人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡的制作方法
【專利摘要】本實用新型提供了一種人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，該檢測卡包括底板、樣品墊、吸水墊、結合墊和檢測層；結合墊包被有量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針；檢測層是由帶有一條檢測線以及一條質控線的固相硝酸纖維素膜構成；檢測線包被有鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體；質控線包被有抗兔IgG;檢測層粘貼在底板上；結合墊和吸水墊分別設置在檢測層兩端部上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層和底板粘貼；樣品墊設置在結合墊上方且與結合墊部分重合后分別與結合墊及底板粘貼。本實用新型具有操作簡便、檢測快速、可定量及高靈敏度等優(yōu)點。
【專利說明】人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡

【技術領域】
[0001]本實用新型涉及醫(yī)學檢測【技術領域】，具體為一種人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡。

【背景技術】
[0002]肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病原微生物，自從上個世紀80年代中期由Grayston等人正式命名，在隨后的時間里被研究者們廣泛研究?，F(xiàn)僅知人是該病原體的宿主，感染方式可能為人與人之間通過呼吸道分泌物傳播。5歲以下兒童極少受染，8歲以上兒童及青年易被感染，尤其是人群聚集處，如家庭、學校、兵營中易流行，經(jīng)血清流行病學調查，證實成人中至少有40%已受到該衣原體感染，大部分為亞臨床型。肺炎衣原體是專性細胞內(nèi)寄生的微生物，寄居于人呼吸道和咽喉等處，在兒童和成人中產(chǎn)生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支氣管炎等呼吸道疾病。目前研究表明，其還與動脈粥樣硬化綜合癥、老年癡呆癥、心肌炎、哮喘等疾病有關。臨床上由于其與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床表現(xiàn)、X-射線檢查等得出結論，確診往往依賴于實驗室診斷。快速有效的診斷方法應該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0003]盡管肺炎衣原體在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實驗室診斷的標準化商品試劑的種類極少。目前，肺炎衣原體感染的診斷方法有血清學檢測法，核酸檢測法和病原體直接檢測法。檢測血清中肺炎衣原體IgG、IgA、IgM抗體常用的有5種方法:微量免疫熒光抗體檢測(MIF)，補體結合試驗(CF)，重組酶免疫測定(rEIA)，血清補體結合一酶免疫測定試驗(SeroCF — EIA)，OY酶免疫試劑盒(LoY— EIA)。這5種方法要求肺炎衣原體不同成分做為抗原，而且肺炎衣原體抗體的檢出只能說明該個體感染過肺炎衣原體，卻不能反映體內(nèi)是否仍有肺炎衣原體活菌存在，并且血清學特異性抗體檢測常需要根據(jù)IgM抗體的動態(tài)結果進行判斷，需要較長的時間。同時，這些技術均存在靈敏度低、操作步驟復雜、需要專業(yè)人員操作、重復性差、檢測時間長、檢測特異性差、成本較高等缺陷，因而難以滿足臨床的實際需要。
[0004]核酸檢測包括核酸雜交和聚合酶鏈式反應(PCR)，核酸雜交檢測肺炎衣原體的特異性強，但敏感性不高，主要用于PCR結果的檢測、判定，尚未直接用于臨床標本的檢測；PCR具有較高的敏感性，應用肺炎衣原體外膜蛋白基因片段的一對特異性引物對臨床咽拭子進行PCR測定，其結果與血清學檢測具有較好的一致性。但PCR實驗對實驗室有特殊要求，標本處理、擴增和檢測要求嚴格，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。
[0005]抗原檢測方法有雞胚卵黃囊分離培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)法(常用HL和Hep-2兩種細胞)，然后采用熒光標記或酶標記抗體檢測標本中的衣原體，但該法存在操作步驟復雜，細胞培養(yǎng)時間長等明顯缺陷，并不適合臨床應用。近年也嘗試直接應用于臨床標本的檢驗，其敏感性與標本采集有關:痰液和咽拭子涂片后用EIA可檢測肺炎衣原體抗原的存在，其敏感性、特異性和可重復性不理想，且僅限于急性呼吸道感染；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)也可以直接檢出病原體，主要檢測肺炎衣原體外膜蛋白_2，所用抗體為抗衣原體屬特異性抗體，不能直接識別肺炎衣原體，與“金標準”(MIF)相比，雖然很靈敏，特異性卻不高。
[0006]因此，目前建立具高靈敏度、高特異性的人肺炎衣原體抗原快速檢測法以滿足臨床的檢測需求就顯得非常必要了。
實用新型內(nèi)容
[0007]本實用新型針對【背景技術】中現(xiàn)存的幾種人肺炎衣原體在檢測方式中遇到的技術瓶頸，提出了一種具有操作簡便、檢測快速、可定量及高靈敏度等優(yōu)點的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡。
[0008]本實用新型的目的是通過以下技術手段來實現(xiàn)的:
