清樣品設(shè)兩個重復(fù)。37'C反應(yīng)lh后，取出洗板同上。再加入兔抗牛IgG-HRP，100pL/孔，37。C反應(yīng)45min后，取出洗板同上。然后加入底物溶液，避光反應(yīng)10-15min后加入終止液終止反應(yīng)，立即于酶標(biāo)儀上讀出450nm處每孔吸光度值。同時設(shè)定空白對照孔。6.ELISA陰陽性臨界值的確定取44份奶牛衣原體陰性血清進(jìn)行間接ELISA檢測。每份樣品重復(fù)兩孔，按照已確立的ELISA操作程序進(jìn)行測定，讀出OD45(tam值，進(jìn)行樣本OD值平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)的計算。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則，樣本的OD45(^值〉陰性樣本OD45o^值的平均值(X)+3SD時，可以在99.9%的水平上判為陽性。7.特異性試驗(yàn)用建立的ELISA方法分別檢測牛流行熱陽性血清、牛布魯氏菌病陽性血清、?？谔阋哧栃匝搴团Ｒ略w病陽性血清，驗(yàn)證是否有交叉反應(yīng)。8.敏感性試驗(yàn)將奶牛衣原體病陽性血清做1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280六個稀釋度，其余條件按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。9.重復(fù)性試驗(yàn)選取15份奶牛衣原體病血清，用兩次包被的酶標(biāo)板，各進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計算其變異系數(shù)。10.對比試驗(yàn)以2.4所述的ELISA操作程序，以2.5確定的陰陽性臨界值為標(biāo)準(zhǔn)共檢測了60份血清，并同衣原體病間接血凝(IHA)試驗(yàn)檢測的結(jié)果進(jìn)行了比較。(三)結(jié)果1.最佳包被度和最佳血清稀釋度的確定結(jié)果(方陣滴定)方陣滴定結(jié)果見表1。當(dāng)血清的稀釋倍數(shù)為1:40，抗原的稀釋度為1:320時陽性血清OD450nm值可達(dá)到1.286，而陰性血清的OD450nm值0.266，陰陽性血清0045()證值相差最大，因此選擇1:40為最佳血清稀釋倍數(shù)，抗原的最佳稀釋倍數(shù)為1:320。_表l.方陣滴定的OD450nm值結(jié)果__不同抗原稀釋度的OD45Q值_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定結(jié)果從表2可以看出，當(dāng)酶標(biāo)二抗1:2000稀釋時，陽性血清與陰性血清的OD45o,值相差最大，因此將此條件確定為重組蛋白的酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。表2.酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定酶標(biāo)二抗工作濃度1:10001:20001:40001:8000<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.抗原最佳包被條件的確定結(jié)果從表3可以看出，重組蛋白在37°Clh加4。C過夜的包被條件下，陽性血清與陰性血清的OD450值相差最大，說明包被效果較好，因此將此條件確定為重組蛋白的最佳包被條件。表3.重組蛋白最佳包被條件的確定反應(yīng)條件①②③陽性血清OD450訓(xùn)值1.2831.0130.9970.976陰性血清OD45tom值0.2720.2780.2650.3004.ELISA陰陽性臨界值的確定結(jié)果通過對44份牛衣原體陰性血清(IHA)進(jìn)行間接ELISA檢測，如表4。求其平均值X為0.265,標(biāo)準(zhǔn)方差SD為0.042，確定陰陽性臨界點(diǎn)為X+3SD=0.265+3X0.042=0.391。即待測樣品的OD45Q簡值大于0.391為陽性，小于或等于0.391則為陰性。表4.44份牛衣原體抗體陰性血清的ELISA檢測結(jié)果44份衣原體陰性牛血清OD45Qnm值0.3310.2510.2110.2670.2350.2880.2910.2190.2940.3300.2560.2320.3250.2630.2900.2080.2770.2190.3130.2060.3220.3280.2180.2790.2620.3220.2700.2200.2140.2300.2410.3290.2880.2040.3130.2210.3160.2380.2420.2180.2960.2840.2520.3105.特異性試驗(yàn)結(jié)果采用確立的ELISA條件，以重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板，用牛流行熱陽性血清、牛布氏桿菌病陽性血清、牛口蹄疫陽性血清進(jìn)行ELISA交叉試驗(yàn)，同時設(shè)牛衣原體病陽性血清對照各一份。結(jié)果牛流行熱陽性血清、牛布氏桿菌陽性血清、?？谔阋哧栃匝寰鶠殛幮裕Ｒ略w陽性血清為陽性反應(yīng)，表明建立的ELISA方法特異性較好。結(jié)果見表5。