專利名稱：：水產(chǎn)品中檢測隱性孔雀石綠的免疫膠體金試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域中涉及免疫膠體金和獸藥殘留檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種適用于檢測水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠殘留的免疫膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
：孔雀石綠(Malachitegreen)分子式為C23H25C1N2，是一種工業(yè)用三苯甲烷triphenylmehtane類染料，由于具有抗菌及抗革蘭氏陽性菌的功效，且價格便宜，所以被廣泛用于養(yǎng)殖漁業(yè)之預(yù)防魚的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病等，而且為了使鱗受損的魚延長生命，在運輸過程中和存放池內(nèi)，也常使用孔雀石綠。當養(yǎng)殖水含有孔雀石綠時，魚體、蝦等會快速吸收孔雀石綠進而代謝成為隱性孔雀石綠(L印comalachitegreen，LMG)，即N，N-二甲基苯胺，分子式C23H26N2，隱色孔雀石綠不溶于水，殘留毒性比孔雀石綠更強，可囤積在肌肉中長達數(shù)月。近年來有關(guān)此類染料的毒理研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠及其主要代謝物隱性孔雀石綠具有多重毒性，包括致癌性、致基因突變、引起染色體斷裂、致畸胎及呼吸道毒性。鑒于此，許多國家均將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。因為水產(chǎn)品(魚肉、蝦等)具有營養(yǎng)齊全、平衡的特點，越來越受到人們的青睞。到1996年，我國水產(chǎn)品產(chǎn)量已超過2000萬噸，占全國肉類食物生產(chǎn)總量的1/3，躍居世界第一位。隨著人民生活水平的提高，對水產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量有了更新的要求。然而，我國漁業(yè)發(fā)展面臨著一系列新的挑戰(zhàn)，其中食品安全問題在一定程度上嚴重制約了我國漁業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，而違法添加孔雀石綠是目前最突出的問題。我國于2002年5月將孔雀石綠列入禁用的獸藥。農(nóng)業(yè)部新聞辦公室發(fā)布了2007年第一次水產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)測結(jié)果。去年具體年份上旬，農(nóng)業(yè)部組織有關(guān)質(zhì)檢機構(gòu)對我國22個城市水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況進行了本年度第一次例行監(jiān)測，IO個城市均有樣品檢出了孔雀石綠。由于巨大利益的驅(qū)動，很難真正有效地控制杜絕孔雀石綠的使用，這也就意味著對孔雀石綠檢測需求是長期的。目前國際上對孔雀石綠和隱性孔雀石綠的檢測技術(shù)路線主要有兩條一條是以色(質(zhì))譜技術(shù)為核心的化學檢測技術(shù)，另一條是快速生物檢測技術(shù)。高效液相色譜法成本髙，操作時間長，步驟多且復(fù)雜，因此無法實現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場檢測。而膠體金試紙條檢測法靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、操作簡便、現(xiàn)場快檢測等優(yōu)點，容易被基層掌握并大面積推廣，適合于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測，不需要特定的儀器設(shè)備，也不需要特定的其他檢測試劑，減少了檢測單位的負擔，能快速檢測獲得初步的檢測結(jié)果，適合我國當前社會經(jīng)濟技術(shù)水平，因此是未來孔雀石綠檢測的主要發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種采用金標技術(shù)現(xiàn)場快速檢測隱性孔雀石綠殘留的膠體金試紙條。本發(fā)明提供了一種快速檢測隱性孔雀石綠殘留的膠體金試紙條，所產(chǎn)生的單克隆抗體為特異性抗隱性孔雀石綠單克隆抗體。所述的隱性孔雀石綠單克隆抗體為隱性孔雀石綠半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動物(例如兔、鼠)制得。所述的隱性孔雀石綠半抗原是采用化學方法使其含有活性基團，所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的隱性孔雀石綠-載體蛋白偶聯(lián)物采用混合酸酐法、重氮法或戊二醛法等偶聯(lián)得到。所述膠體金標記可以用商品化的氯金酸，通過產(chǎn)生的氯金酸與隱性孔雀石綠單克隆抗體偶聯(lián)制得。