[0009]一種人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡包括底板、樣品墊、結合墊、檢測層以及吸水墊；所述結合墊包被有量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針；所述檢測層是由帶有一條檢測線及一條質控線的固相硝酸纖維素膜構成；所述檢測線包被有鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體；所述質控線包被有抗兔IgG ;所述檢測層粘貼在底板上；所述結合墊以及吸水墊分別設置在檢測層兩端部的上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層以及底板粘貼在一起；所述樣品墊設置在結合墊上方且與結合墊部分重合后分別與結合墊及底板粘貼在一起。
[0010]作為優(yōu)選，本實用新型所采用的量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
[0011]作為優(yōu)選，本實用新型所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0012]作為優(yōu)選，本實用新型所采用的檢測層長2cm，所述檢測層粘貼在長度是
6.6-7.7cm的底板表面中間段；所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是2.5-3cm的吸水墊重疊0.2-0.4cm ;所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是0.5-0.8cm的結合墊重疊0.2-0.4cm ;所述結合墊與粘貼在結合墊以及底板上的長度是
2.5cm的樣品墊重疊0.2一0.4cm ;所述檢測線與質控線的間距是0.5-0.8cm ;所述底板的寬度是 0.3—0.5cm。
[0013]作為優(yōu)選，本實用新型所采用的吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本實用新型具有如下優(yōu)點:
[0015]1、本實用新型是將免疫層析與量子點標記技術綜合起來，利用本實用新型制備的高效價、高特異性多克隆抗體，通過激發(fā)熒光來對樣品進行檢測，具有靈敏度高的特點(其對人肺炎衣原體的檢測底線為lng/ml)，用其對臨床樣品的檢測結果與目前對該病原體的檢測“金標準”-培養(yǎng)法的相比無統(tǒng)計學差異。
[0016]2、本實用新型所用的抗體均是識別人肺炎衣原體特異性98KD表面抗原胞外保守區(qū)的多克隆抗體，其特異性高，屬于種特異性抗體，不與沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體起交叉反應，同時其較目前最廣泛使用的單克隆抗體而言制備成本低廉，因此，本實用新型檢測成本較低。
[0017]3、本實用新型檢測方法簡單，檢測快速，易于判定，結果判定在20分鐘內(nèi)完成，既可以用紫外檢測儀進行定性檢測，亦可結合CCD掃描等技術進行定量檢測，檢測成本低廉，克服了現(xiàn)有技術GnELISA)檢測成本高、操作復雜繁瑣、耗時長、且必需專業(yè)人員才能操作的不足。
[0018]4、由于檢測卡檢測的是人肺炎衣原體抗原而非抗體(抗體的出現(xiàn)需要感染幾天至幾周以后)，故該方法在人肺炎衣原體的早期臨床診斷和防治、病原體亞型鑒別、流行病學調查等方面具有很高的實用價值。
[0019]5、本實用新型首次以人肺炎衣原體所獨有的98KD表面膜蛋白作為目標抗原，其檢測特異性高，不與其他任何衣原體起交叉反應。而傳統(tǒng)ELISA法的檢測標的為Cpn外膜蛋白-2 (0MP-2)，所用抗體為抗衣原體屬特異性抗體，不能直接識別Cpn，其存在與鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體等起交叉反應的缺點。
[0020]6、本實用新型檢測方法所用的臨床樣本為呼吸道分泌物如痰液等，而非血液，可免除嬰幼兒患者抽血檢查的痛苦與家長的心理負擔，故較易于推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本實用新型所提供檢測卡的縱向剖面結構示意圖；
[0022]圖2是本實用新型所提供檢測卡的在完成組裝后的結構示意圖；
[0023]其中:
[0024]1-樣品塾；2_結合塾；3_檢測層；4_檢測線；5_質控線；6_吸水塾；7_底板。

【具體實施方式】
[0025]本實用新型的工作原理是:本實用新型是在免疫層析測定法(雙抗體夾心)的前提下，以多克隆抗體為基礎，采用量子點標記探針技術，通過量子點標記技術研制檢測人肺炎衣原體抗原的量子點免疫層析檢測卡。首先是兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體和鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體的制備、純化以及量子點標記，其次為噴膜，然后將檢測卡各組成成分進行組裝，最后制備人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡。本實用新型所提供的檢測卡具有敏感、快速和特異性好等特點，并且可定量檢測，能進行樣品的高通量篩查，具有較好的市場應用前景。
[0026]如附圖1所示，本實用新型所提供了一種人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，包括樣品墊1、結合墊2、檢測層3、吸水墊6及底板7組成。結合墊2上包被有量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針；檢測層3是噴有檢測線4以及質控線5的固相硝酸纖維素膜簡稱NC膜；檢測線4包被有鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體；質控線5包被有抗兔IgG ;量子點為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點；吸水墊6材質為吸水濾紙；底板7材質為PVC。
