專利名稱：：用于評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的比濁免疫測(cè)定的制作方法用于評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的比濁免疫測(cè)定本發(fā)明涉及通過利用特異性的納米顆粒(nanoparticle)-抗體偶聯(lián)物評(píng)估在人體液樣品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的改進(jìn)的比濁免疫測(cè)定；通過利用所述測(cè)定評(píng)估患者的腎小球?yàn)V過率的方法；相應(yīng)的反應(yīng)試劑盒；和改進(jìn)的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物對(duì)上述提及的醫(yī)學(xué)目的的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：A.Grubb和H.Lovberg[GrubbAO，等尸rac.A^/.^cadt/5L4(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))1982;79]于1981年發(fā)現(xiàn)并且表征了抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C是在后來命名為抑半胱氨酸蛋白酶蛋白蛋白超家族中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)蛋白。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白蛋白超家族是一組抑制半胱氨酸蛋白酶的蛋白。目前抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的其它生物學(xué)功能正在研究中。與抑半胱氨酸蛋白酶蛋白超家族的其它成員相反，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C存在于所有的體液中，而不同的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的總組成隨體液與體液而不同，并且在不同的區(qū)室中[AbrahamsonM，等《/S/o/.(生物的化學(xué)雜志)1986;261:11282]。在1990年，Abmhamsson等證明抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C以穩(wěn)定的速率并且由人體中全部(或接近全部)有核細(xì)胞產(chǎn)生，其叫作"持家"蛋白[AbrahamsonM，等:5/oc/zem.J(生物化學(xué)雜志)1990;268:287-94]。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C---具有13kD的分子量----自由濾過腎臟的正常的腎小球膜，但是然后在"近端小管"中重吸收并且分解代謝，所述"近端小管"是重吸收通過腎小球膜的大部分肽和小蛋白的腎臟的區(qū)室。以這種方式，腎臟為機(jī)體保存這些蛋白質(zhì)物質(zhì)，并且阻止損失到尿中(JacobssonB,等7/^opaAo/ogy(組織病理學(xué))1995;26:559-64.)[HeymsSB，等^m./C7/".A^r.(美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)1983;37:478]。肌酸酐，迄今為止關(guān)于腎小球?yàn)V過率(GFR)的主要應(yīng)用的標(biāo)記，是在肌肉細(xì)胞中產(chǎn)生的小分子量分子。因此，肌酸酐的形成和分泌的速率與機(jī)體的肌肉質(zhì)量緊密聯(lián)系。公知地，群體中個(gè)體的肌肉質(zhì)量變化相當(dāng)大。與機(jī)體質(zhì)量相比，老年人通常具有低的肌肉質(zhì)量，而且隨著他們的疾病發(fā)展許多患者失去肌肉質(zhì)量。與成年人相比，兒童通常具有不同的相對(duì)肌肉質(zhì)量，并且男人比女人具有平均更高的相對(duì)肌肉質(zhì)量。因此，當(dāng)將血清肌酸酐濃度用作腎小球?yàn)V過率標(biāo)記時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)血清肌酸酐值在參照范圍內(nèi)，即使在已經(jīng)發(fā)生50。/。的腎小球?yàn)V過率減少時(shí)[ShemeshO,等(腎臟內(nèi)科)1985;28:830-8]。此外日常飲食顯著地影響肌酸酐的血清水平，特別是富含蛋白質(zhì)的飲食[PerroneRD，等C7z'".Cfew.(臨床化學(xué))1992;38:1933-53〗。血清和血漿肌酸酐測(cè)量不是測(cè)量腎小球?yàn)V過率的可靠的"黃金標(biāo)準(zhǔn)方法"。因此，使用靜脈內(nèi)注射放射性標(biāo)記物質(zhì)如Cr-51-EDTA或Tc-99m-DTPA，或者注射碘化劑如碘海醇，已經(jīng)獲得一些流行。這些方法是昂貴的、耗時(shí)的，并且注射是必需的…-并且通常重復(fù)地采樣血液。在Grubb等在ClinicalChemistry(臨床化學(xué))51:8，1420-1431中的"SimpleCystatinC-BasedPredictionEquationsforGlomerularFiltrationRateComparedwiththeModificationofDietinRenalDiseasePredictionEquationforAdultsandtheScwartzandtheCounahan-BarrattPredictionEquationsforChildren(單純基于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的腎小球?yàn)V過率預(yù)測(cè)方程與用于成年人的腎病預(yù)測(cè)方程和用于兒童的Scwartz和Counahan-Barratt預(yù)測(cè)方程中的飲食改進(jìn)的比較)"的出版物中，證明血液中的單純抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C測(cè)量可以替代測(cè)量腎小球?yàn)V過率的復(fù)雜方法。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C測(cè)量最初使用經(jīng)典的生物化學(xué)方法，但是不久轉(zhuǎn)向應(yīng)用比濁和濁度免疫測(cè)定。埃德-白令公司(Dade-BehringCompany)開創(chuàng)了比濁法測(cè)量方法。還參見Coll,E等.Am.J.KidneyDisease(美國(guó)腎病雜志)2000;36,2934。比濁法是非?？煽康?。比濁法的缺點(diǎn)在于，與基于光透射的自動(dòng)分光光度計(jì)相比，儀器本身具有相當(dāng)?shù)偷奶幚硭俣?。由埃?白令公司(Dade-BehringCompany)生產(chǎn)的比濁計(jì)，典型地BNII比濁計(jì)和ProSpec比濁計(jì)，以及Beckman儀器，已經(jīng)獲得了大量的市場(chǎng)暢銷度，但是廣泛性比基于透射測(cè)量的儀器低得多。比濁計(jì)還具有比基于透射測(cè)量的大型自動(dòng)化儀器低得多的樣品通量。H.Stone等在文獻(xiàn)"Analyticalperformanceofaparticle-enhancednephelometricimmunoassayforserumCystatinCusingrateanalysis(j吏用速率分析的血清抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的顆粒-增強(qiáng)的比濁計(jì)免疫測(cè)定的分析性能)"，ClinicalChemistry(臨床化學(xué))巻8,第1482-85頁(yè)，2001，描述了速率比濁方法。然而，比濁計(jì)儀器具有對(duì)于大量樣品的有限的容量，并且比濁計(jì)儀器的數(shù)目是有限的。因此，存在轉(zhuǎn)向吸光度分光光度計(jì)-均相的儀器的需要，原因在于這樣的儀器更豐富，并且具有更高的容量。丹麥DakoCytomation己經(jīng)開創(chuàng)了比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定的領(lǐng)域?，F(xiàn)有技術(shù)在下列文獻(xiàn)中描述"CystatinC-Themarkerofchoiceforrenalflmctiontesting(抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C-腎功能檢測(cè)選擇的標(biāo)記)"，C.Schmidt,EuropeanClinicalLaboratory(歐洲臨床實(shí)驗(yàn)室)，2004年2月10日；"NewimprovedautomatedparticleenhancedturbidimetricimmunoassayforquantitativedeterminationofhumanCystatinCinserumandplasma(定量確定血清和血漿中人抑半胱氮酸蛋白酶蛋白C的新改進(jìn)的自動(dòng)化顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測(cè)定)"，C.Schmidt,C.Kj0ller和KGrankjaer，2005年7月從DakoCytomationAS網(wǎng)址下載的介紹(通過引用結(jié)合)。然而，比濁測(cè)量受到樣品中濁度的干擾，如在文獻(xiàn)"Turbidityinimmunoturbidimetricassays(免疫濁度法測(cè)定中的濁度)，，，Dahr等，Ann.Clin.Biochem.(臨床生物化學(xué)年刊)巻27,第509頁(yè)，1990。在第29屆臨床化學(xué)北歐會(huì)議上，Malmo,瑞典，2004年4月24-27日，A.Grubb闡述了在血清和血漿樣品中三酰甘油對(duì)抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C測(cè)量的結(jié)果的干擾的結(jié)果。因此，仍然存在對(duì)于改進(jìn)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定的需要。均相免疫測(cè)定系統(tǒng)的備選方案是基于分離的非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)。非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)特征在于在進(jìn)行所述測(cè)定過程中進(jìn)行洗滌的分離步驟。這些系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于，通過洗滌的方式，它們?nèi)コ魏胃蓴_物質(zhì)。此外，它允許洗去未結(jié)合的抗體和未結(jié)合的酶或熒光或有色的或其它發(fā)出信號(hào)的部分。由于待測(cè)量的物質(zhì)…-下文叫作分析物…-不一定與標(biāo)記的類似物競(jìng)爭(zhēng)與所述抗體的結(jié)合，所以，這些方法通常是非競(jìng)爭(zhēng)性的。這一方面，以及洗滌步驟的應(yīng)用，使得可以使用過量的固定的抗體和標(biāo)記的抗體，表現(xiàn)出高靈敏度和通常高水平的精確性，特別是如果使用高質(zhì)量的抗體時(shí)。存在許多關(guān)于固相和其它非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)的教科書。大的自動(dòng)化系統(tǒng)可以商購(gòu)。美國(guó)Abbott診斷分公司(AbbottDiagnosticDivisionUS)出售用于ImX,AxSYM及其它自動(dòng)非均相免疫測(cè)定儀器的試劑；德國(guó)的羅氏診斷(RocheDiagnostics)出售用于Elecsys和其它非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)的試劑；并且存在許多非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)和試劑的其它供應(yīng)商。仍然非常受歡迎的非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)是所謂的微量滴定免疫測(cè)定系統(tǒng)。這些系統(tǒng)是緩慢的，但是可靠而廉價(jià)的。通用的免疫測(cè)定文獻(xiàn)給出許多關(guān)于這些系統(tǒng)的信息，其是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。非均相免疫測(cè)定系統(tǒng)的缺點(diǎn)是缺少對(duì)于每個(gè)時(shí)間單位，即每小時(shí)運(yùn)行時(shí)間的大量測(cè)定的容量。所述方法包括分離和洗滌步驟，盡管是自動(dòng)化的，但是其占有儀器的運(yùn)行時(shí)間。此外，由于包括固相，通常使用專門的裝置或固相，其具有某些生產(chǎn)成本，即使在大量生產(chǎn)時(shí)。近年來，由于不斷增長(zhǎng)的運(yùn)行的檢測(cè)的數(shù)量，高通量和結(jié)果產(chǎn)生速率已經(jīng)變得越來越重要。存在需要將來自非均相，通常是基于固相的免疫測(cè)定技術(shù)的測(cè)定轉(zhuǎn)移到均相免疫測(cè)定系統(tǒng)。均相免疫測(cè)定系統(tǒng)在構(gòu)造上是簡(jiǎn)單的，并且具有更高的通量容量。將試劑混合，溫育，并且在溫育過程中或溫育之后進(jìn)行測(cè)量。使用終點(diǎn)信號(hào)或在不同時(shí)間點(diǎn)之間的信號(hào)差異或連續(xù)的動(dòng)力學(xué)測(cè)量。信號(hào)可以是熒光、顏色或不透明性(濁度)測(cè)量。特別地，用于測(cè)量顏色和/或不透明性/濁度的大型自動(dòng)化儀器已經(jīng)非常成功了。日本的日立公司(HitachiCompany)與羅氏一起工作開創(chuàng)了這種大規(guī)模的自動(dòng)化，而且許多其它的供應(yīng)商包括奧林巴斯(Olympus)和拜爾(Bayer)供應(yīng)這樣的儀器和試劑。這些儀器是自動(dòng)化的多孔分光光度計(jì)，其在不同波長(zhǎng)和在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量光通過樣品與試劑的混合物的透射。既然比濁抑半胱氦酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定在這樣的均相高容量?jī)x器上運(yùn)行，這是為什么需要高質(zhì)量的比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C測(cè)定的另一個(gè)原因。大部分均相免疫測(cè)定系統(tǒng)是基于將樣品與試劑溶液混合，所述試劑溶液包括充分控制濃度的標(biāo)記的分析物或分析物類似物，和對(duì)所述分析物具有特異性親和力的抗體。樣品中的分析物分子與標(biāo)記的分析物或分析物類似物競(jìng)爭(zhēng)，并且產(chǎn)生信號(hào)。大量的免疫測(cè)定文獻(xiàn)教導(dǎo)使用不同的標(biāo)記和類似物。這里應(yīng)該注意到--迄今為止----用于產(chǎn)生有色信號(hào)的高分子量的分析物(分子量大于4000)的均相免疫測(cè)定方法已經(jīng)存在有限的成功。(使用熒光技術(shù)，如鄰近測(cè)定(proximityassays),已有成功，但是還缺乏許多可用的高通量的自動(dòng)化熒光計(jì)，并且因此這些技術(shù)不作為本發(fā)明的目的)。來自Syva的EMIT技術(shù)和來自Microgenics的CDEIA技術(shù)(這兩個(gè)公司都位于加利福尼亞)己經(jīng)成功地在低分子量分析物的均相免疫測(cè)定中使用了有色信號(hào)。