表5:特異性試驗(yàn)結(jié)果陽性血清BBEF牛布病?？谔阋吲Ｒ略w病OD恤m值0.2100.2580.1891.0916.敏感性試驗(yàn)結(jié)果重組蛋白按最佳包被濃度進(jìn)行包被，將牛衣原體陽性血清和陰性血清均做1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280六個稀釋度稀釋，其余條件按最適反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果當(dāng)陽性血清稀釋到1:640時，通過ELISA顯色后靠肉眼觀察顏色變化難以判斷陰性、陽性結(jié)果，但酶標(biāo)儀仍然可以檢測出；而1:1280稀釋的陽性血清檢測結(jié)果則低于陰性值。結(jié)果見表6。表6.敏感性試驗(yàn)結(jié)果血清1:401:80血清稀釋度1:1601:3201:6401:1280陽性血清1.1070.9150.7180.6490.4670.263OD"o腦值陰性血清0.2950.2410.2000.1910.1250.078OD450nm值7.重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果取15份牛血清，用兩批包被的酶標(biāo)板各重復(fù)檢測3次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果重復(fù)試驗(yàn)中變異系數(shù)最大為2.36%，最小為1.38%，15份血清的變異系數(shù)都較小，說明所建立的ELISA方法具有較好的重復(fù)性。8.對比試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用衣原體病間接血凝(IHA)試驗(yàn)和所建立的ELISA法對60份血清樣品檢測，檢測結(jié)果如表7所示。IHA檢出陽性9份，陽性檢出率為15%，檢出陰性51份，陰性檢出率為85%，以IHA的檢測結(jié)果為參照，用所建立的ELISA試驗(yàn)復(fù)檢，結(jié)果與其一致(同一樣品經(jīng)兩種方法檢測均為陰性或陽性的樣品數(shù)除以檢測樣品總數(shù)，即得檢測符合率)。兩種檢測方法的檢測符合率為100%。表7.IHA與ELISA檢測牛血清的對比試驗(yàn)結(jié)果檢測方法樣品數(shù)陽性樣品陽性檢出率陰性樣品陰性檢出率檢測符合率IHA60915%5185%100%ELISA60915%5185%9.檢測其它動物血清的結(jié)果(1)應(yīng)用衣原體病間接血凝(IHA)試驗(yàn)和所建立的ELISA法對88份羊血清樣品檢測，檢測結(jié)果如表8所示。IHA檢測的陽性檢出率為1%，陰性檢出率為99%，以IHA的檢測結(jié)果為參照，將所建立的ELISA試驗(yàn)檢出結(jié)果與其相一致(同一樣品經(jīng)兩種方法檢測均為陰性或陽性)的樣品數(shù)除以檢測樣品總數(shù)，即得檢測符合率。兩種檢測方法的檢測符合率為95.6%。結(jié)果見表8。表8IHA與ELISA檢測羊血清的對比試驗(yàn)結(jié)果檢測方法血清樣品陽性陽性檢出率陰性陰性檢出率檢測符合率IHA8811%8799%95.6%ELISA8844.5%8495.5%(2)檢測豬血清的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用衣原體病間接血凝(IHA)試驗(yàn)和所建立的ELISA法對30份豬血清樣品檢測，檢測結(jié)果如表9所示。IHA檢測的陽性檢出率為53c/。，陰性檢出率為47%，兩種檢測方法的檢測符合率為88.9%。表9IHA與ELISA檢測豬血清的對比試驗(yàn)結(jié)果檢測方法陽性陽性檢出率陰性陰性檢出率檢測符合率IHA1653%1447%88.9%ELISA1963%1137%本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)如下(1)特異性和敏感性高；(2)檢測結(jié)果用ELISA檢測儀讀數(shù)，結(jié)果客觀、公正，從而避免了人肉眼觀察可能出現(xiàn)的誤差，發(fā)生漏判或錯判的情況；(3)可重復(fù)性高，同一樣品多次檢測，結(jié)果一致；或用不同批次的抗原檢測同一樣品，結(jié)果一致，這是研制試劑盒的基本要求。(4)廣譜性強(qiáng)，本發(fā)明選擇的om/W基因與GeneBank登錄的其他分離株的同源性均在99%以上，用表達(dá)的OmpA蛋白-ELISA檢測牛、羊、豬血清樣品，檢測結(jié)果與同步檢測的IHA方法的結(jié)果符合率高，說明本發(fā)明可以用于不同動物衣原體病的診斷。(5)本發(fā)明所有的表達(dá)目的蛋白OmpA的重組大腸桿菌，對人無危害性，可以用發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的ELISA的質(zhì)量一致。(6)本發(fā)明操作簡單，既適用于田間大面積流行病學(xué)調(diào)査，也適用于實(shí)驗(yàn)室個例診斷，同時也可用于疫苗免疫狀態(tài)監(jiān)測。