為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩査，所述隱性孔雀石綠的免疫膠體金試紙條包括NC膜、樣品墊、膠金墊、吸水紙、檸檬酸三鈉、PVC背襯和結(jié)合墊，PVC背襯一端依次黏附樣品墊、膠體金結(jié)合墊、中間黏附NC膜層，另一端依次黏附吸水墊，其特征是膠體金結(jié)合墊包被了抗隱性孔雀石綠特異性單克隆抗體一膠體金標記物,NC膜上吸附了隱性孔雀石綠-OVA和羊或兔抗鼠IgG。制備本發(fā)明檢測水中產(chǎn)品隱性孔雀石綠的免疫膠體金試劑方法為(1)隱性孔雀石綠半抗原和全抗原合成通過在苯環(huán)對位偶聯(lián)一活性基團-COOH，合成隱性孔雀石綠半抗原；將隱性孔雀石綠半抗原與載體蛋白按1:1030摩爾比混勻，戊二醛或重氮法等合成隱形孔雀石綠-載體蛋白偶聯(lián)物，經(jīng)分離純化后得到隱性孔雀石綠半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；(2)單克隆抗體制備以半抗原-BSA為免疫原多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選獲得陽性雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細胞培養(yǎng)收集上清液等方法，大量制備抗隱性孔雀石綠單克隆抗體；(3)單克隆抗體膠體金標記用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成2040nrn的膠體金顆粒；然后把膠體金與抗隱性孔雀石綠單克隆抗體按l:0.0050.015(體積質(zhì)量比)混勻，使其結(jié)合形成穩(wěn)定的膠體金顆粒，經(jīng)純化和濃縮產(chǎn)生抗隱性孔雀石單克隆抗體-膠體金標記物；(4)羊(兔)抗鼠IgG制備將半抗原-OVA多次免疫小鼠，獲取抗血清，再免疫山羊或兔，經(jīng)分離純化后獲得羊(兔)抗鼠IgG;4(5)膠體金結(jié)合墊的制備將隱性孔雀石綠特異單克隆抗體-膠體金標記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將隱性孔雀石綠-OVA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG吸附在NC膜的檢測區(qū)和控制區(qū)，在37'C充分干燥；(6)膠體金試紙條組裝將NC膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊等依次粘連在PVC背襯上，將粘好的PVC材料切成一定寬度的試紙條，最后組裝到一定大小的塑料盒中即可。有益效果本發(fā)明的檢測隱性孔雀石綠免疫膠體金試紙條，采用直接競爭免疫法，以膠體金標記隱性孔雀石綠特異單克隆抗體，能快速定性檢測，結(jié)果準確，無需試劑洗滌和標準對照，能分批或單個樣品及時檢測。本發(fā)明的檢測隱性孔雀石綠免疫膠體金試紙條，使用原材料進行生產(chǎn)，產(chǎn)品生產(chǎn)流程簡單，成本低，檢測費用僅為氣相/液相色譜的1/5左右，為酶標試劑盒的1/3。為使用者節(jié)省時間，降低因操作步驟冗繁造成的誤差，試劑保存時間長、現(xiàn)場操作方便等優(yōu)點，可在水產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為隱形孔雀石綠免疫膠體金試紙條結(jié)構(gòu)圖圖2為膠體金溶液可見光掃描圖譜圖3為隱形孔雀石綠免疫膠體金試紙條保質(zhì)期檢測數(shù)據(jù)曲線圖具體實施提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成任何限制。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。實施例l半抗原及完全抗原(免疫原)合成1.1對隱性孔雀石綠乙兩的制備在100mL三頸瓶中加入20mL二氯甲垸，18g(0.135mol)無水三氯化鋁。冰鹽浴冷卻至-l(TC，滴加7.1g(0.07mol)醋酐和21.61g(0.065mo1)隱性孔雀石綠的混合液，控制內(nèi)溫不超過-5。C。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌15h，溶液從黃色變成暗紅色。將反應(yīng)液傾入50mL濃鹽酸和50g碎冰的混合物中，然后用分液漏斗分出水層，并用二氯甲烷萃取兩次。合并有機相，用水洗至中性，無水硫酸鈉干燥。蒸餾除去溶劑得黃色油狀物9.8g。粗品可直接用于溴仿反應(yīng)。1.2對隱性孔雀石綠甲酸的制備氫氧化鈉6.3g溶于54mL水中，冷卻至-5'C。滴加6.4g(0.04mol)，控制內(nèi)溫不超過0°C。然后將對隱性孔雀石綠乙酮粗品5.04g滴加至反應(yīng)液中，控制內(nèi)溫不超過10'C。滴加完畢，保溫lh，然后于室溫攪拌2h。靜置分層，分去生成的溴仿。水層用濃鹽酸調(diào)至pH12，析出白色固體。抽濾，水洗至中性。將固體溶于20mL氫氧化鈉溶液(5X)中，過濾，淺黃色澄清液體用濃鹽酸調(diào)至pH12，析出白色晶體。抽濾，水洗至中性，烘干，得白色晶體1.7g，收率81X(按隱性孔雀石綠計)。m.p.ll7120。C。