對(duì)于高分子量的分析物，顆粒增強(qiáng)的比濁測(cè)量已經(jīng)成為用于自動(dòng)化多孔分光光度計(jì)的最成功的技術(shù)，所述自動(dòng)化多孔分光光度計(jì)測(cè)量光通過樣品與試劑的混合物的透射。因此，比濁法優(yōu)選用于更高分子量的分析物。比濁法的一般描述在許多免疫測(cè)定教科書中找到。為什么抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的高精確度測(cè)量是必需的？從生物學(xué)觀點(diǎn)看來，關(guān)于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和肌酸酐的生物學(xué)的參考文獻(xiàn)，以及上文引用的變化分析(meta-analysis)，指出使用抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而不是肌酸酐來監(jiān)測(cè)和診斷降低的腎小球?yàn)V過率的方向。然而，盡管生物學(xué)論點(diǎn)支持使用抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，但是只有當(dāng)所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C分析的準(zhǔn)確性和精確性是良好時(shí)生物學(xué)優(yōu)勢(shì)才是重要的。肌酸酐測(cè)量的準(zhǔn)確性和精確性是極好的，并且如果所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定方法的準(zhǔn)確性或精確性太低，那么容易失去分析抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而不是分析肌酸酐的醫(yī)學(xué)優(yōu)點(diǎn)。Newman&al,KidneyInt(腎內(nèi)科).巻47(1995)，第312-318頁(yè)，教導(dǎo)一種使用與兔抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫球蛋白級(jí)分共價(jià)偶聯(lián)的77nm(包被前)顆粒的最佳測(cè)定。他們沒有教導(dǎo)使用親和純化的抗體，且他們只字未提他們使用的免疫球蛋白級(jí)分中結(jié)合抗體的濃度。他們教導(dǎo)5-30%抗體重量/顆粒重量，最佳為5%，然而只字未提免疫球蛋白級(jí)分中對(duì)關(guān)于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有親和性的抗體級(jí)分。典型地，良好的常規(guī)抗血清包括在免疫球蛋白級(jí)分中的總抗體5-15%的活性抗體，這應(yīng)該意味著0.25-0.75wt,。/。的活性抗體/顆粒重量。這非常低，這可能是Newman等為什么必須一路降至340nm來獲得良好的信號(hào)的原因。這也可能是他們觀察到背景信號(hào)非常高的原因。Newman等在表1中指出稀釋顆粒(未說明多少)以在0，74cm光路長(zhǎng)度提供0.7的起始吸光度，這仍然非常高(超過最經(jīng)常使用的在lcm光路長(zhǎng)度下的0.9)，并且因此在測(cè)定中將導(dǎo)致非常高的背景。這可能是Newman等的方法未被商業(yè)化或用于臨床應(yīng)用的主要原因，且它教導(dǎo)在抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測(cè)定中不要使用低波長(zhǎng)。因此市場(chǎng)上關(guān)于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定的所有商業(yè)化產(chǎn)品都使用高于500nm的波長(zhǎng)。本發(fā)明要解決的一個(gè)問題是提供一種免疫-比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定，如果與相應(yīng)的可商購(gòu)的比濁相比，其具有提高的準(zhǔn)確性和/或精確性和/或更少的來自檢測(cè)樣品中的脂質(zhì)和血紅蛋白的干擾。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的濁度測(cè)量的現(xiàn)有技術(shù)的另一個(gè)缺點(diǎn)是濁度變化的低速率，其導(dǎo)致長(zhǎng)久的測(cè)定時(shí)間和/或高的不精確性。因此，本發(fā)明要解決的另一個(gè)問題是提供更快的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C比濁測(cè)量。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示利用來自RocheDiagnostics(羅氏診斷)的日立917儀測(cè)量，在將免疫顆粒加入到反應(yīng)混合物中后，濁度/吸光度對(duì)于不同波長(zhǎng)值，在不同時(shí)間點(diǎn)的變化。在450nm處觀察到急劇起始吸光度增加。圖2顯示利用來自RocheDiagnostics(羅氏診斷)的日立917儀，對(duì)于反應(yīng)開始后5分鐘時(shí)測(cè)量的不同波長(zhǎng)觀察到的濁度/吸光度變化。圖3a顯示關(guān)于在最后混合步驟(即反應(yīng)開始)后0，1,2，3,4和5分鐘時(shí)獲得的測(cè)定樣品在340至600nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度光譜。上圖顯示340nm處的指示線且下圖是430nm處的指示線。圖3b顯示在430nm處測(cè)量混合后一段320nm觀察到的吸光度變化的實(shí)例。圖4顯示在日立917儀中，在混合所有樣品后15-70秒的一段時(shí)間內(nèi)測(cè)量的不同波長(zhǎng)值下的吸光度變化(以毫吸光度單位(mABS)表示)/分鐘。發(fā)明概述令人吃驚地，上述與現(xiàn)有技術(shù)用于測(cè)量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定相關(guān)的問題，可以通過如在權(quán)利要求中定義的并且在說明書的隨后部分中更詳細(xì)闡釋的比濁法而解決。本發(fā)明的所述方法特別地利用與特定測(cè)量條件組合的改進(jìn)的納米顆粒-免疫偶聯(lián)物，其允許在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，如特別地，在不同的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度、不同的測(cè)量波長(zhǎng)、不同的反應(yīng)時(shí)間和不同的溫度下，更快速和/或更靈敏和/或更可靠地測(cè)量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)從后附的實(shí)驗(yàn)中顯而易見。通過細(xì)心地調(diào)整免疫顆粒，測(cè)量條件和任選地檢測(cè)試劑，可以觀察到令人吃驚地更強(qiáng)和更快的比濁信號(hào)，并且由此可以減小干擾，并且可以提高線性，而不失去準(zhǔn)確性。此外可以減少測(cè)定時(shí)間。下面將描述本發(fā)明的最佳模式，但是用于制備反應(yīng)混合物和用于進(jìn)行所述測(cè)量的其它試劑和步驟順序以及時(shí)間也可以用于獲得這種令人吃驚的結(jié)果。存在一些納米顆粒的供應(yīng)商，例如美國(guó)Bangs實(shí)驗(yàn)公司(BangsLaboratoriesInc)和法國(guó)默克S.A.(MerckS.A.,France)。將抗體偶聯(lián)到納米顆粒上的偶聯(lián)服務(wù)的許多供應(yīng)商可以在互聯(lián)網(wǎng)上找到。丹麥DakoCytomationAS提供偶聯(lián)到抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的納米顆粒，并且它們由本發(fā)明人檢測(cè)，而不管是否實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。然而，所述現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品證明是不成功的。本發(fā)明人觀察到，i.a.,顆粒大小必須仔細(xì)平衡。大顆粒產(chǎn)生良好的信號(hào)，然而，背景高，并且結(jié)合能力低，以致必須加入大量的顆粒，產(chǎn)生甚至更高的背景濁度。先前的測(cè)定供應(yīng)商，如DakoCytomationAS,產(chǎn)品號(hào)LX002/EFG/CS/25.10.04,S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04，沒有獲得良好的比濁信號(hào)。另外，意外地觀察到在檢測(cè)波長(zhǎng)低于500nm且高于340nm，即不在現(xiàn)有技術(shù)建議的波長(zhǎng)范圍內(nèi)時(shí)，可以觀察到吸光度的出人意料的高凈變。通用術(shù)語的定義當(dāng)用于按照本發(fā)明的測(cè)定方法中時(shí)，"體液樣品"是來源于哺乳動(dòng)物、特別是人的樣品，并且其含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，特別是人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C?？梢允褂萌魏魏幸职腚装彼岬鞍酌傅鞍證的液體樣品。要按照本發(fā)明測(cè)定的所述樣品可以是任何含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的生物液體或組織提取物，并且可以在測(cè)定之前預(yù)先處理。適當(dāng)?shù)臉悠返膶?shí)例是血液，血液級(jí)分，如血清和血漿，以及預(yù)處理的血液，如EDTA-血液，或EDTA-血漿，檸檬酸鹽-血漿，肝素血漿，或尿樣。最初獲得的樣品或其級(jí)分可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步改良，例如，通過分級(jí)或稀釋?？梢赃M(jìn)行分級(jí)，以去除可能干擾測(cè)定的組分。為了調(diào)整組分如分析物的濃度，可以通過將初始樣品或級(jí)分與適當(dāng)?shù)臉悠芬后w，如適當(dāng)?shù)木彌_液混合而進(jìn)行稀釋。這樣改良的樣品作為"來源于"從哺乳動(dòng)物的機(jī)體收集或分離的初始體液樣品的實(shí)例。按照本發(fā)明要測(cè)定的"分析物"是抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，特別是人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其由健康的或患病個(gè)體的機(jī)體形成。盡管不是必需的，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的衍生物或天然抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C衍生物的混合物也可能用作分析物。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C衍生物的非限制性實(shí)例是攜帶適當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)標(biāo)記，例如放射性、金屬或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C化合物。在獲得分析物(本文是指樣品中存在的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C)的量或濃度的絕對(duì)值的意義上，以及獲得指示分析物在樣品中的水平的指數(shù)、比率、百分?jǐn)?shù)、視覺或其它值的意義上，"評(píng)估(Assessing)"或"評(píng)估(assessment)"意欲包括定量和定性確定。評(píng)估可以是直接的或間接的，并且實(shí)際上檢測(cè)到的化學(xué)種類當(dāng)然不需要是分析物本身，而是例如可以是其衍生物。與非均相免疫測(cè)定相反，"均相免疫測(cè)定"在構(gòu)造上更簡(jiǎn)單，并且具有更高的通量容量。特別地，均相測(cè)定不包括以分離步驟形式的樣品的預(yù)處理步驟，例如，通過將樣品應(yīng)用到固體基質(zhì)如層析柱，塑料濾器，管、孔中和珠上的塑料表面上，在測(cè)定過程中清洗該基質(zhì)并且將分析物從初始復(fù)合物樣品的初始組分的多個(gè)部分中分離出來，所述程序?qū)е路蔷嗝庖邷y(cè)定中的長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間和多分析儀裝置的低容量。對(duì)于均相測(cè)定，將樣品和試劑混合，溫育，并且在溫育過程中或溫育之后，進(jìn)行測(cè)量。使用終點(diǎn)信號(hào)，或在不同時(shí)間點(diǎn)之間的信號(hào)差異，或連續(xù)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定。"顆粒增強(qiáng)的"比濁測(cè)量或免疫測(cè)定是基于與按照本發(fā)明所用的納米顆?；蚣{米顆粒-免疫偶聯(lián)物相關(guān)的"光散射性質(zhì)"。這樣的納米顆粒通常大約是球形的，優(yōu)選地具有狹窄的大小分布。所述顆粒的大小通常通過它們的平均直徑表示。按照光散射的公知定律，所述光散射性質(zhì)可以受到顆粒大小、和/或所述顆粒的折射率與介質(zhì)的折射率的比率的影響。弱的光散射性質(zhì)可以由小的顆粒大小、和/或所述顆粒的折射率與介質(zhì)的折射率的低比率導(dǎo)致(還參見光散射的Rayleigh's定律)。納米顆粒的大小和/或折射率的比率是這樣的，以致它們可以在檢測(cè)凝聚的納米顆粒-免疫偶聯(lián)物所用的波長(zhǎng)處引起光散射。通常選擇所述大小以小于所述檢測(cè)波長(zhǎng)。當(dāng)按照本發(fā)明用于測(cè)量樣品的濁度變化時(shí)，"檢測(cè)波長(zhǎng)"通常從約340nm以上到約500nm以下，優(yōu)選地從350,360或370nm到約480，490或499nm，且特別是從約390到470nm，或從400到460nm，或從410到450nm，如例如約415,420,425,430,435,440，或445nm。本發(fā)明的分析方法的"準(zhǔn)確性"是與通過甚至更可靠的參考方法確定的濃度相比，本發(fā)明的分析方法準(zhǔn)確確定樣品中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的濃度的能力。本發(fā)明的分析方法的"精確性"，是當(dāng)重復(fù)確定樣品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的濃度時(shí)，結(jié)果的變化。按照本發(fā)明的測(cè)定的"穩(wěn)定性(robustness)"是所述方法耐受干擾物質(zhì)和測(cè)定條件變化而不影響抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度測(cè)定的結(jié)果值的能力。當(dāng)用于本發(fā)明的上下文中時(shí)，"惰性蛋白"是不干擾本發(fā)明的測(cè)定方法的任何來源(例如，人或非人哺乳動(dòng)物、微生物)的蛋白；特別地，它應(yīng)該對(duì)于待分析的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和/或?qū)τ谠诒景l(fā)明的測(cè)定方法中所用的抗體基本上沒有或沒有可檢測(cè)的親和力。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C"結(jié)合"抗體是識(shí)別人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗原決定簇并與之特異性或非特異性結(jié)合的抗體。