[0027]其具體結構是:檢測層長2cm，檢測層粘貼在長度是6.6-7.7cm的底板表面中間段；檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是2.5-3cm的吸水墊重疊0.2-0.4cm ;檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是0.5-0.8cm的結合墊重疊0.2-0.4cm ;結合墊與粘貼在結合墊以及底板上的長度是2.5cm的樣品墊重疊0.2—0.4cm ;檢測線與質控線間距是0.5_0.8cm ;底板的寬度是0.3_0.5cm。
[0028]其中，上述參數(shù)優(yōu)選方案是:檢測層3長2cm，粘貼在底板7長7.3cm表面中間段，此檢測層右端與粘貼在底板7右末端的吸水墊6長3cm重疊0.2cm,其另一端與結合墊2長0.6cm重疊0.3cm ;結合墊2則與粘貼在底板7左端的樣品墊(I)長2.5cm重疊0.3cm ;檢測層3上的檢測線4及質控線5間距0.7cm。整條檢測卡的寬度為0.4cm。
[0029]制備上述人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡的方法，其主要步驟包括:
[0030]一、結合墊的制備
[0031](I)重組M98_His融合蛋白的制備、純化:
[0032]對人肺炎衣原體98KD膜蛋白進行生物信息學分析，獲取人肺炎衣原體98KD膜蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序列；在此二基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位點并分別化學合成全基因序列，同時標記記為m98。其基因序列參見序列表。將該基因序列按常規(guī)方法克隆入表達載體pET-28a(+)后表達重組M98-His融合蛋白。此融合蛋白以包涵體表達形式存在于基因工程菌體中。用鎳柱純化基因工程菌菌體中的重組M98-His、融合蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，再以Bradford法測定蛋白質濃度，調整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；
[0033](2)兔及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備:
[0034]以純化的重組M98_His融合蛋白為完全抗原，按常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔及豚鼠，分別制備兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗血清。該二種抗血清的間接ELISA效價均大于IX 15,用Protein G親和層析柱分別純化二種抗血清中的多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并均調整為3mg/mL后備用。其中兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG用作量子點標記試驗；鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG用作檢測線的包被。
[0035](3)量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針的制備與純化
[0036]其操作步驟如下:向微量離心管中依次加入2nmol量子點、300nmol N-輕基琥拍酰亞胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亞胺(EDC)，以磷酸鹽緩沖液(2.9g/L磷酸氫二鈉，
0.295g/L磷酸二氫鈉,2g/L氯化鈉，pH 7.3)定容為2ml,于旋轉混合儀中，以15rpm/min,37V反應30min后，透析去除過量的活化劑(sulfo-NHS與EDC)。在活化的量子點中，加入4-12nmol(優(yōu)選為6nmol)的步驟(2)所制備的兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h，加入端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至終濃度為1.5%，封閉未反應的活化羧基位點，繼續(xù)避光反應lh。用0.2 μ m PES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應的抗體和反應中的副產(chǎn)物。收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，lg/L疊氮鈉，pH 7.3)中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min,收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L BSA，lg/L疊氮鈉，pH 7.3)中，制得量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針。
[0037](4)量子點標記抗體的負載
[0038]將聚酯纖維膜浸入步驟(3)所得到的量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針溶液中l(wèi)h，取出，25°C干燥后裁成4cm*0.6cm的規(guī)格后4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結合墊。
[0039]二、樣品墊的制備