HNMR(300MHz，CDC13)，S:1.28(d，6H，J-6.9Hz);2.99(m，1H,J-6.9Hz);7.33(d，2H，J=8.3Hz);8.05(d，2H，J-8.3Hz)。1.3免疫原的合成活潑酯法制備免疫原是這樣實現(xiàn)的取等摩爾量的隱性孔雀石綠半抗原和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，環(huán)二己基碳二亞胺(DCC)，用二甲基甲酰胺(DFM)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，離心去處沉淀后，取上清液干燥，取其225mL加入含250mgBSA的8mL碳酸鹽緩沖液(Ph9.6含5%甲醇)中，混合物在4'C下磁力攪拌2小時，在4'C條件下透析過夜4次(pH7.4的磷酸鹽緩沖液)，經(jīng)紫外掃描儀進行全波長掃描鑒定偶聯(lián)結(jié)果。圖2為采用活潑酯法制備的BSA-半抗原的偶聯(lián)物(免疫原)的紫外掃描圖，圖中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白BSA、載體蛋白BSA-半抗原的偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收圖譜，從圖中可看出載體蛋白BSA特征吸收峰在278nm處，半抗原特征吸收峰在260nm處，載體蛋白BSA-半抗原的偶聯(lián)物特征吸收峰在255nm處，偶聯(lián)物特征峰發(fā)生漂移。實施例2全抗原單克隆抗體的制備及效價檢測2.1單克隆抗體的制備以BSA-半抗原為免疫原，免疫4只BALB/C小鼠，每只小鼠取IOO嗎免疫原，與等體積弗氏完全佐劑混合乳化均勻，沿腹股溝注入腹腔膜內(nèi)。4個周后，加強免疫，劑量不變，佐劑改為弗氏不完全佐劑。加強免疫三次后，采血測效價，待血清效價不再上升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后在無菌條件下取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞按5-10:1的比例混合于50mL離心管，加入30mL無血清IPMI1640培養(yǎng)基，1200r/min離心10min棄上清，將細胞團輕輕振松，置于37'C水浴中。把lmL50n/。PEG-4000緩緩加入細胞中，在lmin內(nèi)滴完，同時輕輕攪動底部沉淀，靜置lmin。沿管壁緩慢加入無血清培養(yǎng)基終止融合過程。前30秒緩慢勻速加入lmL后30秒加入2mL，然后快速加入27mL無血清培養(yǎng)基，1200r/min離心10min，棄上清。融合后的細胞先在HAT選擇性培養(yǎng)液中篩選，5天后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細胞數(shù)量達到300個以上時，用ELISA對細胞培養(yǎng)上清液進行復(fù)孔檢測，次曰重復(fù)檢測已確定結(jié)果。將強陽性孔內(nèi)的細胞用有限稀釋法進行克隆培養(yǎng)，并跟蹤記錄，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測，均呈陽性的孔內(nèi)細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。將雜交瘤細胞經(jīng)過擴大培養(yǎng)，選4只經(jīng)產(chǎn)BALB/C小鼠，腹腔注射液體石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5^105-106/只，IO天后，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水，經(jīng)核酸蛋白紫外掃描儀蛋白分析初步判斷得到的蛋白為IgG蛋白。2.2檢測抗體效價以lpg/mL濃度按每孔100pL包被酶標板，fC包被過夜，洗滌5次，拍干，按每孔200^L封閉液4'C下封閉12h，洗滌3次，拍干。按每孔100nL加入抗血清稀釋倍數(shù)為2000、10000、250000、50000、250000、1250000，陰性血清及空白(不加抗血清，只加其稀釋液)室溫作用30min，洗滌五次，拍干。加入每孔lOOpL酶標羊抗兔(鼠)抗體，室溫作用30min，洗滌五次，拍干。加入每孔100)LiL顯色液，37'C避光作用15min。加入每孔50pL終止液終止反應(yīng)，酶標儀檢測A值(450nm)。以兩倍于陰性血清OD值的血清OD值對應(yīng)的抗血清稀釋度為抗血清效價。檢測結(jié)果見表h表1單克隆抗體效價檢測結(jié)果稀釋倍數(shù)200010000150003000050000250000陰性血清空白0D1值0鄰80.6920.4150.3240.3170.3620.1720.0240D1值0.9750.6730.4420.3980.3650.3540.2070.02OD1值1.1360.9430.7540.5030.3870.3510.1930.0320D1值0鄰20.6690.4110.3760.3440.3510.2230.03從表1的數(shù)據(jù)可以推斷本發(fā)明制備的單克隆抗體的效價達15000。