除非另外指明，本申請(qǐng)中指明的抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的比例與所述"結(jié)合"抗體有關(guān)。發(fā)明詳述a)本發(fā)明的方面本發(fā)明的第一方面涉及用于評(píng)估人體液樣品或來源于其的樣品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測(cè)定法，其包括以下步驟(1)通過將所述樣品或其稀釋物與包含適合于比濁測(cè)量的納米顆粒的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物(或納米顆粒-免疫偶聯(lián)物)接觸而形成測(cè)定混合物，其中所述納米顆粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體或其抗原結(jié)合片段包被，以結(jié)合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c，其中所述包被的納米顆粒具有至少40nm范圍內(nèi)的中數(shù)直徑，如例如至少45，50,55或58nm，優(yōu)選地大于58nm，并且(2)通過確定適當(dāng)光參數(shù)，如其吸光度的變化，在340nm以上且500nm以下的范圍內(nèi)的一、二或三，優(yōu)選一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)處，通過測(cè)量所述混合物的濁度的變化而評(píng)估所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量。"吸光度變化"可以表述為兩個(gè)(初始和最終)測(cè)量值(例如，作為ABS值)之間的絕對(duì)差或表達(dá)吸光度變化/時(shí)間(例如，作為ABS/時(shí)間值)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。優(yōu)選地，(a)通過混合時(shí)的直接記錄，或更優(yōu)選(b)通過混合后不久記錄，與對(duì)初始增加吸光度的向后外推組合，或特別地，(c)通過在混合樣品和試劑后小于1分鐘內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的吸光度差別，通過測(cè)量吸光度的初始增加速率來確定樣品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，吸光度的初始變化速率，且具體地，以至少一個(gè)，如例如一、二、三或四個(gè)，但優(yōu)選一個(gè)，約5-300秒的時(shí)間間隔確定，所述時(shí)間間隔從形成所述測(cè)定混合物后立即或不久后開始。"不久后"意指將所述測(cè)試成分混合在一起后幾秒，如例如1-40或2-30秒，具體地5，10,15,20或25秒。對(duì)于測(cè)量?jī)?yōu)選的時(shí)間間隔具有10-280,50-250,70-220,80-210,100-200,110-190，或125-185秒，如130,140,150，160或170秒的持續(xù)時(shí)間，并采用形成所述測(cè)定混合物后l-40或2-30秒，具體地，5,10，15，20或25秒。合適的時(shí)間間隔的實(shí)例是將所有測(cè)試成分混合在一起后10-290,15-200,200-180或25-150秒。優(yōu)選地，所述抗體包括針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆非人、非嚙齒動(dòng)物抗體；特別地，所述多克隆抗體包括針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的禽類抗體。所述禽類抗體可以獲自禽類血清，優(yōu)選地，然而，它們來源于蛋黃，即它們是蛋黃級(jí)分。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的親和純化，獲得了至少25wt.-。/。的所述多克隆抗體或其片段。通過親和純化，與人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C結(jié)合的那些抗體的比例增加。另外，可以通過親和純化進(jìn)一步富集以比從所述混合物中去除的那些抗體更高的親和力(或抗體親抗原性(avidity))與人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C結(jié)合的抗體。例如，按照本發(fā)明使用的適當(dāng)?shù)目贵w可以對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有親和力或抗體親抗原性，其與通過禽類抗體的親和純化獲得的禽類(例如，多克隆)抗體的親和力或抗體親抗原性相當(dāng)(或基本上相同)，所述禽類抗體的親和純化通過將禽類抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗血清與固定在固相上的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C結(jié)合，并且優(yōu)選地，例如，在用磷酸緩沖鹽水洗滌后，用檸檬酸鹽緩沖液洗脫結(jié)合的抗體，所述檸檬酸鹽緩沖液的摩爾濃度在0.05M到0.2M，或0.08M到0.12M范圍，特別是約0.1M;并且pH在約3到3.5，或3.1至(j3.3范圍，特別是約3.2(例如在后續(xù)實(shí)驗(yàn)部分中更詳細(xì)地解釋)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包括(a)與人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的單一表位結(jié)合的單克隆抗體，或(b)—組兩個(gè)或多個(gè)種類的單克隆抗體，其中每種單克隆抗體結(jié)合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位，或者兩種或多種以不同的結(jié)合強(qiáng)度(親和力或抗體親抗原性)結(jié)合相同的表位。所述單克隆抗體是人或非人(例如，來源于嚙齒動(dòng)物、綿羊、山羊、鳥或兔)來源的。當(dāng)按照本發(fā)明使用時(shí)，所述包被的納米顆粒優(yōu)選地具有大于58nm的平均直徑，特別是在59-160，60-140，70-120,75-110，80-105,或90-95nm范圍內(nèi)的平均直徑。優(yōu)選地，它們用一層抗體包被。特別地，所述層可以認(rèn)為是具有約5nm的近似厚度的單層。所述層可以是"完全的"(用抗體飽和的顆粒)，或者，更優(yōu)選地是"不完全的"(即，使用比所述顆粒提供的結(jié)合容量(bindingcapacity)少的抗體)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述包被的納米顆粒用約5-35%，特別地10-30%或15-25%的結(jié)合抗體/單位總重量的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物(納米顆粒-抗體偶聯(lián)物的總重量)不完全包被。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒用抗體和惰性、優(yōu)選親水的蛋白的混合物包被。例如，結(jié)合到所述納米顆粒表面上的總蛋白的20-90%，并且更優(yōu)選地35-80%，并且甚至更優(yōu)選地40-70%由抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體組成。這樣的顆粒優(yōu)選地以按照所述未包被的顆粒的結(jié)合容量低于理論上可附著到所述顆粒上的抗體的量的量攜帶抗體。同時(shí)，所述顆粒表面上不被抗體分子覆蓋的區(qū)域用惰性的、優(yōu)選親水性的蛋日'啦和。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述初始的、未包被的納米顆?；旧嫌赡z乳、聚苯乙烯、聚氯乙烯、環(huán)氧樹脂、聚偏l，l-二氯乙烯、聚-ct-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它們相應(yīng)的共聚物制成。其它適當(dāng)?shù)念w粒材料在本領(lǐng)域中是可用的，并且由本發(fā)明的教導(dǎo)所指導(dǎo)，技術(shù)熟練的讀者應(yīng)該能夠做出適當(dāng)?shù)倪x擇。按照本申請(qǐng)方法的另一個(gè)實(shí)施方案，通過在所述測(cè)定混合物在350-499nm范圍的波長(zhǎng)，優(yōu)選地并且在10-50。C范圍內(nèi)的溫度，并且優(yōu)選地確定開始反應(yīng)"不久后"在如上定義的預(yù)定"時(shí)間間隔"內(nèi)吸光度的初始變化，測(cè)量濁度變化。本發(fā)明還提供用于測(cè)量在體液樣品或來源于體液的樣品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定方法，其特征在于，通過將含有所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的液體樣品，或來源于含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的液體的樣品，或含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的稀釋物的樣品，與納米顆粒-結(jié)合的多克隆或單克隆抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體或抗體片段接觸而形成測(cè)定混合物，以結(jié)合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，并且通過測(cè)量所述混合物濁度的變化而評(píng)估抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量，并且所述濁度進(jìn)一步表征為所述混合物在給定波長(zhǎng)下的吸光度變化，條件是在用特定最小大小的包被的納米顆粒形成所述混合物后，將所述混合物在給定的溫度保持給定的時(shí)間段，如上文所示和在實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)更詳細(xì)解釋?；诒疚闹械奶囟ń虒?dǎo)，包括附圖和表中公開地，技術(shù)人員應(yīng)該能夠計(jì)算在不同時(shí)間、溫度和/或波長(zhǎng)下按照本發(fā)明可觀察到的吸光度變化的其他數(shù)值。通過舉例的方式，可以獲得下述值26°C，時(shí)間間隔38-208秒，中數(shù)直徑92nm;波長(zhǎng)405nm:0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升0，83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升變化率7,2mABS單位/分鐘變化率14,1mABS單位/分鐘變化率25,4mABS單位/分鐘變化率56，5mABS單位/分鐘變化率107，3mABS單位/分鐘變化率199，1mABS單位/分鐘26°C，時(shí)間間隔38-208秒，中數(shù)直徑92nm;波長(zhǎng)380nm:0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升0,83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升2，77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升4，46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升變化率9,7mABS單位/分鐘變化率15，9mABS單位/分鐘變化率29,14mABS單位/分鐘變化率62,5mABS單位/分鐘變化率108，7mABS單位/分鐘變化率192mABS單位/分鐘按照本發(fā)明的另一種優(yōu)選的方法其特征在于---當(dāng)構(gòu)建針對(duì)濁度測(cè)定法的相關(guān)性曲線時(shí)-…對(duì)于通過濁度測(cè)定法獲得的0mg/1抑半胱氮酸蛋白酶蛋白C的相對(duì)應(yīng)的值，對(duì)于所述比濁法獲得小于0.15mg/1,優(yōu)選地小于0.1，并且甚至更優(yōu)選地小于0.05mg/1的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。按照本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法其特征在于…-當(dāng)構(gòu)建針對(duì)非均相免疫測(cè)定方法的相關(guān)性曲線時(shí)…-對(duì)于0mg/1抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的相對(duì)應(yīng)的值，獲得小于0.25mg/1,優(yōu)選地小于0.15，并且甚至更優(yōu)選地小于0.5mg/1的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。按照本發(fā)明的另一種優(yōu)選的方法其特征在于，對(duì)于在1.2mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1水平的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的測(cè)量值，具有來自所述檢測(cè)的樣品中的15mmol/1三酰甘油的小于6%，優(yōu)選地小于4%，或者更優(yōu)選地小于2%的干涉。按照本發(fā)明的另一種優(yōu)選的方法其特征在于，在1.32-7.5mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，具有低于5%，優(yōu)選地低于4%，或更優(yōu)選地低于3%的線性偏差，和/或在0.75-1.32mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1的測(cè)量范圍的測(cè)量區(qū)域內(nèi)，具有低于15%，優(yōu)選地低于11%，并且甚至更優(yōu)選地低于7%的線性偏差。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過率的方法，所述方法包括按照上文定義的方法進(jìn)行人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁評(píng)估。所述方法可以特別地應(yīng)用在腎功能障礙(如腎功能不全或腎衰竭)或與其相關(guān)的疾病或病況的診斷或治療過程中。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于實(shí)施上文定義的方法的試劑盒或者多個(gè)部分的試劑盒或試劑組，其包括(a)顆粒，其包含干燥或混懸形式的如上文定義的抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒，(b)干燥或溶解形式的測(cè)定緩沖液，和任選地，(c)校準(zhǔn)混合物和對(duì)照混合物，其每種以干燥或溶解的或混懸的形式存在。優(yōu)選地，所述顆粒和測(cè)定緩沖液以干燥或以混懸形式組合提供。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，在下文提供按照上文定義的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物以及更詳細(xì)的描述。本發(fā)明涉及這樣的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物在評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫測(cè)定中或者在評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過率的診斷方法中的應(yīng)用。