專利名稱：一種微囊藻毒素-lr單抗免疫親和柱的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種微囊藻毒素-LR單抗免疫親和柱的制備和使用方法，屬于免疫親和層析 及微囊藻毒素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻是地球上的最古老生物之一，水體的富營(yíng)養(yǎng)化有利于藍(lán)藻的繁殖和生 長(zhǎng)。水體中的藍(lán)藻短時(shí)間內(nèi)大量繁殖并聚集的生態(tài)異?，F(xiàn)象稱為水華(也稱湖 靛)。最近的調(diào)查表明，亞太地區(qū)54。/。的湖泊富營(yíng)養(yǎng)化，歐洲、非洲、北美洲和 南美洲的比例分別是53%， 28%， 48%和41%，我國(guó)則是60%。近年來我國(guó)幾大 淡水湖泊都有藍(lán)藻水華的大量爆發(fā)。藍(lán)藻水華出現(xiàn)時(shí)，水面被厚厚的藍(lán)綠色湖 靛所覆蓋，甚至在岸邊大量堆積。在藻體大量死亡分解的過程中，不但散發(fā)惡 臭，破壞景觀；同時(shí)大量消耗水中溶解氧，使魚類窒息死亡；尤其是藍(lán)藻能釋 放生物毒素——微囊藻毒素(MC)，這些類次級(jí)代謝產(chǎn)物嚴(yán)重危害人類和其他 生物的安全。其中微囊藻毒素-LR (MC-LR)
藍(lán)藻水華產(chǎn)生的MC毒性極強(qiáng)，1996年巴西發(fā)生透析液受MC污染的事故， 造成50多人死亡。MC還是潛在的致癌因子和腫瘤促進(jìn)因子。MC引起野生動(dòng) 物和家畜中毒甚至死亡的事件在liJ:界各地都有報(bào)道。目前對(duì)藍(lán)藻水華的發(fā)生及 MC的危害尚沒有有效的控制方法，建立有效的檢測(cè)方法和制定水體、飲用水和 一些食品的MC限制標(biāo)準(zhǔn)實(shí)為可行的預(yù)防措施?？紤]到飲水安全，WHO和我國(guó) GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飲用水中MC-LR的限量值為l嗎/L。
免疫親和柱(IAC)是利用免疫親和層析原理制作的分離分析預(yù)裝柱。由于 抗體與抗原作用具有高度專一性，因此通過IAC凈化能夠去除絕大部分雜質(zhì)。 IAC技術(shù)已日漸成熟，在與藻毒素類似的真菌毒素的檢測(cè)中已廣泛應(yīng)用，其中 黃曲霉毒素的免疫親和層析已被列入國(guó)標(biāo)中(GB18980-2003和GB18979-2003)。
由于藍(lán)藻樣品成份復(fù)雜，其中的MC含量低(質(zhì)量百分比在萬分之一左右)， 如果在前處理過程中雜質(zhì)殘留多，在后續(xù)定量分析中，能嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確 性。我們通過藍(lán)藻樣品的溶劑提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC凈化，然后 進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量測(cè)定，能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。此文建立的方法能應(yīng)用于水 樣、其它藻類及類似的生物樣品中MC的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種MC-LR單抗IAC的制備和使用方法，所研制的 IAC是將MC-LR單抗固定于柱中，通過藍(lán)藻樣品的溶劑提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC凈化，然后進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量測(cè)定，能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。本 發(fā)明建立的方法能應(yīng)用于水樣、其它藻類及類似的生物樣品中MC的檢測(cè)。 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種MC-LR單抗IAC的制備方法
(1) 用水溶性碳二亞胺法制備MC-LR與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)物，以下 簡(jiǎn)稱MC-LR-BSA，用MC-LR-BSA作為免疫原；用混合酸酐法制備MC-LR與 載體蛋白OVA的偶聯(lián)物，以下簡(jiǎn)稱MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作為檢測(cè)抗 原；通過免疫方法獲得MC-LR單抗；
(2) 瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的活化用溴化氰法活化Sepharose 4B，活 化過程如下
(a) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30 mL水分兩次洗滌后 抽千，加少量的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03洗滌，立即轉(zhuǎn)入100 mL燒杯中， 冰浴下緩慢攪拌；
(b) 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取1 g溴化氰，加水10 mL溶解，然后分批加入Sepharose 4B中，邊加邊攪拌，同時(shí)測(cè)pH值，通過滴加2 mol/LNaOH，使pH保持在10.5， 待溴化氰反應(yīng)完全，pH保持不變，停止攪拌；
(c) 將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150 mL冷的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03抽洗；
(3) MC-LR單抗IAC的制備
MC-LR單抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B偶聯(lián)得到親和吸附劑，填入柱中制 得MC-LR單抗免疫親和柱，操作步驟如下
(d) 偶聯(lián)
將上述制備純化好的MC-LR單抗置于pH 8.3含有0.5 M NaCl的0.1M NaHC03的偶聯(lián)緩沖液中透析12 h;將上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗 中用偶聯(lián)緩沖液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR單抗溶液中進(jìn)行偶聯(lián)，紫外掃 描監(jiān)控偶聯(lián)過程；用5倍以上MC-LR單抗溶液體積的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的 MC-LR單抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物；收集全部的洗脫液，通過測(cè)定其蛋 白質(zhì)的含量計(jì)算未偶聯(lián)上MC-LR單抗的量；