實施例3本發(fā)明中羊(兔)抗鼠IgG的制備選取健康雄性新西蘭大白兔或山羊，以O(shè)VA-半抗原為免疫原與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/kg體重的量進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血lmL，進行抗體效價檢測，當抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固2h后4'C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析得隱性孔雀石綠-OVA羊(兔)抗鼠IgG。實施例4本發(fā)明中膠體金試紙條的制備4.1膠體金的制備免疫膠體金技術(shù)的基本原理是，氯金酸在還原劑的作用下，可聚合為一定大小的金顆粒，7形成帶負電荷的、由于靜電作用而穩(wěn)定的疏水膠溶液。本公司采用檸檬酸三鈉這種還原劑還原法制備膠體金，具體過程如下取0.0"/。氯金酸100mL水溶液加熱至沸，攪動下準確加入"/o檸檬酸三納水溶液0.7mL，金黃色的氯金酸在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后用蒸餾水恢復(fù)原來的體積，即為制備的膠體金溶液。此膠體金溶液是否符合生產(chǎn)需求，除肉眼觀察顏色需要為紫紅色外，還需要采用紫外可見光分光光度計分析，膠體金溶液需在可見區(qū)535nm有最高吸收峰(見圖2)，同時，電鏡圖顯示制備的膠體金顆粒均一性較好、顆粒大小約在40nm。4.2膠體金標記抗體的制備調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.2，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時逐滴加入抗隱性孔雀石綠的單克隆抗體，并加入其它保護劑，全部加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘。通過兩次不同轉(zhuǎn)速的離心獲得均一性金標抗體沉淀。再加入重懸液，混勻后移至干凈燒杯中備用。4.3孔雀石綠膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備依次將吸水紙、噴有氨基隱色孔雀石綠-BSA(檢測線)和羊(兔)抗鼠IgG(質(zhì)控線)的NC膜、噴有抗隱色孔雀石綠抗體的金墊和樣品墊相互疊合固定在PVC底板上，再切成試紙條，裝在塑料模塊中，制成膠體金免疫層析快速檢測卡。實施例5樣品中隱性孔雀石綠殘留的檢測5.1本發(fā)明試劑盒檢測原理抗體標記在膠體金顆粒上，膠體金和樣本同時在NC膜上移動，在移動的過程中，樣本中的孔雀石綠或隱色孔雀石綠和標記在膠體金顆粒上的抗體特異性的反應(yīng)，當樣本中的孔雀石綠或隱色孔雀石綠含量低于試紙條的檢測限時，則免疫金顆粒會和噴在NC膜上的抗原線反應(yīng)形成一條紅色的檢測線帶，反之，則不能形成有色的檢測線帶。5.2樣品處理取5g樣品(魚肉/蟲下)絞碎置入50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯均質(zhì)，以4000g離心5分鐘，取5mL上清液置入玻璃管中，于60'C下以氮氣吹干，于此玻璃管中加入lmL正己烷和lmL蒸餾水，振蕩混勻2分鐘，室溫4000g離心10分鐘，取lOOpL下層液，經(jīng)樣品稀釋液稀釋5倍，待測。實施例6膠體金試紙條靈敏度試驗取3ng/ml完全抑制產(chǎn)品，在緩沖溶液與5個陰性水產(chǎn)品處理樣品中加入隱形孔雀石綠標品，使其終濃度分別為O.l，1，2，3，4，5，6，7，10，30ng/mL。每種樣品重復(fù)5次，判斷試紙條的檢測靈敏度，結(jié)果見下表-.8表2本發(fā)明采用單克隆抗體的膠體金試紙條靈敏度試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從以上結(jié)果可以看出，隱性孔雀石綠膠體金免疫快速檢測試紙條的檢測閾值為3ng/mL。實施例7本發(fā)明膠體金試紙條的特異性試驗在陰性的水產(chǎn)品中(ELISA測定為陰性)分別加入孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫、結(jié)晶紫、克倫特羅、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、呋喃唑酮，使其終濃度為l，5,10，50，100,500ng/mL水產(chǎn)品處理溶液。用試紙條檢測的標準方法檢測，判斷試紙條檢測的特異性，每種濃度的水產(chǎn)品處理樣品做5次重復(fù)。表3水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠免疫膠體^K紙條特異性實驗結(jié)果隱性孔雀石結(jié)構(gòu)類似物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實驗結(jié)果如表3所示，隱性結(jié)晶紫、結(jié)晶紫、克倫特羅、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、呋喃唑酮這些結(jié)構(gòu)類似物在隱形孔雀石綠膠體金免疫快速檢測試紙條中未產(chǎn)生交叉反應(yīng)。