專利名稱：一種檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，涉及到魚類精子質(zhì)膜損傷的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在養(yǎng)殖生產(chǎn)中常常需要對(duì)魚類進(jìn)行催產(chǎn)繁育，魚類精子質(zhì)量的好壞是繁育中非常 重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，直接影響受精率、孵化率和成活率。魚類精子排出體外后，其活力容易受 到外界各種環(huán)境因子的影響，不同的環(huán)境條件(溫度、光照等)都會(huì)對(duì)精子造成一定損傷， 從而影響精子的質(zhì)量，降低受精率、孵化率和成活率，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來極大損失。精子質(zhì)膜 是包在精子頭部外面的一層膜，具有豐富的膜蛋白，在受精過程中起著非常重要的作用，但 這層膜對(duì)外界環(huán)境因子極為敏感，容易受到損傷導(dǎo)致破裂或脫落。目前檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜 損傷的方法是通過掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)行觀察，但這種方法只能從外觀進(jìn)行定性觀察， 不能定量分析和統(tǒng)計(jì)，且儀器價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜損傷的方法。本發(fā)明采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，其特征是將新鮮精 子和經(jīng)過低溫處理的精子分別收集到IOmL的離心管中，800 X g離心5min，棄去上清液，用 緩沖液稀釋，使待測(cè)樣本精子數(shù)為(2 3) X IO5 · mL—1 ；加入2uL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800 X g離心5min，再 用緩沖液重新懸浮精子，使精子細(xì)胞濃度為IjXlOSmr1 ；取195 μ L精子懸液，加入 5 μ LAnn-FITC,在室溫下孵化lOmin，然后加入10 μ LPI染液，室溫下避光孵育10_15min ；利 用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)，流式細(xì)胞儀氬離子激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，光源為200mw ； 用Cel-Iquest 9. 3版檢測(cè)每個(gè)精子的前向角散光和側(cè)向角散光；用波長(zhǎng)為520nm的通帶 濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于eiOnm的濾器檢測(cè)PI ；在精子凋亡早期位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè) 的磷脂酰絲氨酸遷移至質(zhì)膜外側(cè)，可與一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V相結(jié)合；因此，將 Annexin V標(biāo)記上熒光素可以作為探針檢測(cè)暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸；同時(shí)結(jié)合使 用碘化吡啶PI進(jìn)行雙染色后，用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)質(zhì)膜完整的正?；罹印①|(zhì)膜損傷的 凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過采用熒光雙染法對(duì)受到不同損傷的精子進(jìn)行 染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，可定量區(qū)分質(zhì)膜完整的精子和質(zhì)膜 不完整的精子，結(jié)果更直觀，更可靠。
具體實(shí)施例方式在魚類的繁殖季節(jié)，采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，將這 2份精子分別收集到IOmL的離心管中，SOOXg離心5min，棄去上清液，用緩沖液(Armexin V-PI檢測(cè)試劑盒，美國BD公司)稀釋，使待測(cè)樣本精子數(shù)為(2 3) X IO5 · mL—1。
加入2 μ L胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800 X g離心5min，再 用緩沖液重新懸浮精子，使精子細(xì)胞濃度為1-2X IO5 ^mr115取195 μ L精子懸液，加入 5yL Ann-FITC (Annexin V-PI檢測(cè)試劑盒，美國BD公司)，在室溫下孵化lOmin，然后加 入10 μ LPI染液，室溫下避光孵育10-15min。利用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)檢測(cè)，流式細(xì)胞儀氬離子激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，光源為 200mw。用 Cel-Iquest 9. 3 版(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)檢測(cè)每個(gè)精子的前 向角散光(ESC)和側(cè)向角散光(SSA)。用一波長(zhǎng)為520nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光(FLl)， 另一波長(zhǎng)大于eiOnm的濾器檢測(cè)PI (FL3)。在精子凋亡早期位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS)遷移至質(zhì)膜外側(cè)，可與一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)相結(jié)合。因此，將 Annexin V標(biāo)記上熒光素可以作為探針檢測(cè)暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸。同時(shí)結(jié)合使 用碘化吡啶PI進(jìn)行雙染色后，用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)質(zhì)膜完整的正?；罹?、質(zhì)膜損傷的 凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。質(zhì)膜有損傷的精子DNA可被PI染色產(chǎn)生紅色熒光，質(zhì)膜保持完好的精子則不會(huì)有 紅色熒光產(chǎn)生。因此，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，上方兩個(gè)象限為PI陽性，表示精子 質(zhì)膜不完整，為非活性精子；下方兩個(gè)象限精子質(zhì)膜完整，為活性精子。每個(gè)待測(cè)樣本檢測(cè) 200個(gè)精子，計(jì)算待測(cè)樣本質(zhì)膜完整率。運(yùn)用此方法能準(zhǔn)確檢測(cè)魚類精子的質(zhì)膜損傷，可對(duì)質(zhì)膜的完整率進(jìn)行量化，結(jié)果 更直觀，更可靠，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，采集一定數(shù)量的魚類精子，其特征是將精子收集到10mL的離心管中，800×g離心5min，棄去上清液，用緩沖液稀釋，使待測(cè)樣本精子數(shù)為(2～3)×105·mL-1；加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800×g離心5min，再用緩沖液重新懸浮精子，使精子細(xì)胞濃度為1-2×105·mL-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化10min，然后加入10μL PI染液，室溫下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)，流式細(xì)胞儀氬離子激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，光源為200mw；用Cel-lquest 9.3版檢測(cè)每個(gè)精子的前向角散光和側(cè)向角散光；用波長(zhǎng)為520nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于610nm的濾器檢測(cè)PI；將Annexin V標(biāo)記上熒光素作為探針檢測(cè)暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸；同時(shí)結(jié)合使用碘化吡啶PI進(jìn)行雙染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)質(zhì)膜完整的正?；罹?、質(zhì)膜損傷的凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。
全文摘要
一種檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，需要提供一種檢測(cè)魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，本發(fā)明采集魚類精子，其特征是將精子收集到10mL的離心管中，加入2uL胰蛋白酶消化5min，用緩沖液洗滌重新懸浮精子，使精子細(xì)胞濃度為1-2×105·mL-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化，然后加入10μLPI染液，室溫下避光孵育10-15min；通過采用熒光雙染法對(duì)受到不同損傷的精子進(jìn)行染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，可定量區(qū)分質(zhì)膜完整的精子和質(zhì)膜不完整的精子。
文檔編號(hào)G01N21/952GK101846638SQ20091004812
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者馮廣朋, 劉鑒毅, 姚志峰, 莊平, 張濤, 江琪, 章龍珍, 趙峰, 閆文罡, 黃曉榮 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所