最后，本發(fā)明涉及這樣的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物在評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫測(cè)定中或者在評(píng)估腎功能障礙如腎功能不全或衰竭的診斷方法中的應(yīng)用。b)抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的制備bl)多克隆抗體多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，諸如例如由Chase,M.W.,1967，.在"MethodsofImmunologyandImmunochemistry(免疫學(xué)和免疫化學(xué)方法)"中，Williams,A.等編，M.W.,第197-209頁(yè)，學(xué)院出版社(AcademicPress),紐約，中所述的那些。簡(jiǎn)言之，將適當(dāng)物種的動(dòng)物(例如，兔、山羊、或綿羊、或者，優(yōu)選地禽類物種，特別是家禽，如母雞)用在適當(dāng)?shù)淖魟┤绺ナ贤耆虿煌耆魟┲械募兓目乖貜?fù)免疫。在免疫后，將動(dòng)物放血，并且通過諸如例如硫酸銨或氯化銨沉淀、陰離子交換層析、免疫親和層析和/或親和層析的方法純化多克隆抗體。為了獲得充分的比濁信號(hào)，優(yōu)選高抗體親抗原性的抗體。由于多克隆抗體包括許多不同的抗體分子，所以不能計(jì)算親和力常數(shù)，然而，通過常規(guī)的多克隆抗體技術(shù)獲得高的抗體親抗原性和親和力。使用通過常規(guī)方法獲得的兔抗體，然而，使用綿羊抗體獲得甚至更好的結(jié)果。當(dāng)使用禽類抗體時(shí)，獲得甚至更好的結(jié)果。禽類抗體可以按照在LarssonA,BaaloewR-M,LindahlT,和ForsbergP-O在PoultryScience(家禽科學(xué))72:1807-1812，1993中所述的方法?？紤]在遺傳上與人更不同的禽類能夠產(chǎn)生具有比多克隆哺乳動(dòng)物抗體更高的抗體親抗原性的針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗體。多克隆禽類抗體通常從蛋黃中獲得(并且因此指定為IgYs)。然而，蛋黃含有大量的脂質(zhì)，使得它們的進(jìn)一步應(yīng)用成問題。IgY可以通過使用分步硫酸銨(例如25-40%)和聚乙二醇(PEG)沉淀而從蛋黃中分離。對(duì)于初始純化，還可以參考供應(yīng)商的用法說明而應(yīng)用也是商業(yè)的可從GallusImmunotchInc,卡雷，美國(guó)獲得的IgY純化試劑盒，或從Pierce,羅克福德,美國(guó)獲得的雞EggcdlentlgY純化試劑盒。此外，多克隆抗體的抗體親抗原性可以通過使用利用抗原親和純化方法，如按照從www.pie羅et,謹(jǐn)(2006年4月)下載并且通過引用結(jié)合的"AffinityPurificationofProteins(蛋白質(zhì)的親和純化)"中的教導(dǎo)而純化的抗體而進(jìn)一步提高。在下文進(jìn)一步描述親和純化。當(dāng)所用的抗體中有20%是抗原親和純化的時(shí)，特別觀察到提高的抗體親抗原性，當(dāng)所述抗體中有50%是抗原親和純化的時(shí)，觀察到甚至有更高的提高，并且當(dāng)所述抗體中有大于75%，如75-100%是通過抗原親和純化方法獲得的時(shí)，甚至提高更多。對(duì)于禽類多克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c抗體的親和純化，已經(jīng)制備了適當(dāng)?shù)娜艘职腚装彼岬鞍酌傅鞍譪親和柱。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將純化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c固定在適當(dāng)?shù)墓腆w支持物上，例如瓊脂糖或親和凝膠，其是活化的以將所述抗原共價(jià)連接到支持物上(例如，適當(dāng)?shù)幕罨墓腆w支持物可從Pierce,羅克福德，美國(guó)獲得)。然后，由所述攜帶抗原的樹脂而制備親和柱?？贵w的成功的親和純化取決于所述抗原上的相關(guān)表位向所述抗體的結(jié)合位點(diǎn)的有效呈遞。如果所述抗原是小的，并且通過多個(gè)化學(xué)鍵直接固定在固體支持物表面上，那么重要的表位可能被封閉或者空間位阻，而抑制有效的抗體結(jié)合。因此，最好使用獨(dú)特的官能團(tuán)(例如，在肽的單個(gè)末端半胱氨酸上的巰基)而固定抗原，并且最好使用其反應(yīng)基團(tuán)存在于幾個(gè)原子長(zhǎng)的間隔臂上的活化的支持物。對(duì)于更大的抗原，特別是具有多個(gè)固定位點(diǎn)的那些抗原，由于所述抗原本身作為支持基質(zhì)和表位之間的有效的間隔，所以所述間隔臂長(zhǎng)度不那么重要。由于每種方法的核心是對(duì)于其各自的抗原的抗體的親和力，所以在抗體的親和純化的典型的結(jié)合和洗脫條件之間通常存在很少的變化。由于抗體設(shè)計(jì)成在生理?xiàng)l件下識(shí)別并且緊密結(jié)合抗原，所以大部分的親和純化方法使用模擬生理pH和離子強(qiáng)度的結(jié)合條件。最常見的結(jié)合緩沖液是在pH7.2的磷酸緩沖鹽水(PBS)和Tris緩沖鹽水(TBS)以及1.5MNaCl(例如，預(yù)先混合的緩沖液包裝可從Pierce,羅克福德，美國(guó)獲得)。一旦所述抗體已經(jīng)結(jié)合到固定的抗原上，其余的結(jié)合緩沖液用來洗滌支持物上的未結(jié)合的物質(zhì)。為了將非特異性結(jié)合最小化，所述洗滌緩沖液可以包含其它的鹽或去污劑，以破壞任何弱的相互作用。特別地，通過改變緩沖液(例如，常見的洗脫緩沖液可從Pierce，羅克福德，美國(guó)獲得)的pH和/或離子強(qiáng)度而將純化的抗體從親和樹脂上洗脫下來?？贵w通常是耐受pH2.5-11.5范圍的彈性蛋白，具有最小的抗體親抗原性損失，并且迄今為止，這是最常見的洗脫策略。在一些情形中，抗體-抗原的相互作用沒有被pH變化有效破壞或者被pH損壞，這需要應(yīng)用備選策略。下面給出親和純化方法的實(shí)例步驟l:在每次使用之前，用IO個(gè)柱體積的下述順序的緩沖液洗滌柱(lml樹脂床)，以去除殘留的蛋白質(zhì)0.2M甘氨酸，pH2.810ml0.1MNaHCO3,pH8.5,0.5MNaCl10ml使用上述緩沖液重復(fù)循環(huán)兩次。然后將所述柱在含有被調(diào)整到0.5M的NaCl的TTBS緩沖液(0.3MNaCl,20mMTris/Cl，pH7.8，0.1%(v/v)吐溫-20和0.01%NaN3)中平衡。步驟2:向10ml等分試樣的粗制抗體制備物中，加入lmllOXTTBS和0.55ml4MNaCl。將混合物離心以去除任何沉淀。步驟3:通過將所述親和樹脂轉(zhuǎn)移到含有血清的管(15ml管)中，而分批吸附所述抗體。在冷室中溫育。備選地，可以使用低流速將血清施加到柱上。獲得人工收集的級(jí)分。收集流過柱的相(phase),并且使用低流速將其第二次重新施加。步驟4:用TTBS+NaCl至0.5M充分洗滌柱，直到A28。小于0.02。收集10ml洗滌的級(jí)分，并且檢驗(yàn)所述級(jí)分的A2S0。步驟5:使用含有0.02%NaTsb的0.2M甘氨酸，pH2.8洗脫抗體。使用1ml等分試樣的緩沖液進(jìn)行洗脫。將級(jí)分收集到含有50ml1MTris,pH8.5的1.5ml微量離心管中。這在蛋白洗脫下來之后立即中和酸性的洗脫緩沖液。收集至少10個(gè)級(jí)分。這通常足以去除所述抗體。使用適當(dāng)?shù)目瞻?即，lml甘氨酸緩沖液加50mllMTris)，讀取每個(gè)級(jí)分的A280。步驟6:將適當(dāng)?shù)募?jí)分合并。獲得合并物的A280，并且將抗體保存在4°C，或者考慮在存在50%甘油時(shí)以等分試樣冷凍(-70'C)。步驟7:通過用0.2M甘氨酸，pH2.8緩沖液，而后用TTBS，充分洗滌而洗滌柱。b2)單克隆抗體在顆粒-增強(qiáng)的比濁測(cè)定中，多克隆抗體通常比單克隆抗體更優(yōu)選。多克隆抗體固有地與抗原(或分析物)上的許多不同的表位反應(yīng)(與單克隆抗體相反)，并且因此，更容易在抗原分子自身之間，以及在抗原和固定抗體的顆粒之間產(chǎn)生交叉結(jié)合和網(wǎng)絡(luò)。相反，單克隆抗體通常只結(jié)合一種類型的表位，這使得其更難以形成交叉結(jié)合和網(wǎng)絡(luò)。然而，診斷行業(yè)通常優(yōu)選使用單克隆抗體，原因在于它們更容易標(biāo)準(zhǔn)化，并且更容易對(duì)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行質(zhì)量控制，特別是在許多年的產(chǎn)品壽命時(shí)間內(nèi)。因此，存在關(guān)于將單克隆抗體用于顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測(cè)定的良好的實(shí)例，特別是當(dāng)存在有利于單克隆抗體的使用的抗原性特征時(shí)。Eda等，在"DevdopmentofaNewMicroparticle-EnhancedTurbidimetricAssayforC-reactiveprotenWithSuperiorfeaturesinAnalyticalSensitivityandDynamicrange(在分析靈敏性和動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)具有優(yōu)良特征的C-反應(yīng)性蛋白的新的微粒-增強(qiáng)的比濁測(cè)定的發(fā)展)",J.Clin.Lab.Analysis(臨床實(shí)驗(yàn)室分析)，12:137-144(1998)中描述了使用兩種不同的單克隆抗體和兩種不同的微粒。由于CRP分子是相同亞基的五聚體…-并且因此攜帶五個(gè)所有表位的重復(fù)單位(PepysMB等，Adv.Immunol.(高級(jí)免疫學(xué))34:141-212(1983))，這使得使用單克隆抗體容易得多，所以CRP特別有利于使用單克隆。然而，此外，與單體和更小的蛋白如抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C一起，不同的單克隆抗體的混合物可以用于本發(fā)明的特別的實(shí)施方案中。不同的單克隆抗體的混合物，特別當(dāng)它們由具有針對(duì)抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的高親和力的許多不同的單克隆抗體組成時(shí)，將導(dǎo)致關(guān)于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定的本發(fā)明的良好的實(shí)施方案。單克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體還可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，例如由G,K6hler等,1975，Nature(自然)256,495,G.Galfre等，1981，Meth.Enzymol.(酶學(xué)方法)73，3-46,或R.Kennet,1980,在"Hybridomas:anewdimensioninbiologicalanalysis(雜交瘤生物學(xué)分析的新紀(jì)元)"中，R.Kennet等編,Plenum出版社，紐約和倫敦，中所述的那些。將來自免疫小鼠或大鼠的脾細(xì)胞或外周血細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，例如使用聚乙烯融合方法進(jìn)行。在融合后，將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，例如，在培養(yǎng)平板上，并且使用例如次黃嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)選擇方法進(jìn)行正確融合的細(xì)胞的選擇。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系通過如EIAs,RIAs或凝集測(cè)定方法鑒定。在鑒定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系后，將所述細(xì)胞重復(fù)亞克隆，例如通過有限稀釋的方法，以保證新生長(zhǎng)的細(xì)胞系來源于一個(gè)單一的細(xì)胞。b3)嵌合抗體嵌合的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體可以通過本領(lǐng)域公知的方法獲得，諸如由G.L.Boulianne等，1984,Nature(自然)312,643-645所述的方法獲得。所述方法可以概括描述如下。將來自于一種物種的單克隆抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)的DNA或其部分轉(zhuǎn)移到不同物種的另一種抗體的抗體構(gòu)架的DNA。將這種新的構(gòu)建體克隆到表達(dá)載體中，將其轉(zhuǎn)移到相對(duì)應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中以產(chǎn)生所述抗體。b4)重組抗體重組抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體可以通過本領(lǐng)域己知的方法不使用動(dòng)物載體而獲得，例如由G.Winter等，1991,Nature(自然)，349，293或J.S.Huston等，1988,Proc.NtLAcad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，85,5879所述的那些方法。那些方法包括下述步驟將編碼抗體或其片段的DNA(cDNA或合成的DNA)引入到宿主細(xì)胞中，例如，大腸桿菌(E.coli)，真菌，酵母菌，植物或真核細(xì)胞中，選擇具有需要的特異性和親和力的抗體，并且在相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所述抗體或其片段。b5)抗體片段任何物種的多克隆抗體、單克隆抗體(包括嵌合抗體和/或重組抗體)的Fab-,Fab'-,和F(ab')2-片段可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，諸如例如由A.Nissonoff等，1960,ArchBiochemBiophys(生物化學(xué)和生物物理學(xué)檔案)，89，230,或R.P.Porter,1959，BiochemJ(生物化學(xué)雜志)，73,119,或E.Harlow等，1988,在"Antibodies—ALaboratoryManual(抗體一實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))"，626-631，冷泉港出版社(ColdSpringHarbourPress),紐約，美國(guó)所述的那些方法。b6)選擇與人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有不同反應(yīng)性的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體當(dāng)使用單克隆抗體或其片段作為結(jié)合配偶體時(shí)，可以便利地進(jìn)行不同的、特別是高和低反應(yīng)性的抗體的選擇，其通過常規(guī)包被技術(shù)，將每種單克隆抗體分別地包被到相同材料和大小的納米顆粒上，而后以給定的比例，如1/1V/V，以排列的方式將納米顆粒試劑與分析物混合。在相同條件下生成納米顆粒試劑的校準(zhǔn)曲線之后，對(duì)于低濃度的分析物所得到的校準(zhǔn)曲線的斜率給出所述免疫結(jié)合配偶體的反應(yīng)性的第一指示。