實施例8膠體金試紙條的準確度試驗隱形孔雀石綠膠體金免疫快速檢測試紙條是定性，而不是定量卡。該產(chǎn)品對凡是等于或超過3ng/mL的樣品都表現(xiàn)為陽性。添加隱形孔雀石綠到陰性水產(chǎn)品處理樣品中時，是沒有任何提取過程的，只需直接將水產(chǎn)品處理樣品用塑料吸管垂直滴加3滴無氣泡的待檢樣品(約70ul)于加樣孔內(nèi)即可。因此當添加隱性孔雀石綠^3ng/mL，則檢測線不顯色，即判為陽性，所以沒有類似于ELISA的回收試驗結(jié)果本檢測卡的準確率大于96%。實施例9膠體金試紙條保存期試驗試劑盒保存條件為2-8'C，經(jīng)過6個月的測定，隱性孔雀石綠添加實際樣品測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37"C保存條件下放置6天，進行加速穩(wěn)定性實驗，結(jié)果表明該膠體金試紙條各項指標完全符合要求。權(quán)利要求1.檢測隱性孔雀石綠免疫膠體金試紙條及其制備方法，其中包括包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC)、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次黏附樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜層，吸水墊，其特征是膠體金結(jié)合墊包被了抗隱性孔雀石綠特異性單克隆抗體-膠體金標記物，NC膜上吸附了隱性孔雀石綠-OVA或隱性孔雀石綠-BSA和羊(兔)抗鼠IgG。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的隱性孔雀石綠免疫膠體金試劑及其制備方法，其特征在于該試劑的制備方法包括以下步驟(1)隱性孔雀石綠全抗原的合成通過在苯環(huán)對位偶聯(lián)一活性基團-COOH，合成隱性孔雀石綠半抗原；將隱性孔雀石綠半抗原與載體蛋白按1:10-30摩爾比混勻，戊二醛或重氮法等合成隱形孔雀石綠-載體蛋白偶聯(lián)物，經(jīng)分離純化后得到隱性孔雀石綠半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；(2)隱性孔雀石綠特異性單克隆抗體的制備以半抗原-BSA為免疫原多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選獲得陽性雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細胞培養(yǎng)收集上清液等方法，大量制備抗隱性孔雀石綠單克隆抗體；(3)羊(兔)抗鼠IgG的獲得將半抗原-OVA多次免疫小鼠，獲取抗血清，再免疫山羊或兔，經(jīng)分離純化后獲得羊(兔)抗鼠IgG;(4)特異性單克隆抗體膠體金制備用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成2040nm的膠體金顆粒；然后把膠體金與抗隱性孔雀石綠單克隆抗體按1:0.0050.015(體積質(zhì)量比)混勻，使其結(jié)合形成穩(wěn)定的膠體金顆粒，經(jīng)純化和濃縮產(chǎn)生抗隱性孔雀石單克隆抗體-膠體金標記物；(5)膠體金結(jié)合墊的制備將隱性孔雀石綠特異單克隆抗體-膠體金標記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將隱性孔雀石綠-OVA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG吸附在NC膜的檢測區(qū)和控制區(qū)，在37'C充分干燥；(6)膠體金試劑條組裝將NC膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊等依次粘連在PVC背襯上，將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條，最后組裝到一定大小的塑料盒中即可。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測隱性孔雀石綠膠體金免疫試紙條及其制備方法。本發(fā)明所提供的直接競爭法檢測隱性孔雀石綠的膠體金試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC)、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次黏附樣品墊、膠體金結(jié)合墊、中間黏附NC膜層，另一端依次黏附吸水墊，其特征是膠體金結(jié)合墊維包被了抗隱性孔雀石綠特異性單克隆抗體—膠體金標記物，NC膜上吸附了隱性孔雀石綠-OVA和羊抗鼠IgG。本發(fā)明的檢測靈敏度高、簡單快速、價廉物美，整個反應(yīng)只用30分鐘，可用于大批樣品的篩查，現(xiàn)場快速檢測水產(chǎn)品中殘留的隱性孔雀石綠情況。文檔編號G01N33/577GK101655498SQ200910093010公開日2010年2月24日申請日期2009年9月25日優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日發(fā)明者楊曉慧,熊勇華,賴衛(wèi)華,媛陳,華魏,黃啟明申請人:北京中德大地食品安全技術(shù)開發(fā)有限責任公司