[0040]取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，20g/L牛血清白蛋白(BSA)，10ml/L吐溫-20，20g/L蔗糖，5g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-1O)，pH 7.3)中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜內(nèi)37°C通風干燥后，剪裁成4cm*2.5cm的規(guī)格，25°C密封干燥保存。至此制得樣品墊。經(jīng)試驗證實玻璃纖維素膜經(jīng)該種方法處理后，顯著地提高了量子點標記抗體的釋放率。
[0041]三、檢測層的制備
[0042]檢測層的制備，是通過分別將由步驟一中所制備的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG和抗兔IgG用專用的噴膜機在硝酸纖維素膜上形成檢測線和控制線；其具體制備方法包括如下步驟:
[0043]將步驟一中制備的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG和抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，pH 7.3)分別均調整至終濃度為0.5-2.5mg/mL，其中鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG優(yōu)選的稀釋終濃度為1.5-2.0mg/mL，抗兔IgG優(yōu)選的稀釋終濃度為0.5-1.5mg/mL。將稀釋好的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG裝入B1DOT劃膜儀噴頭中，設置0.8-2.5 μ I/cm,優(yōu)選為1.0-2.0 μ 1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝入B1DOT劃膜儀噴頭中，設置0.8-2.5μ 1/cm，優(yōu)選為1.0-2.0 μ 1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，其與檢測線間距為0.7cm。將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cm*4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存。至此制得檢測層。
[0044]四、底板的加工
[0045]將PVC材質的底板裁剪成4cm*7.3cm的規(guī)格后備用。
[0046]五、吸水墊的制備
[0047]將吸水濾紙裁剪成4cm*3cm的規(guī)格，即制成吸水墊，備用。
[0048]六、檢測卡的組裝
[0049]組裝工作于生物安全柜內(nèi)操作，首先將步驟四所述的底板上的粘性保護膜揭掉，將上文步驟三所述的檢測層(即帶有I條質控線和I條檢測線的硝酸纖維素膜)粘貼到底板的中部區(qū)域，并小心抹平膜面。其次，將上文步驟五所述的吸水墊組裝到底板上，使其左邊與檢測層有0.2cm的重疊，同時將其右邊緣與底板的右邊緣對齊粘好并小心抹平。再將上文步驟一所述的結合墊按0.3cm重疊于硝酸纖維素膜的左邊緣處，0.3cm粘于底板上。最后將上文步驟二所述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并小心抹平。將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0mm寬的檢測卡，4°C密封干燥避光保存。至此制得人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡。
[0050]上述人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡的使用方法，步驟如下:
[0051]將待檢樣品(如咽拭子等)用500 μ I的樣品處理液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，Nonidet P_4010ml/L，SDS lml/L，2g/L氯化鈉，ρΗ7.3)充分溶解后，取出120 μ L滴于檢測卡的樣品墊上，15分鐘后于紫外燈下觀察檢測結果。若待檢樣品中含有人肺炎衣原體抗原，則與結合墊中的量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針結合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體結合后在紫外線激發(fā)下在檢測線處會形成肉眼可見的一條熒光檢測線，未結合完的量子點標記抗體繼續(xù)層析與抗兔IgG結合后在紫外線激發(fā)下形成肉眼可見的第二條熒光質控線；若待檢樣品中無相關抗原，則僅出現(xiàn)一條熒光質控線。如果熒光質控線未出現(xiàn)，則該檢測卡失效。
[0052]本實用新型所需的羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點可到例如武漢珈源量子點技術開發(fā)有限公司等專業(yè)性公司購買；所需的PVC材質底板、吸水濾紙、硝酸纖維素膜、聚酯纖維膜、玻璃纖維素膜等可到Millipore及上海金標生物科技有限公司等專業(yè)性公司購買，所需的其他常規(guī)儀器、設備、生化藥品均有市售。
[0053]本實用新型通過以下實施例作進一步具體描述。
[0054]本實用新型使用或采用的各種材料的來源及相關試劑的配制
[0055]1、樣品墊處理液:稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉，2g牛血清白蛋白(BSA)，Iml吐溫-20，2g蔗糖，0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0056]2、磷酸鹽洗滌液:稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉，