當(dāng)使用多克隆抗體作為結(jié)合配偶體時(shí)，可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行高和低反應(yīng)性多克隆抗體的制備，其通過將所述多克隆抗體引入到攜帶與凝膠基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的抗原性分析物的親和層析柱上而進(jìn)行。使用梯度洗脫緩沖液，低反應(yīng)性的多克隆抗體級(jí)分將最先從柱上洗脫下來，而后是具有遞增的更高的反應(yīng)性的級(jí)分(參見，S.Yamamoto等，1993,"VeterinaryImmunologyandImm畫pathology(獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理學(xué))"36，257-264，Elsevier科學(xué)出版社(ElsevierSciencePublishers)B.V.，Amsterdam)。然后，可以使用BIAcore儀器或者通過將它們獨(dú)立地包被到相同大小和材料的納米顆粒上并且生成相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，而檢驗(yàn)級(jí)分的反應(yīng)性?？贵w的選擇可以通過上文提及的將它們包被在納米顆粒上的方法進(jìn)行，而后檢測(cè)極限分析或確定其功能親和性，如上文所述。如果適當(dāng)?shù)脑?，關(guān)于它們對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的親和力/抗體親抗原性而不同的不同的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的混合物可以用于制備本發(fā)明的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物。適當(dāng)?shù)幕旌媳壤梢杂墒炀毜募夹g(shù)人員通過有限系列的實(shí)驗(yàn)而確定。適當(dāng)?shù)目谷艘职腚装彼岬鞍酌傅鞍證抗體還可以從不同的來源商購(gòu)。例如，芬蘭的HyTest提供一組識(shí)別所述抗原的不同表位的高親和力抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體。這些抗體以常規(guī)方法制備，其通過用從人尿純化的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫Balb/c小鼠，并且通過與雜交瘤細(xì)胞系Sp2/0融合而產(chǎn)生雜交瘤進(jìn)行。通過選擇的克隆產(chǎn)生的抗體通過蛋白質(zhì)A親和層析而純化。目前可從HyTest獲得下述mAbs:Cystl0,Cystl3,Cystl6，Cystl8，Cystl9,Cyst23，Cyst24，和Cyst28。其它商購(gòu)單或多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的供應(yīng)商為Fusion,北愛爾蘭;BioVendor，捷克共禾卩國(guó)，ABLocation,德國(guó)；高級(jí)Immunicemical(AdvancedImmunicemical)，美國(guó)；Abcam，英國(guó)；Axxora,英國(guó)；生物設(shè)計(jì)(Biodesign):美國(guó)；R&D系統(tǒng)，美國(guó)；AbDSerotec,挪威；策略生物解決方案(StrategicBiosolutions),美國(guó)。原則上，所述來源的所有抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體可以單獨(dú)或組合使用，以實(shí)施本發(fā)明。c)納米顆粒以及它們與抗體的偶聯(lián)物用于制備本發(fā)明的納米顆粒的物質(zhì)可以是適合產(chǎn)生并且實(shí)施顆粒-增強(qiáng)的光散射測(cè)定的任何天然的或合成的、無機(jī)的、有機(jī)的、非聚合物或聚合物物質(zhì)。這樣的物質(zhì)包括，例如；硒，碳，金；碳、硅或鍺的氮化物，例如Si3N4;鐵、鈦或硅的氧化物，例如Ti02或Si02;以及聚合材料，諸如例如，膠乳，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)，環(huán)氧樹脂，聚偏l,l-二氯乙烯，聚(a-萘基甲基丙烯酸酯)，聚(乙烯基萘(naphtalene))，或它們的共聚物，特別是苯乙烯和可共聚化的烯鍵式不飽和化合物的共聚物，例如苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的顆粒，以及由苯乙烯聚合的內(nèi)核和苯乙烯與可共聚化的烯鍵式不飽和的化合物共聚形成的外殼而組成的核-殼顆粒，如例如在美國(guó)專利號(hào)4,210,723中所述，也是適合的。適合于偶聯(lián)的聚合物顆?？梢再?gòu)自Bangs顆粒公司(BangsParticlesInc.)或界面動(dòng)力學(xué)公司(InterfacialDynamicsInc)，默克SA，法國(guó)或其它適當(dāng)?shù)膩碓?。所述顆粒可以按照許多方法活化，用于結(jié)合抗體，例如，這樣的偶聯(lián)化學(xué)的詳細(xì)的教導(dǎo)可以在TechNote205，Rev.003中，例如2002年3月，"共價(jià)偶聯(lián)(CovalentCoupling)"(通過引用結(jié)合)中找到，其可以從Bangs實(shí)驗(yàn)公司(BangsLaboratories,Inc)的網(wǎng)頁(yè)上下載。例如，偶聯(lián)可以通過在它們表面上攜帶羧基-、氨基-、羥基-、酰肼-或氯甲基基團(tuán)的顆粒的方式而實(shí)現(xiàn)。待偶聯(lián)的分子可以直接與這樣的基團(tuán)反應(yīng)，或者通過適當(dāng)?shù)慕宇^如例如碳二亞胺、戊二醛或溴化氰的方式反應(yīng)。按照本發(fā)明的顆粒的外殼優(yōu)選地必須包括對(duì)抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有高親和力的抗體，其與特定大小的納米顆粒核心組合，產(chǎn)生充分的比濁信號(hào)。典型地，包括蛋白物質(zhì)的外殼的納米顆粒在58和200nm之間，更優(yōu)選地在65和150nm之間，并且甚至更優(yōu)選地在80和135nm之間。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，未包被的顆粒的平均直徑為約80nm。使用這些顆粒，在包被之后，它們的直徑典型地為90-100nm。作為通用的法則，單層抗體約5nm厚，以致認(rèn)為這樣的顆粒攜帶單層抗體。當(dāng)所述偶聯(lián)的顆粒總干重的5-35°/。是由抗體組成時(shí)，這些顆粒將具有良好的性能，在所述偶聯(lián)的顆粒的總干重的10-30%由抗體組成時(shí)，所述顆粒具有更好的性能，并且當(dāng)所述偶聯(lián)的顆粒的總干重的15-25%是由抗體組成時(shí)，具有最佳性能。如果使用稍微更大的顆粒，這些最佳百分比值下降。通過舉例的方式，如果使用95nm的裸顆粒，如果包被的話，它們的中數(shù)直徑典型地終止在110nm。那么，相對(duì)應(yīng)的百分比為4-32°/。，8-26%，并且對(duì)于最佳性能，相對(duì)應(yīng)的百分比為12-22%(由抗體組成的偶聯(lián)顆粒的總干重百分?jǐn)?shù))。然而，使用這些稍微更大的顆粒，在所述測(cè)定中必須使用更多的顆粒(是更重的顆粒的意思)，以具有足夠的結(jié)合容量來產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線，而在更高抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的濃度，沒有所述曲線的平化(測(cè)定校準(zhǔn)曲線必須具有達(dá)到超過8昭抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C&l樣品的良好的動(dòng)力學(xué)范圍)，這導(dǎo)致高得多的吸收背景(更大的顆粒和更多的顆粒)，和更低的信噪比。在另一方面，更小的顆粒將在包被的免疫顆粒中具有更高的抗體百分?jǐn)?shù)最適值。例如，如果使用70nm大小的未包被的顆粒，那么包被的顆粒的中數(shù)直徑典型地為80nm，并且偶聯(lián)顆粒的總干重的18-30%抗體的比例將導(dǎo)致最佳百分?jǐn)?shù)，并且次最佳的是12-36%的比例，并且甚至更次最佳的是4-42%的抗體的比例。然而，使用這些稍微更小的顆粒，在所述測(cè)定中必須使用更少的顆粒(是更少重量的顆粒的意思)，以產(chǎn)生在更低的濃度，gp，低于l嗎抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/(al樣品，足夠陡峭的校準(zhǔn)曲線，并且信號(hào)將更低，并且還更容易受背景噪音的影響?；谏鲜鲫U釋，在本發(fā)明的教導(dǎo)的指導(dǎo)下，技術(shù)熟練的讀者應(yīng)該能夠提供用于不同的測(cè)定條件的最佳免疫顆粒制備物。將抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體包被到納米顆粒上可以按照滿足所用的材料的特性的本領(lǐng)域公知的方法而吸附性地或共價(jià)性地實(shí)施。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，一種或多種親水惰性蛋白質(zhì)與抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的混合物應(yīng)該存在于所述抗體與所述納米顆粒的偶聯(lián)/結(jié)合過程中。本發(fā)明人已經(jīng)意外地觀察到，當(dāng)將抗體與具有接近偶聯(lián)pH的pi值的親水蛋白一起與所述顆粒偶聯(lián)時(shí)，獲得使用具有高結(jié)合容量的親水性顆粒的最佳結(jié)果。當(dāng)在偶聯(lián)過程中存在牛運(yùn)鐵蛋白和白蛋白時(shí)，獲得最好的結(jié)果。然而，在偶聯(lián)過程中，其它的惰性蛋白也可以與抗體混合。這樣的親水性、惰性蛋白的非限制性實(shí)例是AiW(limpet)血藍(lán)蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對(duì)于所述抗體和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C沒有任何親和力。在偶聯(lián)過程中，條件為，或者應(yīng)該為，或者如果必要，應(yīng)該采用這樣的條件，以致所述抗體比所述惰性蛋白與納米顆粒核心材料更具反應(yīng)性，以致它們將或多或少地與所述核心定量結(jié)合。所述納米顆粒表面的殘余的反應(yīng)性部分將由所述惰性蛋白封閉。本發(fā)明人觀察到，作為通用法則，在第一步驟中，抗體的疏水部分似乎與所述顆粒物理性結(jié)合，并且因此整個(gè)分子接近顆粒表面上的反應(yīng)性基團(tuán)，例如氯甲基基團(tuán)，然后其與蛋白分子的相對(duì)應(yīng)的基團(tuán)例如胺反應(yīng)。由于這種物理學(xué)吸附，大的抗體分子令人驚訝地與更小的、惰性的親水蛋白如白蛋白和運(yùn)鐵蛋白充分競(jìng)爭(zhēng)。然而，由于使用比顆粒的結(jié)合容量更少的抗體，所述惰性蛋白，如白蛋白和運(yùn)鐵蛋白，與顆粒表面上留下來反應(yīng)的任何基團(tuán)起反應(yīng)，并且然后使得本發(fā)明的顆粒同時(shí)具有良好的親水表面和良好的抗體結(jié)合容量，并且具有可以產(chǎn)生良好的信號(hào)的適當(dāng)比例的納米顆粒材料。通過本文提供的教導(dǎo)的指導(dǎo)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，采用適合每種包被方法的條件的變體是常規(guī)的。例如，對(duì)于偶聯(lián)，當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，可以選擇高于抗體的pl半個(gè)單位的pH。多克隆抗體具有非常多樣的pl，并且因此對(duì)于多克隆抗體可以優(yōu)選地選擇使用pH8.8。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于偶聯(lián)反應(yīng)混合物的總蛋白含量，在偶聯(lián)過程中存在的約3-70重量％，或者甚至更優(yōu)選地5-40重量％的蛋白應(yīng)該由所述抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體組成。如上述所闡釋，由于所述抗體具有比親水惰性蛋白更高的與所述顆粒的結(jié)合率，所以，抗體蛋白與結(jié)合到顆粒表面上的總蛋白的比例將高得多，例如，結(jié)合到顆粒表面上的總蛋白的20-90%，并且更優(yōu)選地35-80%，并且甚至更優(yōu)選地40-70%是由所述抗體組成的。d)所要求保護(hù)的比濁法的優(yōu)選實(shí)施方案dl)發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供具有比現(xiàn)有技術(shù)更強(qiáng)的信噪比的比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定。通過選擇大的核心和蛋白外殼顆粒，優(yōu)選特定的最小的大小，與抗原親和純化的抗體組合，獲得了令人吃驚地高凝聚信號(hào)。由于與測(cè)定緩沖液相比較，在顆粒的折射率和高度純化的抗體的高親和力(或抗體親抗原性)之間的令人吃驚的協(xié)同作用，獲得了強(qiáng)比濁信號(hào)。所述強(qiáng)比濁信號(hào)導(dǎo)致對(duì)干擾物質(zhì)如三酰甘油的更高的穩(wěn)定性，并且比現(xiàn)有技術(shù)的比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定具有更好的線性。均相免疫測(cè)定的關(guān)鍵因素是每質(zhì)量單位每體積測(cè)定混合物所產(chǎn)生的信號(hào)。所述測(cè)定混合物是在已經(jīng)加入全部的試劑和樣品時(shí)獲得的混合物。例如，如果要分析3pl的樣品，并且所述樣品含有l(wèi)mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1，并且在混合全部的試劑和樣品后終體積是300^1，那么抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C在終測(cè)定混合物中的濃度是10pg/l。如果所述分析物在樣品中的濃度是低的，那么這通?？梢酝ㄟ^使用與測(cè)定混合物的體積相比更大的樣品而補(bǔ)償，例如，在300^U的測(cè)定混合物體積中將樣品增加到6^。對(duì)于增加樣品體積，存在一些障礙。首先，在樣品中可能存在的所有干擾物質(zhì)在所述測(cè)定混合物中的濃度增加。其次，為了克服臨界曲線作用(criticalhookeffect)(即，具有負(fù)斜率的劑量/反應(yīng)曲線)，對(duì)抗體的需求增加，其又相對(duì)應(yīng)地增加測(cè)定的抗體成本。因此，存在這樣的需要，即，在分析物的低的測(cè)定混合物濃度以及相對(duì)應(yīng)低的樣品體積下，獲得良好的信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定的測(cè)定。在均相免疫測(cè)定中增加樣品的體積導(dǎo)致更多的干擾和更昂貴的測(cè)定。本發(fā)明提供在比濁抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度、穩(wěn)定性和線性方面的令人吃驚的增加。本發(fā)明還具有來自脂質(zhì)如三酰甘油的更少的干擾。在理解現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)后，實(shí)現(xiàn)了上述目的，并且提供具有比現(xiàn)有技術(shù)中的比濁法更好的精確性、線性和更少的干擾的方法，所述現(xiàn)有技術(shù)基于每質(zhì)量單位的分析物的比濁信號(hào)中過低的信號(hào)強(qiáng)度。