(e) 封閉活性基團(tuán)
將瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入5倍體積pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩沖液中，保持2h，以封閉Sepharose 4B中多余的活性基團(tuán)；
(f) 洗滌
步驟(e)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物依次用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH 4.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸緩沖液和5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩沖液洗滌，此洗滌過程重復(fù)三次；然后用5倍偶聯(lián)復(fù) 合物體積的PBS洗滌兩次；(g) 防腐處理
步驟(f)制備好的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物如需放置一段時(shí)間，應(yīng)使用含有 1/10000疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡，然后瀝去多余的溶液后放入包裝袋或瓶中在 4'C密閉保存；
(h) 裝柱
將歩驟(f)或(g)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在負(fù)壓下用PBS將凝膠壓緊，即制成MC-LR單抗IAC;
(i) 保存
瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物或填充好的MC-LR單抗IAC切勿冷凍，保存在4°C 的冰箱內(nèi)；
(j) IAC的再生
IAC使用后，用4-10個(gè)柱床體積pH 8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩 沖液，和用4-10個(gè)柱床體積pH 4.5含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸鈉緩沖液輪流清 洗IAC兩次，再用PBS緩沖液充分平衡IAC后保存在4'C冰箱內(nèi)供下次使用。
制備的MC-LR單抗IAC的使用方法
(1) 采集的藍(lán)藻水華經(jīng)晾曬干燥后，粉碎并過100目篩，干燥藻粉室溫干 燥保存；
(2) 藍(lán)藻樣品前處理
取O.l g干藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室溫下置于超聲波細(xì)胞破碎儀中 提取30min， 3000 rpm離心10min，收集上層清液，沉淀再重復(fù)抽提兩次，合 并上清液并過濾，濾液減壓濃縮至少于1 mL，加10mL去離子水稀釋；SPE柱 先分別用2mL純甲醇、2mL去離子水預(yù)處理；稀釋后的濾液過SPE柱富集； 再分別用5 mL去離子水、5 mL 10%的甲醇水溶液沖洗SPE柱后用5 mL純甲醇 洗脫柱上藻毒素；IAC使用前先用2 mL純甲醇、2 mL去離子水預(yù)處理；洗脫 液用甲醇定容至5mL，取10pL，力卩l(xiāng) mL去離子水后過IAC; IAC用2 mL蒸 餾水洗后用5 mL純甲醇洗脫，洗脫液減壓蒸干，殘留物用lmL甲醇溶解后進(jìn) LC-MS分析；
(3) 儀器檢測(cè)條件
流動(dòng)相A:以體積計(jì)，含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液；流動(dòng)相B:以體積 計(jì)，含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液；線性梯度洗脫程序0 15min為20。/。
50% B; 15 20min為50% 100%B; 20 30 min為100% 20%B，其余為A; 色譜柱為SunFire C18柱，150 mmx2.1 mm, 5 pm，柱溫30°C,流速0.3 mL/min， 進(jìn)樣量10iiL，紫外檢測(cè)器200-400 nm;
電離方式電噴霧電離源，正離子模式ESI+;離子源溫度120°C;脫溶劑
氣N2溫度300'C，氣體流速300L/h;噴霧電壓4.5kV，錐孔電壓45V;掃描范圍m/z300 1200;質(zhì)譜條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明的有益效果由于藍(lán)藻樣品成份復(fù)雜，其中的MC含量低(質(zhì)量百
分比在萬分之一左右)，如果在前處理過程中雜質(zhì)殘留多，在后續(xù)定量分析中，
能嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們通過藍(lán)藻樣品的溶劑提取、固相萃取柱富集、IAC 凈化，然后進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量測(cè)定，能得到MC-LR和MC-RR含量的準(zhǔn)確 結(jié)果。只用SPE凈化，不用IAC凈化，雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，而影響測(cè) 定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明建立的方法能應(yīng)用于水樣、其它藻類及類似的生物樣 品中MC的檢測(cè)。


圖1 MC-RR和MC-LR的總離子流色譜圖。std為MC-RR和MC-LR的混 合標(biāo)樣，1為SPE富集藻樣，2為SPE富集后IAC凈化藻樣。
圖2藻樣凈化后MC-RR的選擇離子(SIR)色譜圖(樣品與圖l相對(duì)應(yīng))。 圖3藻樣凈化后MC-LR的選擇離子(SIR)色譜圖(樣品與圖l相對(duì)應(yīng))。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l: MC-LR單抗的制備 1、完全抗原的合成
(1) MC-LR-BSA免疫原的合成
完全抗原MC-LR-BSA的合成采用水溶性碳二亞胺法，利用l-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)作為"橋聯(lián)劑"，使MC-LR的羧基(-COOH)與 EDC反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，再與BSA蛋白分子上的氨基反應(yīng)，制成完全抗原 MC-LR-BSA偶聯(lián)物作為免疫原。合成方法如下