0.5ml吐溫-20，0.1g疊氮化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用Imol/LNaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0057]3、磷酸鹽保存液:稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉，Ig牛血清白蛋白(BSA)，0.1g NaN3，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0058]4、磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0059]5、兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG:為本實用新型自制，用PBS稀釋，搖勻，使溶液中多克隆抗體濃度為3mg/ml。
[0060]6、鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG:為本實用新型自制，用PBS稀釋，搖勻，使溶液中多克隆抗體濃度為3mg/ml。
[0061]7、羊抗兔IgG:為博士德公司產(chǎn)品，用PBS稀釋，搖勻，使溶液中多克隆抗體濃度為lmg/ml。
[0062]8、量子點:本實用新型中所用量子點為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點，其發(fā)射波長為565nm，購買自武漢珈源量子點技術開發(fā)有限公司，產(chǎn)品名稱為羧基水溶性量子點-565。
[0063]9、玻璃纖維素膜:厚度為0.4mm,吸水量為42mg/cm2，玻璃纖維直徑為0.6-3 μ m，具有良好的親水性，購買于上海金標生物科技有限公司(型號為BT40)。
[0064]10、聚酯纖維膜:厚度為0.48mm，吸水速度為18s/4cm，具有極好的親水性，用于結合墊的制備，購買于上海金標生物科技有限公司(型號為DL42)。
[0065]11、硝酸纖維素膜:型號為Millipore Corp SHF135,有襯板,購買于Millipore公司。
[0066]12、吸水濾紙:厚度為0.95mm,吸水速度為60s/4cm，吸水量為700mg/cm2，具有良好的吸水性，作為制作吸水墊的材料。購買于上海金標生物科技有限公司(型號為CH37K)。
[0067]13、底板:為高白度PVC材質，表面涂布單層高聚合物壓敏膠SM31，購買于上海金標生物科技有限公司。
[0068]14、人肺炎衣原體菌株:購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC53592。
[0069]15、本實用新型所用到的微生物樣品均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
[0070]下面結合實施例對本實用新型所提供的技術方案進行詳細說明:
[0071 ] 實施例1 (制備實施例)
[0072]結合墊的制備
[0073](一 )重組M98_His融合蛋白的制備、純化
[0074]1.相關基因的克隆
[0075]對人肺炎衣原體98KD表面蛋白(其NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫中的access1n number為CAA04672)進行生物信息學分析，獲取其胞外保守結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的DNA編碼序列，同時在其5’引入酶切位點Nde1、3’端引入終止信號TAA和酶切位點XhoI后化學合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成,交貨時人工合成的基因片段連于載體PUC57上)，記為m98。具體的說，m98基因編碼的蛋白質序列為天然人肺炎衣原體98KD表面蛋白(access1n number:CAA04672)的130_305aa。將含有該段人工合成的DNA片段的載體pUC57用NdeI及XhoI進行雙酶切后按常規(guī)方法回收目的片段，備用。同時采用NdeI及XhoI對載體pET-28a(+)進行雙酶切，并按常規(guī)方法將經(jīng)雙酶切后獲得的m98基因連入pET-28a (+)載體中，并轉化大腸桿菌TOP10，構建pET_M98表達載體。經(jīng)酶切和序列測定證實表達載體構建無誤。該載體表達重組M98-His融合蛋白。
[0076]2.重組M98_His融合蛋白的表達與純化
[0077]將鑒定正確的陽性克隆菌培養(yǎng)后提取質粒，按常規(guī)技術轉入感受態(tài)E.coliBL21 (DE3)中，轉化完成后將菌液涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常規(guī)方法篩選表達菌株。挑取PET-M98轉化的具有外源蛋白表達能力的單個菌落并接種入10mL LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)過夜。取出菌液后，按1:100接種于10mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6時，加入lmol/LIPTG至終濃度為Immol/L,于37°C搖菌培養(yǎng),誘導融合蛋白表達。誘導4h后分別于8000r/min下離心1min收集菌體。將菌體用20mL PBS緩沖液洗滌3次并再次重懸后進行超聲破碎，操作條件為:50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲完成后，12000g離心15min收集沉淀，即為包涵體。將此包涵體用洗滌緩沖液(20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;3M尿素，30mM咪唑，pH7.4)洗滌兩次后，12000g 離心 15min 收集沉淀。將沉淀用 Binding buffer (20mM Na3PO4,0.5M NaCl ；8M尿素，30mM咪唑，pH7.4)于室溫下溶解后，12000g離心15min，上清用0.45 μ m的濾膜進行過濾。此溶解液中的重組蛋白用His Trap affinity columns (GE healthcare公司產(chǎn)品)，按照說明書的方法進行純化。具體方法如下:
[0078]I)用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上，以lmL/min流速洗柱。
[0079]2)用 10mT, Binding buffer 平衡，lmL/min 流速。
[0080]3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0081]4)用 10mT, Binding buffer,以 lmL/min 流速洗柱。
[0082]5)用 1mL Elut1n buffer (20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;8M 尿素，500mM 咪唑，PH7.4)，以lmL/min流速洗脫，分管收集，每管1ml，12% SDS-PAGE檢測，合并洗脫組分中含有目的蛋白的樣品。經(jīng)bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定后,調整濃度為0.2mg/mL。
[0083]( 二)兔及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0084]1.兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0085]用步驟(一)純化的重組M98-His融合蛋白按照200 μ g (ImL)與ImL弗氏完全佐劑混勻乳化后免疫雄性新西蘭大白兔(由湖北省疾病預防控制中心提供)，于背部皮下多點注射，間隔7d后再免疫一次，再過14d后用上述純化的重組M98-His融合蛋白按照200 yg(ImL)與ImL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進行加強免疫，加強免疫7d后再按上述同樣方法再加強免疫一次。7d后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復進行一到兩次加強免疫，至抗體滴度滿意(用ELISA法測定抗體效價大于I X 15)。若滿意則心臟采血，分離血清，以Protein G親和層析柱(GE healthcare公司產(chǎn)品)，嚴格按照操作說明書純化多克隆抗體IgG,用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖液(8g/LNaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HP04pH7.4)調整為 lmg/mL，_20°C保藏備用，至此制得兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG。Westen blot試驗表明，此多克隆抗體IgG能特異性識別人肺炎衣原體全長98KD膜蛋白。
[0086]2.鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0087]用步驟(一)純化的重組M98_His融合蛋白作為完全抗原免疫豚鼠(由湖北省疾病預防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200 μ g/只?；A免疫為等體積的抗原與弗氏完全佐劑進行乳化，每隔2周進行一次加強免疫，加強免疫用等體積抗原與等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，總共免疫4次。末次免疫1d后取血分析抗體滴度。若不滿意，可重復進行一到兩次加強免疫，至抗體滴度滿意(用ELISA法測定抗體效價大于I XlO5)。若滿意則處死豚鼠取血清，以Protein G親和層析柱(GE healthcare公司產(chǎn)品)，嚴格按照操作說明書純化多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HP04pH = 7.4)調整為 lmg/mL，備用，至此制得鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG。Westen blot試驗表明，此多克隆抗體IgG能特異性識別人肺炎衣原體全長98KD膜蛋白。
[0088](三)量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針的制備
[0089]1.納米羧基量子點標記兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG反應條件的優(yōu)化:
[0090]1.1、羧基量子點標記抗體探針最佳標記pH的確定
[0091]將標記反應中磷酸鹽緩沖液pH分別設為5，6，7，8，9，對標記產(chǎn)物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察不同PH值對偶聯(lián)反應的影響，確定了量子點標記多抗反應的最佳pH為7.0-8.0。本實驗選擇pH7.4。
[0092]1.2、羧基量子點標記抗體探針最佳標記量的確定
[0093]將量子點摩爾濃度與多抗?jié)舛戎确謩e設置為1:1，1:2，1:3及1:4，進行標記反應后，對標記產(chǎn)物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察二者不同濃度比對偶聯(lián)反應的影響，確定量子點標記兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG反應的最佳摩爾濃度比為量子點與抗體摩爾比為1:3。本實驗選擇該最優(yōu)濃度比來確定標記量。