d2)實(shí)施本發(fā)明的測(cè)定方法在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將測(cè)定緩沖液與樣品和免疫顆?；鞈乙夯旌希⑶彝ㄟ^光度計(jì)，特別是記錄式光度計(jì)，并且更優(yōu)選記錄式分光光度計(jì)，監(jiān)測(cè)所述混合物或得到的混懸液的濁度。優(yōu)選的步驟順序?yàn)閷悠坊旌显跍y(cè)定緩沖液中，允許所述混合物完全溶解并且穩(wěn)定化，然后加入免疫顆?；旌衔?。本發(fā)明還可以這樣實(shí)施，即，通過最先將測(cè)定緩沖液與免疫顆?；鞈乙夯旌?，然后加入和混合樣品而進(jìn)行。應(yīng)該應(yīng)用最佳混合方法(在本領(lǐng)域公知的方法中選擇)，其可以通過有限量的預(yù)實(shí)驗(yàn)而確定。當(dāng)使用記錄式光度計(jì)時(shí)，可以確定濁度增加的初始速率，通過測(cè)量吸光度增加的初始速率而確定樣品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度，或者通過在混合時(shí)直接記錄；或者通過在混合不久后記錄，并與對(duì)吸光度初始增加的向后外推組合；或者通過在樣品和試劑混合后小于1分鐘內(nèi)測(cè)量在兩個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的吸光度差異(見上)。這些測(cè)量或組合的測(cè)量可以相關(guān)于，或者與使用已知的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度的校準(zhǔn)物的對(duì)應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較，并且這樣可以計(jì)算未知樣品的濃度。這些記錄吸光度值和計(jì)算結(jié)果的方法對(duì)于臨床化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員測(cè)量的許多其它物質(zhì)是眾所周知的。當(dāng)然，來自于本發(fā)明的非常良好的信號(hào)使得這樣的測(cè)量和計(jì)算要穩(wěn)定和準(zhǔn)確得多，特別在如上文所述，在將樣品和試劑混合不久后獲得的良好的信號(hào)時(shí)。存在一些可以使用的測(cè)定緩沖液混合物，其具有加入所述緩沖液中的不同種類的緩沖物質(zhì)，具有不同種類的去污劑和/或不同種類的聚合物和/或鹽?？梢允褂肨RIS緩沖液，磷酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液以及其它緩沖物質(zhì)，如MOPS,PIPES，HEPES，并且對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，只要所述測(cè)定可以不依賴于加入的樣品的pH和緩沖能力而保持最終測(cè)定混合物的充分調(diào)節(jié)的pH。典型地，以約5mM-0.2M或10mM-0.1M的終摩爾比例29加入所述緩沖液。將pH調(diào)整到6-8的范圍，特別是6.5-7.5。此外，可以使用一些去污劑，只要它們能夠溶解所加入的樣品的任何脂質(zhì)內(nèi)容物，并且不太強(qiáng)烈地干擾抗體與所述樣品引入的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的反應(yīng)。由于脂質(zhì)形成給出干擾信號(hào)的微滴和微團(tuán)，所以，三酰甘油，膽固醇和一定范圍的脂蛋白是比濁測(cè)定中干擾物質(zhì)的實(shí)例。吐溫20，TritonX-100和脫氧膽酸鹽是適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┑膶?shí)例。在含有脂質(zhì)的樣品中測(cè)量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C是一個(gè)大挑戰(zhàn)，并且需要所述脂質(zhì)的良好的溶解性，但是甚至更重要地是，超過任何次要的干擾的強(qiáng)信號(hào)。去污劑典型地以分別為最終反應(yīng)混合物重量的0.01-0.5%或0.1-0.3%的終比例加入。最廣泛應(yīng)用的聚合物是不同分子大小的聚乙二醇(特別地，約6.000-8.000)，但是還可以使用葡聚糖和其它聚合物。所述聚合物具有缺點(diǎn)，--當(dāng)濃度過高時(shí)…-它們產(chǎn)生在將檢測(cè)樣品與測(cè)定混合物混合時(shí)引入的其它物質(zhì)的非特異性沉淀。另一方面，同時(shí)，所述聚合物提高信號(hào)。然而，它們傾向于減小免疫顆粒的總結(jié)合容量。聚合物典型地以分別為最終反應(yīng)混合物重量的約0.05-0.5%或0.1-0.3%的終比例加入。適合離子強(qiáng)度的適合鹽是例如，堿金屬鹵化物，特別是氯化鈉，以1-100mM，或5-50mM的濃度加入。可以存在于測(cè)定混合物中的其它適當(dāng)?shù)某煞譃榘被?，如甘氨酸，以約1-50mM或5-20mM的終濃度加入；蛋白質(zhì)，如白蛋白，以0.1-5g/l或0.5-2g/l的終比例加入；抗微生物試劑，如疊氮化鈉，以0.1-10或1-5g/l的終比例加入；校準(zhǔn)物或?qū)φ瘴镔|(zhì)這些是典型地包括溶解在緩沖物質(zhì)中、典型地是磷酸鹽緩沖液或TRIS緩沖液中的己知濃度的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的溶液，任選地具有一些蛋白質(zhì)物質(zhì)，任選地包括達(dá)到100體積％的人或動(dòng)物血清(如果100體積％是血清，那么對(duì)于緩沖溶液，沒有空間也沒有需要)。此外，一種或多種試劑可以以干燥的、任選地凍干的形式使用。偶聯(lián)到納米顆粒上的抗體可以以干燥的形式使用，例如，作為片狀物(pellet)，并且在使用之前溶解，或者可以溶解在測(cè)定緩沖液試劑中或者溶解在反應(yīng)混合物中。反應(yīng)緩沖液中的一種或多種成分可以在實(shí)施所述測(cè)定之前或過程中以干燥形式加入，校準(zhǔn)物也是這樣。甚至所述樣品可以以干燥的或凍干的形式提供，并且以干燥形式加入到反應(yīng)混合物中，或者在其使用之前、、在臨床化學(xué)分析中，使用用于校準(zhǔn)目的的標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。因此，在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可以使用己知抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C含量的樣品替代臨床樣品，以構(gòu)建待測(cè)量的反應(yīng)/信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且然后，可以通過從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)插法而計(jì)算未知樣品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白CA按照顆粒增強(qiáng)的光散射免疫測(cè)定領(lǐng)域中公知的方法，選擇在混合物中納米顆粒-免疫偶聯(lián)物的總濃度，以致來源于所述納米顆粒的吸光度值不影響準(zhǔn)確的和精確的測(cè)量，但是微粒的濃度足夠高，足以得到信號(hào)形成。所述量當(dāng)然受到不同的參數(shù)的影響，所述參數(shù)如體液樣品或來源于其的樣品的體積，以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的含量。作為測(cè)定的非限制性的典型的參數(shù)，可以提及下述典型的樣品體積是l-20pl，例如2-10pl，或者特別是3pl。典型的免疫顆粒體積是10-100pl或20-60pi,或者特別是40pl。所述免疫顆粒可以提供為0.5-10或1-5，典型地約2-3，特別是2.26mg顆粒/ml緩沖溶液的混懸液。所述緩沖液可以具有在6-9范圍內(nèi)的pH,例如7-8.5，典型地約pH8.4。除了緩沖物質(zhì)之外，所述緩沖溶液還可以包含其它組分，例如氨基酸、鹽、惰性蛋白質(zhì)和乳化劑或增溶劑，如上文所定義。這樣的組分和緩沖液的典型的混合物包括10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mMNaCl，0.25%吐溫20和1g/1白蛋白。典型的總測(cè)定體積是100-1000pl，或200-500jil，或250-300jiil，或者特別地約280|il。不同的儀器使用不同的總體積運(yùn)行，以致這些體積的30%或60%，或者這些體積的150%或300%典型地用于其它的儀器。樣品體積和免疫顆粒體積的比例可以是在1/100-2/3,更優(yōu)選地2/100-1/3,并且甚至更優(yōu)選地1/40-1/5之間的任意值。d3)醫(yī)學(xué)用途本發(fā)明的測(cè)定方法可以用于診斷和監(jiān)測(cè)與體液或組織的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C含量相關(guān)的或以此為表現(xiàn)的病理性或潛在的病理性病況。這些特別包括哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過率(GFR，作為腎功能的量度)或影響所述濾過率的病理性病況。本發(fā)明的方法可以用來確定兒童的GFR;或者患有肌肉萎縮的患者的GFR;用來指導(dǎo)腎功能癌癥治療的作用；用來指導(dǎo)腎臟移植和免疫抑制治療；用來指導(dǎo)糖尿病的腎臟濾過率；用于檢測(cè)并且管理驚厥；并且在藥物施用與可能導(dǎo)致體內(nèi)不理想的藥物累積的GFR減少相關(guān)的情形中，用來發(fā)現(xiàn)正確的藥物劑量。所述測(cè)定方法還可以用于評(píng)估藥物對(duì)所述濾過率的作用。對(duì)于閱讀本說明書的熟練的技術(shù)人員可以明白其它潛在的應(yīng)用。本發(fā)明還提供實(shí)施按照本發(fā)明的免疫測(cè)定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，和任選地，校準(zhǔn)溶液與對(duì)照溶液。任選地，所述顆?；鞈乙汉蜏y(cè)定緩沖液作為組合的試劑遞送。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析產(chǎn)品，任選地以試劑盒或多部分的試劑盒形式存在，用于測(cè)定樣品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，所述產(chǎn)品包括至少一種如上文所述的以干燥的或混懸形式存在的納米顆粒-免疫偶聯(lián)物，并且任選地，一種或多種如本文定義的其它組分，例如，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，并且任選地，校準(zhǔn)溶液和對(duì)照溶液。本發(fā)明還提供用于實(shí)施按照本發(fā)明的免疫測(cè)定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括，抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，并且任選地，校準(zhǔn)溶液和對(duì)照溶液。任選地，所述顆?；鞈乙汉蜏y(cè)定緩沖液作為組合的試劑遞送。任選地，還可以存在信號(hào)評(píng)估的工具，如計(jì)算圖表，允許將觀察到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度與GFR參數(shù)直接關(guān)聯(lián)。下述非限制性實(shí)施例以非限制的方式舉例說明本發(fā)明方法。實(shí)驗(yàn)部分合成實(shí)施例l:制備多克隆禽類血清及其親和純化a)制備禽類抗體級(jí)分可以使用下述免疫方法來產(chǎn)生針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆IgY抗體每個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)使用2-4只母雞。在免疫開始之前，收集一對(duì)卵。從這些卵中純化的IgY將作為對(duì)照IgY。將在磷酸鹽緩沖液中的100pg高度純化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(從患有腎小管蛋白尿的患者的尿中純化，商購(gòu)自ScipacLtd.，英國(guó))用弗氏完全佐劑乳化，并且注射到母雞的胸肌中。每4周重復(fù)注射。在注射起始后10周，收集卵。將蛋黃從卵分離，并且通過氯化銨沉淀，以按照卵抗體分離的現(xiàn)有技術(shù)方法的常規(guī)方式，分離來自蛋黃的IgY級(jí)分(參見，例如，LarssonA,BaaloewR-M,LindahlT,和ForsbergP-O，在PoultryScience(家禽科學(xué))中，72:1807-1812,1993)。b)多克隆抗體級(jí)分的親和純化按照在柱子的包裝插件中的指示，將10mg高度純化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C固定在來自安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù)(AmershamPharmaciaBiotech)的HITRAPNHS-活性HP柱上。將分離的IgY級(jí)分在磷酸緩沖鹽水中稀釋至2mg/ml。將200ml的這種IgY溶液流過柱子，然后是50ml無IgY的磷酸緩沖鹽水。具有對(duì)固定的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的特異性親和力的抗體用35ml0.1摩爾的檸檬酸鹽緩沖液pHH3.2洗脫。將洗脫的特異性抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體針對(duì)磷酸緩沖鹽水透析，并且使用具有30,000道爾頓的截留分子量的AmiconCentircon離心過濾裝置濃縮至3mg/ml。合成實(shí)施例2:制備單克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體單克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體的制備可按照下述實(shí)施，通過利用本領(lǐng)域公知的方法，例如，由Harlow等，1988,"Antibodies:aLaboratoryManual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))"的第6節(jié)，冷泉港出版社，紐約，美國(guó)所述。按照Sensabaugh等，1990，J.Urology(泌尿?qū)W雜志)144,1523所述，從人精液血漿中分離人PSA。在規(guī)律的時(shí)間間隔，將小鼠用在RAS(RIBI佐劑系統(tǒng))中的50|ag人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的4次注射進(jìn)行免疫。在第一次注射后4個(gè)月，使用G.Galfre等，1981,MethodsinEnzymology(酶學(xué)方法)，73,3-46所述的聚乙二醇方法，將從免疫的小鼠的脾臟分離的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0-Agl4融合。分泌針對(duì)抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗體的雜交瘤通過下述篩選ELISA鑒定將微量滴定板用兔抗-人-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫球蛋白包被；將結(jié)合到這種固相上的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C與雜交瘤培養(yǎng)物的上清一起溫育。