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所<120>—種用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒及制備方法<160>4<210>1<211>24<212>DNA<213>第一對引物的上游引物<400>gaggtgagtatgaaaaaactcttg24<210>2<211>24<212>DNA<213>第一對引物的下游引物<400>caaggttgtaatctctaggtttca24<210>3<211>25<212>DNA<213>第二對引物的上游引物<400>acggaattcttgcctgtagggaacc25<210>4<211>30<212>DNA<213>第二對引物的下游引物<400>tgagtcgacgaatctgaattgagcattcat30權(quán)利要求1、一種用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的ELISA試劑盒，試劑盒中有a.橫向包被的流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體、縱向包被有作為二抗的兔抗牛IgG-HRP的酶標(biāo)板；b.洗滌液；；c.封閉液；d.底物緩沖液A和底物緩沖液B；e.終止液，其特征是流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗原為流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒，其特征是流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA為重組蛋白。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒，其特征是OmpA抗原的最佳包被濃度為1:320，血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:40，酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1:2000.。4、權(quán)利要求1至3所述的任一用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的試劑盒的制備方法，其特征是OmpA抗原的最佳包被條件1:320倍稀釋的重組蛋白加反應(yīng)板的小孔內(nèi)在37"C包被1小時，然后在4"C包被過夜。5、權(quán)利要求1至3所述的任一試劑盒中所用的重組流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA的制備方法，其特征是以從流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體提取細(xì)菌的總DNA為模板，設(shè)計兩對特異性引物進(jìn)行套式聚合酶鏈反應(yīng)。擴(kuò)增得到流產(chǎn)嗜性衣原體外膜蛋白A的完整基因"/^")，將該基因克隆到原核表達(dá)載體中，獲得重組表達(dá)載體；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，篩選出陽性克隆；將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到疫苗用抗原蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA的制備方法，其特征是所用的兩對引物分別是第一對引物的上游引物為PlTTG-3，，第一對引物的下游引物為P2TCA-3，；第二對引物的上游引物為P5:5'-ACGGAATTCTTGCCTGTAGGGAACC-3，(含五coiI酶切位點(diǎn))第二對引物的下游引物為P6:-GAGGTGAGTATGAAAAAACTC，-CAAGGTTGTAATCTCTAGGTT-TGAGTCGACGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3，(含1酶切位點(diǎn))(全文摘要本發(fā)明公開一種檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱原體抗體的ELISA試劑盒。本發(fā)明的用于檢測牛流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗體的ELISA試劑盒中有橫向包被的流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體、縱向包被有作為二抗的兔抗牛IgG-HRP的酶標(biāo)板、洗滌液、封閉液、底物緩沖液A和底物緩沖液B和終止液，其中包被的流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體抗原為流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA，特別是流產(chǎn)鸚鵡熱衣原體外膜蛋白OmpA的重組蛋白。文檔編號G01N33/52GK101581723SQ20091020302公開日2009年11月18日申請日期2009年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日發(fā)明者周繼章,宋竹青,宮曉煒,曹小安,藺國珍,邱昌慶,鄭福英申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所