[0094]1.3、羧基量子點標記抗體探針最佳封閉劑種類的確定
[0095]以乙醇胺、Tris, PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，按步驟1.1及1.2確定的條件進行標記反應后，對標記產(chǎn)物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察不同的封閉劑對于標記反應的影響，結果發(fā)現(xiàn)，PEG2000-NH2為最佳封閉劑，其可顯著提高標記復合物的膠體穩(wěn)定性及免疫活性。
[0096]2.標記過程:
[0097]向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點、300nmol N-羥基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亞胺(EDC)，以磷酸鹽緩沖液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，pH 7.4)定容為2ml，不停地混合溶液，37 °C反應30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS與EDC。在活化的量子點中，加入6nmol的步驟(二)制備的的兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至終濃度為I%，封閉未反應的活化羧基位點，繼續(xù)避光反應lh。用
0.2ym PES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應的抗體和反應中的副產(chǎn)物。收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L BSA，0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，至此制得量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0098](四)量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針的負載
[0099]將聚酯纖維膜浸入步驟(三)所得到的量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針溶液中Ih,取出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm*0.6cm/條后,4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結合墊。
[0100]實施例2 (制備實施例)
[0101]樣品墊的制備
[0102]配制不同配方的樣品墊處理液，觀察量子點標記抗體的釋放效果，通過多次正交試驗優(yōu)化，得到最優(yōu)的樣品墊處理液配方(即本實用新型所述)。取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜內(nèi)37°C通風干燥后，剪裁成規(guī)格為4cm*2.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封干燥保存。經(jīng)試驗證實該樣品墊的使用，大大提高了結合墊上量子點標記抗體的釋放率，達到了較好的應用效果。
[0103]實施例3 (制備實施例)
[0104]檢測層的制備
[0105]將硝酸纖維素膜剪成4cm*4cm大小。將實施例1中所制備的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG和抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0mg/mL及
1.0mg/mL。將稀釋好的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG裝入B10D0T劃膜儀噴頭中，設置1.0 μ Ι/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝入B10D0T劃膜儀噴頭中，設置1.0 μ Ι/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，其與檢測線間距為0.7cm。將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cm*4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存。至此制得檢測層。
[0106]實施例4 (制備實施例)
[0107]檢測卡的組裝
[0108]下面結合附圖1及附圖2對檢測卡的組裝作進一步說明。
[0109]將底板裁剪成4cm*7.3cm大小，備用。
[0110]將吸水濾紙裁剪成4cm*3cm大小,作為吸水墊,備用。
[0111]組裝工作于生物安全柜內(nèi)操作，首先將底板7上的粘性保護膜揭掉，將實施例3所述的檢測層3即帶有質控線5和檢測線4的硝酸纖維素膜粘貼到底板7上附圖1所指的具體區(qū)域，并小心抹平膜面。其次，將事先裁好的吸水墊6組裝到底板7上，使其左邊與檢測層右末端有0.2cm的重疊，其右邊緣則與底板7的右邊緣對齊粘好并小心抹平。再將實施例I所描述的結合墊2按0.3cm重疊于檢測層3的左邊緣處，0.3cm粘于底板7上。最后將實施例2所描述的的樣品墊I則按一邊0.3cm重疊于結合墊2的左邊緣處，另一邊與底板7的左邊緣對齊，粘于底板7上并小心抹平。將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0mm寬的檢測卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0112]實施例5 (應用實施例)
[0113]檢測卡的使用方法