使用抗-小鼠-免疫球蛋白-過氧化物酶-偶聯(lián)物，檢測(cè)與抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C結(jié)合的單克隆抗體?？梢苑蛛x數(shù)百種分泌針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位的抗體的雜交瘤。然后，親和純化相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，并且可以進(jìn)行更詳細(xì)地特征性描述。實(shí)施表位結(jié)合，并且使用BIAcore生物傳感器技術(shù)(法瑪西亞(Pharmacia),瑞典)，關(guān)于它們的表觀解離常數(shù)確定抗體的相對(duì)反應(yīng)性。后者是基于表面等離振子共振技術(shù)(參見，J.L.Daiss等，1994.在"Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology(方法酶學(xué)方法的指南)"中6,143-156,學(xué)院出版公司(AcademicPressInc.),紐約，美國(guó))，并且允許監(jiān)測(cè)生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)量。從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清開始，單克隆抗體通過多克隆兔抗-小鼠-Fc-抗體而結(jié)合到生物傳感器的表面。監(jiān)測(cè)抗原抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C與所述單克隆抗體的締合和解離。數(shù)據(jù)可以使用內(nèi)在的BIA評(píng)估軟件，基于簡(jiǎn)單的A+B=AB平衡模型(L.G.Fagerstam等，1992,JournalofChromatography(層析雜志)，597,397-410)，而進(jìn)行分析。然后，得到的抗體可以關(guān)于它們各自的表觀解離常數(shù)進(jìn)行比較。然后，適當(dāng)?shù)目贵w或它們的組合可以用于制備本發(fā)明的免疫顆粒。合成實(shí)施例3:制備抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒a)偶聯(lián)方法-標(biāo)準(zhǔn)方法(1)緩沖液和試劑34<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>為了具有來自聚合物顆粒的更多的信號(hào)/mg抗體，將偶聯(lián)緩沖液的pH以特定方式適合待偶聯(lián)的抗體的pl。另外，在偶聯(lián)之前，將所述抗體用白蛋白/運(yùn)鐵蛋白稀釋(見下文)。對(duì)于偶聯(lián)，當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，選擇高于抗體的pl半個(gè)單位的pH。多克隆抗體具有非常多樣的pl，并且因此多克隆抗體使用8.8的pH值。通過將上文提及的PBS和硼酸鹽緩沖液混合，而獲得所選擇的pH。下述標(biāo)準(zhǔn)方法概括了通過抗體與氯甲基的物理吸附而附著的兩種簡(jiǎn)單的一步方法。所述方法用于以1%固體的1^m的氯甲基膠乳。這一反應(yīng)可以容易地放大或縮小，以適合個(gè)別需要。例如，如果使用不同的顆粒大小，那么可以從下式計(jì)算抗體(Ab)的量Ab的重量=(用于lpm-顆粒的Ab的重量)/(單位為nm的顆粒直徑)(2)制備膠乳顆?；鞈乙?.移取2.5ml(40mg/ml)氯甲基膠乳微球體，并且用10mLMES緩沖液稀釋。2.將所述混合物離心，以沉淀顆粒3，000G持續(xù)20分鐘。3.去除上清，并且將沉淀重新分散在10mlMES緩沖液中。4.再次離心，并且從顆粒上去除上清。5.將沉淀重懸在5mlMES緩沖液中，確保完全懸浮微球體顆?！，F(xiàn)在，所述膠乳混懸液具有約2%固體(即，~20mg/ml)。(3)偶聯(lián)1.向5ml在調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)膒H(見上文)的PBS/硼酸鹽緩沖液中的1.5mg抗體、3.75mg白蛋白和7mg牛運(yùn)鐵蛋白的溶液中，加入5ml的膠乳。這小于抗體單層所需要的。與所述運(yùn)鐵蛋白(transferring)和白蛋白相比，所述抗體與膠乳更具反應(yīng)性，并且或多或少地與膠乳定量結(jié)合，并且其余的膠乳表面由白蛋白和/或運(yùn)鐵蛋白飽和。這種混合物還保證顆粒的抗凝聚和良好的親水性。此外，其它的惰性蛋白質(zhì)可以在偶聯(lián)過程中與抗體混合，如，形血藍(lán)蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對(duì)于所述抗體和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C沒有任何親和力。2.在室溫下輕輕攪拌，將膠乳/蛋白混合物溫育過夜。3.離心，以從未結(jié)合的蛋白質(zhì)分離蛋白-標(biāo)記的膠乳顆粒。4.去除并且保留用于蛋白質(zhì)確定的上清。在這一步驟，可以保留上清，并且進(jìn)行蛋白確定?？梢詮募尤氲某跏剂恐袦p去上清中的任何殘留的蛋白。剩余的被包被在顆粒上。與膠乳微球體相容的用于蛋白確定的唯一的方法是來自Pierce的MicroBCA蛋白測(cè)定試劑盒。5.將沉淀重懸在10mlPBS中。6.再次離心，以沉淀所述顆粒。7.再重復(fù)步驟5-6兩次，總共進(jìn)行3次洗滌。8.將最終的膠乳重懸在10ml儲(chǔ)存緩沖液中，產(chǎn)生1%固體的終濃度。在4t:保存?zhèn)溆?。勿冷凍。將甘氨酸用于?chǔ)存緩沖液中，以填充還未被蛋白質(zhì)覆蓋的微球體表面上的任何反應(yīng)性位點(diǎn)。這是減少非特異性的結(jié)合。如果需要，惰性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或牛運(yùn)鐵蛋白，可以用于同樣的目的。存在NaN3作為生物殺滅劑。如果所述膠乳保持無菌，可以省略與細(xì)胞或組織培養(yǎng)物不相容的NaN3。b)制備包被的納米顆粒應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)方法包被直徑0.08)im的膠乳顆粒，以制備本發(fā)明的納米顆粒-偶聯(lián)物。按照上式，24mg的抗體和65mg的白蛋白用來包被100mg的顆粒。通過將挪威的來自挪威抗體AS(NorwegianAntibodiesAS,挪威)、按照如上合成實(shí)施例1和2中給出的由GentianAS給出的說明書制備的抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體(所述多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體對(duì)應(yīng)從用來自患有慢性腎小管蛋白尿的患者的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫的母雞的卵分離的免疫球蛋白的親和純化的免疫球蛋白級(jí)分；親和純化方法使用固定的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而進(jìn)行)偶聯(lián)到氯甲基活化的膠乳顆粒(0.083nm，來自美國(guó)的界面動(dòng)力學(xué)公司(IntefacialDynamicsInc.,USA),產(chǎn)品號(hào)C37487)上，而產(chǎn)生所述抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒。對(duì)于所述偶聯(lián)，可以使用從http:〃www.idclatex.com/bodv-bgrounder-superactive-protocol-l1.asp下載的方法"蛋白與IDC超凈氯曱基膠乳的偶聯(lián)(CouplingofProteinstoIDCUltracleanChloromethylLatex),，。備選的顆粒和偶聯(lián)方法可以在界面動(dòng)力學(xué)公司(IntefacialDynamics)的網(wǎng)頁(yè)上、Invitrogen的網(wǎng)頁(yè)和Bangs顆粒公司(BangsParticlesInc)的網(wǎng)頁(yè)上找到。所獲得的顆粒用作在具有0.25%吐溫20和lg/1白蛋白的10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mMNaCl中2.26mg顆粒/ml的混懸液。測(cè)定實(shí)施例l:在本發(fā)明的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C測(cè)定中，在不同波長(zhǎng)處確定的濁度a)試劑按照合成實(shí)施例3制備的免疫顆?；鞈乙河糜谙率鰧?shí)驗(yàn)在所述實(shí)驗(yàn)中，使用下述最優(yōu)化的測(cè)定緩沖液pH:7,2:聚乙二醇(西格瑪(Sigma))22g/l，吐溫20(西格瑪)3g/l，MOPS(西格瑪)9.4g/l，疊氮化鈉2.7g/l，氯化鈉27g/l，具有8mg/1的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度的樣品用于在400-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)確定時(shí)間依賴性濁度變化。b)儀器如由RocheDiagnostics(羅氏診斷)提供的具有標(biāo)準(zhǔn)附件的日立917儀，其使用樣條模式設(shè)置，處于37。C。c)程序?qū)?pi樣品與160^所述測(cè)定緩沖液混合，并且允許靜止3分鐘，然后加入45pl免疫顆粒混懸液并且混合。在所述混合之后，以不同波長(zhǎng)和不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量濁度。d)結(jié)果觀察到的結(jié)果總結(jié)在附圖1和2中。如由附圖l可知，反應(yīng)開始點(diǎn)時(shí)的背景取決于測(cè)量吸光度的波長(zhǎng)，背景隨波長(zhǎng)縮短而增加。然而，現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)在約340nm-低于約500nm，獲得吸光度的高凈變，在反應(yīng)開始時(shí)具有可接受的低吸光度(見附圖l)。另外，比濁/吸光度變化的測(cè)定顯示，在不同波長(zhǎng)和固定溫育間隔(測(cè)量前5分鐘)下，最大濁度在約450nm處獲得(見附圖2)。測(cè)定實(shí)施例2:確定吸光度變化的最佳范圍a)試劑如測(cè)試實(shí)施例1中定義的免疫顆粒和測(cè)定緩沖液具有8，3mg/1的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度的血清樣品b)儀器SchimadzuUV-160分光光度計(jì)；具有10mm光徑的石英(quarts)管c)程序?qū)嶒?yàn)(1):在具有10mm光徑的石英管中混合680pl測(cè)定緩沖液和10W血清樣品，儀器處于光譜模式設(shè)置。隨后，混合1S0ul抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒，并用SchimadzuUV-160分光光度計(jì)在最終混合后0,1，2,3,4禾口5分鐘時(shí)測(cè)量350-600nm的吸光度光譜(見附圖3a)。實(shí)驗(yàn)(2):在單獨(dú)的平行實(shí)驗(yàn)中，用處于動(dòng)力學(xué)模式設(shè)置的儀器連續(xù)測(cè)量430nm處的吸光度5分鐘(圖3b)所有實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。d)結(jié)果觀察到的結(jié)果總結(jié)在附圖3a(實(shí)驗(yàn)(l))和3b(實(shí)驗(yàn)(2))中。附圖3a證明最佳信號(hào)增加在430nm附近獲得(由430nm處的指示線指示)，但是在最低360nm-最高500nm也具有良好的信號(hào)增加。高于500nm，信號(hào)增加較弱。從400nm到低至350nm，信號(hào)增加較低，且在400nm以下，零信號(hào)還非常高，從而導(dǎo)致低的信號(hào)與背景的比率。圖3b證明在430nm處251mAbs單位的初始(混合后20-40秒時(shí)測(cè)量的，因?yàn)樵诨旌衔锞鶆蚯靶枰獛酌?，因此從時(shí)間O開始測(cè)量是不可能的)吸光度變化，其對(duì)應(yīng)于753niAbs單位/分鐘。凝集反應(yīng)持續(xù)5分鐘，且5分鐘后僅觀察到小的增加。充分理解觀察到的比率可以通過改變免疫顆粒量、樣品體積、溫度、測(cè)定緩沖液的組成、顆粒的尺寸等增大或減小。然而，該實(shí)施例說明反應(yīng)的信號(hào)在低于約500nm到約400nm增大，在低于約400nm開始減小，且在低于360nm時(shí)信號(hào)甚至更低。信號(hào)與背景的比率在低于約400nm時(shí)變低，且在低于360nm時(shí)非常低。因此，可以推斷存在約370-約500nm的中間波長(zhǎng)范圍，最佳在約410-450nm，其中吸光度變化最佳。此外，由圖1，3a和3b可知——在約370-500nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)——吸光度變化在反應(yīng)開始時(shí)，特別是在最初的2-3分鐘內(nèi)最高，并且然后在三分鐘后減小。所述附圖還證明通過在混合試劑后較早測(cè)量可以節(jié)省時(shí)間，這對(duì)于自動(dòng)化分析儀系統(tǒng)的通量很重要。此外，不應(yīng)該在混合后過早開始測(cè)量，因?yàn)樵诹己没旌蠈?dǎo)致均勻混合物之前需要幾秒。此外，在較短時(shí)期內(nèi)的許多時(shí)間點(diǎn)處的動(dòng)力學(xué)讀數(shù)可以獲得比簡(jiǎn)單測(cè)量分開的兩個(gè)——或幾個(gè)——時(shí)間點(diǎn)更高的精確性。在多分析儀中，可能不可能連續(xù)追隨一份樣品——儀器通常操作旋轉(zhuǎn)式傳送帶(carrousels),其中樣品以幾秒的間隔測(cè)量許多次——但是在反應(yīng)早期重復(fù)測(cè)量可以提供比等到反應(yīng)變平(和結(jié)束點(diǎn)測(cè)量)更好的結(jié)果和更高的結(jié)果產(chǎn)率(例如，更多的結(jié)果/小時(shí))。因此，在混合所有試劑后5-280秒之間的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量吸光度是優(yōu)選的，且甚至更優(yōu)選的是在15-200秒，如例如25-150秒之間測(cè)量。測(cè)定實(shí)施例3:利用強(qiáng)生(Johnson&Johnson)的Vitros5.1儀確定不同波長(zhǎng)和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度下的吸光度變化將儀器設(shè)置為兩點(diǎn)率模式(twopointratemode),其具有立方樣條校準(zhǔn)曲線設(shè)置。a)試劑見測(cè)定實(shí)施例1b)程序混合187^1試劑緩沖液、2.4^不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度的樣品(見下)、和60pl免疫顆粒，隨后在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中——在405——和在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中——380nM處——以在混合所有試劑后38秒-208秒之間的時(shí)間間隔測(cè)量。實(shí)驗(yàn)在37'C下進(jìn)行。c)結(jié)果405nm處的實(shí)驗(yàn)結(jié)果0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升0，83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升380nm處的實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化率7,2mABS單位/分鐘變化率14,1mABS單位/分鐘變化率25,4mABS單位/分鐘變化率56,5mABS單位/分鐘變化率107,3mABS單位/分鐘變化率199,1mABS單位/分鐘0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升0，83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升變化率9,7mABS單位/分鐘變化率15,9mABS單位/分鐘變化率29，14mABS單位/分鐘變化率62,5mABS單位/分鐘變化率108,7mABS單位/分鐘變化率192,mABS單位/分鐘如所可見，包含8.05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1的樣品的最大吸光度變化速率在380nm處低于在405nm處。這是可預(yù)料的，因?yàn)槿绻ㄩL(zhǎng)縮短到低于450nm的值最大吸光度/濁度減小(如以上附圖2中可見)，而背景信號(hào)(反應(yīng)開始時(shí)的吸光度信號(hào))在波長(zhǎng)縮短到低于450mn的值時(shí)顯著升高，如以上附圖1和3中可見。因此，測(cè)量波長(zhǎng)值低于370nm，且特別是波長(zhǎng)低至340nm(如由Newman等教導(dǎo))是不可取的。測(cè)定實(shí)施例4:利用來自RocheDiagnostics(羅氏診斷)的日立917儀確定不同波長(zhǎng)和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度下的吸光度變化儀器在37'C下運(yùn)行，并應(yīng)用樣條校準(zhǔn)曲線和兩點(diǎn)率。a)試劑見測(cè)定實(shí)施例1b)程序?qū)?pl樣品(抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度參見圖4)與230pl測(cè)定緩沖液和40]il水混合，溫育3分鐘，并且然后與40pl免疫顆?；旌?。在混合所有試劑后25-80秒測(cè)量吸光度變化。c)結(jié)果結(jié)果顯示在附圖4中。在該比率實(shí)驗(yàn)中，其中所有測(cè)量在混合所有試劑后70秒內(nèi)完成，信號(hào)在376nm的低測(cè)量波長(zhǎng)處最佳，大約比415nm處高35%，因?yàn)閮H測(cè)量反應(yīng)最開始的部分。mAbs/分鐘值顯示在附圖4中。測(cè)定實(shí)施例5:利用Cobas501多分析儀確定不同波長(zhǎng)和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度下的吸光度變化a)試劑見測(cè)定實(shí)施例1b)程序/儀器設(shè)置儀器設(shè)置為——在每個(gè)測(cè)定中——將170)il測(cè)定與2,4^樣品混合，隨后將45^免疫顆粒與該測(cè)定混合物相混合。Cobas501儀以8.6秒的周期操作。將儀器設(shè)置為在34-35個(gè)周期后混合所有試劑。從周期36到周期41，以兩點(diǎn)率設(shè)置測(cè)量450nm處的吸光度變化。獲得以下吸光度變化速率樣品中的抑半胱氨酸蛋<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>測(cè)定實(shí)施例6:利用BeckmaiiLx20儀確定不同波長(zhǎng)和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度時(shí)的吸光度變化a)試劑見測(cè)定實(shí)施例1b)程序?qū)x器設(shè)置為混合230^測(cè)定和6^樣品，隨后將50^免疫顆粒與測(cè)定化合物相混合。將儀器進(jìn)一步設(shè)置為在混合試劑后12-52秒測(cè)量吸光度變化速率。BeckmanLx20儀——作為許多其他臨床分光光度計(jì)自動(dòng)儀器——以主要(第一)測(cè)量波長(zhǎng)和第二測(cè)量波長(zhǎng)(約700nm)操作，且提供主要波長(zhǎng)處的測(cè)量結(jié)果，關(guān)于第二波長(zhǎng)處的讀數(shù)校正。進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，一個(gè)使用主要測(cè)量波長(zhǎng)為410nm的儀器設(shè)置，和一個(gè)實(shí)驗(yàn)使用主要測(cè)量波長(zhǎng)為470nm的儀器設(shè)置。對(duì)于這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，第二波長(zhǎng)設(shè)置為700nm。獲得以下mAbs單位/分鐘變化率.*樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C410nm0.42mg/136,20,62mg/153，90,85mg/ml81,21，69mg/ml203,13,38mg/1529,38，05mg/l1095470腦12,015,727,361，1168,1390,8權(quán)利要求1.用于評(píng)估人體液樣品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定方法，其通過下列步驟進(jìn)行a)通過將所述樣品與包含適合于比濁測(cè)量的納米顆粒的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物接觸而形成測(cè)定混合物，其中所述納米顆粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗體或其抗原結(jié)合片段包被，以結(jié)合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其中所述包被的納米顆粒具有至少40nm范圍內(nèi)的中數(shù)直徑，和b)通過確定在340nm以上和500nm以下的范圍內(nèi)的至少一個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度變化，測(cè)量所述混合物的濁度的變化而評(píng)估所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量。2.權(quán)利要求1的方法，其中確定初始吸光度變化速率。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在形成所述測(cè)定混合物后立即或不久后開始的至少一個(gè)約5-300秒的時(shí)間間隔內(nèi)確定所述初始吸光度變化速率。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆非人、非嚙齒動(dòng)物抗體。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述多克隆抗體是針對(duì)人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的禽類抗體。6.權(quán)利要求4和5中任一項(xiàng)的方法，其中至少25重量％的所述多克隆抗體或片段通過使用人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的親和純化而獲得。7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括(a)結(jié)合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的單一表位的單克隆抗體，或(b)—組兩種或多種種類的單克隆抗體，其中每種種類的單克隆抗體結(jié)合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位，或者兩種或多種種類以不同的結(jié)合強(qiáng)度而結(jié)合相同的表位。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述單克隆抗體是非人來源的。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒具有大于58nm的平均直徑。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述包被的納米顆粒具有80-105nm范圍內(nèi)的平均直徑。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒用約5-35%的結(jié)合抗體/所述納米顆粒-抗體偶聯(lián)物的總重而包被。12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c抗體和至少一種惰性蛋白質(zhì)的混合物包被。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述納米顆粒基本上由聚苯乙烯、聚氯乙烯、環(huán)氧樹脂、聚偏l,l-二氯乙烯、聚-a-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它們相應(yīng)的共聚物制成。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述濁度變化通過在350-499nm范圍內(nèi)的至少一個(gè)波長(zhǎng)處和在10-5(TC范圍內(nèi)的溫度下所述測(cè)定混合物的吸光度變化而測(cè)量。15.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于一當(dāng)構(gòu)建針對(duì)濁度測(cè)定法的相關(guān)性曲線時(shí)一關(guān)于用濁度測(cè)定法獲得的Omg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的對(duì)應(yīng)值，用所述比濁法獲得小于0.15mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。16.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于一當(dāng)構(gòu)建針對(duì)非均相免疫測(cè)定方法的相關(guān)性曲線時(shí)一對(duì)于Omg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的對(duì)應(yīng)值，獲得小于0.25mg/1抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。17.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，對(duì)于在1.2mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1的水平下，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的測(cè)量值具有來自所述檢測(cè)的樣品中的15mmo1/1三酰甘油的小于6%的干擾。18.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在1.32-7.5mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/1的測(cè)量范圍內(nèi)，具有低于5%的線性偏差，并且在0.75-1.32mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的測(cè)量范圍的測(cè)量區(qū)域內(nèi)，具有低于15%的線性偏差。19.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，(a)通過在混合時(shí)直接記錄，或者(b)通過在混合后立即記錄，與對(duì)初始增加吸光度的向后外推組合，或者(c)通過在所述樣品和所述試劑混合后小于5分鐘內(nèi)測(cè)量在兩個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的吸光度差異，通過測(cè)量吸光度增加的初始速率而確定樣品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C濃度。20.—種用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過率的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁評(píng)估。21.用于實(shí)施權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法的試劑盒或試劑組，其包括(a)顆粒，其包括以干燥或混懸形式存在的在前述權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)中定義的抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫顆粒，(b)以干燥或溶解形式存在的測(cè)定緩沖液，以及，任選地，(c)各自以干燥或溶解形式存在的校準(zhǔn)混合物和對(duì)照混合物。22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述顆粒和測(cè)定緩沖液以干燥或混懸的形式組合提供。23.按照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的定義的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物。24.權(quán)利要求23的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物在用于評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫測(cè)定中或在用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過率的診斷方法中的應(yīng)用。25.權(quán)利要求23的納米顆粒-抗體偶聯(lián)物在用于評(píng)估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫測(cè)定中或在用于評(píng)估腎功能障礙的診斷方法中的應(yīng)用。全文摘要存在對(duì)在生物樣品、特別是人的體液臨床樣品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的改進(jìn)的比濁免疫測(cè)定法的需要。本發(fā)明提供能夠通過比濁法測(cè)量人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定方法和試劑組，其導(dǎo)致令人驚訝地比當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)更強(qiáng)和更快的比濁信號(hào)。所述提高的和更快的信號(hào)是通過使用新的試劑和組合物而獲得，并且能夠獲得更短的測(cè)定時(shí)間和具有更強(qiáng)的信號(hào)的動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，提高了整體測(cè)定速率和質(zhì)量。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了針對(duì)脂質(zhì)干擾的提高的穩(wěn)定性和提高的線性。文檔編號(hào)G01N33/573GK101680890SQ200880016645公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年5月19日優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日發(fā)明者湯姆·尼爾森申請(qǐng)人:根田股份有限公司