[0114]按常規(guī)方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500 μ I的樣品處理液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L 磷酸二氫鈉，Nonidet P_4010ml/L，SDS lml/L，2g/L 氯化鈉，pH 7.3)的軟質塑料管中，擠壓塑料管壁，使拭子上的樣品充分溶解后，取出120 μ L滴于檢測卡的樣品墊上，15分鐘后于紫外分析儀下(型號為WD-9403A，北京六一儀器廠生產(chǎn)，紫外激發(fā)波長365nm)觀察檢測結果。若咽拭子中含有人肺炎衣原體抗原，則與結合墊中的量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針結合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體結合后在紫外線激發(fā)下在檢測線處會形成肉眼可見的一條熒光檢測線，未結合完的量子點標記抗體繼續(xù)層析與抗兔IgG結合后在紫外線激發(fā)下形成肉眼可見的第二條熒光質控線；若待檢咽拭子中無相關抗原，則僅出現(xiàn)一條熒光質控線。如果熒光質控線未出現(xiàn)，則該檢測卡失效。
[0115]實施例6 (應用實施例)
[0116]本實用新型的應用效果舉例
[0117]本實施例中所指的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡的使用方法參照實施例5所述的操作步驟。
[0118]I)特異性試驗
[0119]用呼吸道常見病原體如人呼吸道合胞病毒(Long株，ATCC編號VR26)、人肺炎支原體(ATCC編號15531)、人肺炎衣原體(AR-39株，ATCC編號53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC編號VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC編號VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC編號VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC編號VR-790)、流感嗜血桿菌(ATCC編號53781)、肺炎鏈球菌(ATCC編號700670)等代替人肺炎衣原體進行檢測，檢測卡檢測含這些微生物的樣品處理液都為陰性。
[0120]2)敏感性試驗
[0121]通過測定人肺炎衣原體培養(yǎng)物稀釋液來做敏感性研究，確定實施例4所述的檢測卡檢測人肺炎衣原體菌株(AR-39株，ATCC編號53592)的檢測下限為lng/ml。
[0122]3)臨床測試例
[0123]以人肺炎衣原體檢測金標準-培養(yǎng)法作為參照，取68例呼吸科下呼吸道感染者的肺泡灌洗液標本用實施例4所描述的檢測卡進行檢測，培養(yǎng)法陽性率為27.9% (19/68)，本檢測卡為26.5% (18/68)，2種方法的符合率為95.6% (65/68) 0
[0124]表I臨床標本的檢測結果
[0125]

納米量子點免疫層析法
痰培養(yǎng)法陽性陰性總計
陽性 172.19
陰性 I48 49
總計 1850 68
[0126]需要指出的是，以上所述僅為本實用新型的較佳實施例而已，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換等均應包含在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.一種人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡包括底板、樣品墊、結合墊、檢測層以及吸水墊；所述結合墊包被有量子點標記的抗人肺炎衣原體納米探針；所述檢測層是由帶有一條檢測線及一條質控線的固相硝酸纖維素膜構成；所述檢測線包被有鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體；所述質控線包被有抗兔IgG ;所述檢測層粘貼在底板上；所述結合墊以及吸水墊分別設置在檢測層兩端部的上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層以及底板粘貼在一起；所述樣品墊設置在結合墊上方且與結合墊部分重合后分別與結合墊及底板粘貼在一起。
2.根據(jù)權利要求1所述的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
4.根據(jù)權利要求3所述的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述檢測層長2 cm，所述檢測層粘貼在長度是6.6-7.7 cm的底板表面中間段；所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是2.5-3 cm的吸水墊重疊0.2-0.4 cm ;所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是0.5-0.8 cm的結合墊重疊0.2-0.4 cm ;所述結合墊與粘貼在結合墊以及底板上的長度是2.5 cm的樣品墊重疊0.2—0.4 cm ;所述檢測線與質控線白勺間距是0.5-0.8 cm ;所述底板的寬度是0.3-0.5 cm。
5.根據(jù)權利要求4所述的人肺炎衣原體量子點免疫層析檢測卡，其特征在于:所述吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。
【文檔編號】G01N33/569GK204028084SQ201420465554
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權日:2014年8月18日
【發(fā)明者】胡征, 楊波, 董俊 申請人:董俊