0.5 mg MC-LR溶于0.5 mL甲醇，分為0.25 mL的兩等份，通氮?dú)?，?5。C 下?lián)]發(fā)至干。 一份含有0.25 mg MC-LR的殘余物溶于1 mL PBS (pH7.4)緩沖 液中，加入5mgEDC，振蕩至完全溶解，用0.1M鹽酸溶液將pH值調(diào)至5， 室溫下緩慢攪拌5min。將1.4mgBSA溶于3mLPBS緩沖液中，振蕩至完全溶 解，然后逐滴加入上述MC-LR溶液中，在室溫下保持lh。然后4。C下過夜。將 混合物于4。C下在0.1 mol/L pH7.4的PBS中透析72 h，每隔6 h換透析液1次。 冷凍干燥后于-2(TC保存。
(2) MC-LR-OVA檢測(cè)抗原的合成
用混合酸酐法完成MC-LR與載體蛋白OVA的交聯(lián)，合成MC-LR-OVA完 全抗原作為檢測(cè)抗原。合成方法如下
一份含有0.25 mg MC-LR的殘余物加入0.5 mL 1,4-dioxane (二噁烷)，振 蕩使其溶解，再加入7iaL氯甲酸異丁酯和12^iL三丁胺，將此混合物輕微振蕩 然后在4'C下保持30min。 0.9 mg OVA溶于3 mL碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0)中。 將上述MC-LR溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4匸輕微攪拌4h，整個(gè)過
7程維持pH在9.0。然后，將混合物于fC下在0.1 mol/LpH7.4的PBS中透析72 h，每隔6h換透析液l次。冷凍干燥后于-20。C保存。
2、通過一般的單抗制備過程制備MC-LR單抗
實(shí)施例2:瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的活化
用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠Sepharose 4B。溴化氰法活化效果好、偶聯(lián)率高、 對(duì)抗體影響小，活化過程如下
(1) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30 mL水分兩次洗滌后 抽干，加少量的O.l mol/LpH8.3的NaHC03洗滌，立即轉(zhuǎn)入100 mL燒杯中， 冰浴下緩慢攪拌。
(2) 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取1 g溴化氰，加水10 mL溶解，然后分批倒入Sepharose 4B中，邊加邊攪拌，同時(shí)測(cè)pH值，通過滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5 左右。待溴化氰完全反應(yīng)完全，pH基本保持不變，即可停止攪拌。
(3) 將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150 mL冷的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03抽洗。
實(shí)施例3、 MC-LR單抗IAC的制備
1 、 MC-LR單抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B親和吸附劑的制備
制備MC-LR單抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B親和吸附劑的操作步驟如下
(1) 偶聯(lián)
將上述制備純化好的MC-LR單抗置于pH 8.3含有0.5 M NaCl的0.1M NaHC03緩沖液的偶聯(lián)緩沖液中透析12 h。將上述活化好的Sepharose 4B凝膠置 于砂芯漏斗中用偶聯(lián)緩沖液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR單抗溶液中進(jìn)行偶 聯(lián)，紫外掃描監(jiān)控偶聯(lián)過程。用5倍體積以上的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的抗 MC-LR單抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物。收集全部的洗脫液，通過測(cè)定其蛋 白質(zhì)的含量計(jì)算未偶聯(lián)上MC-LR單抗的量。
(2) 封閉活性基團(tuán)
將瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入5倍體積pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩沖液中，保持2h，以封閉瓊脂糖凝膠中多余的活性基團(tuán)。
(3) 洗滌
歩驟(2)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH 4.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸緩沖液和5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩沖液洗滌，此洗滌過程重復(fù)三次。然后用5倍偶聯(lián)復(fù) 合物體積的PBS洗滌兩次。
(4) 防腐處理
步驟(3)制備好的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物如需放置一段時(shí)間，應(yīng)使用含有 1/10000疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡，然后瀝去多余的溶液后放入包裝袋或瓶中在
84。C中密閉保存。
2、柱子的填充、保存與再生
(5) 裝柱
將步驟(3)或(4)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在負(fù)壓下用PBS將凝膠壓緊，即制成MC-LR單抗IAC。
(6) 保存
瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物或填充好的MC-LR單抗IAC切勿冷凍，保存在4°C
的冰箱內(nèi)。
(7) 柱的再生
柱使用后，用4-10個(gè)柱床體積pH8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl緩沖 液，和用4-10個(gè)柱床體積pH4.5含0.5 MNaCl的0.1 M醋酸鈉緩沖液輪流清洗 IAC兩次，再用PBS緩沖液充分平衡IAC后保存在4X:冰箱內(nèi)供下次使用。
實(shí)施例4:藍(lán)藻樣品中MC的檢測(cè)
1、 藍(lán)藻樣品的采集
藍(lán)藻樣品是取自太湖的藍(lán)藻水華，取樣時(shí)間是2007年6月上旬。采集的藍(lán) 藻水華經(jīng)晾曬干燥后，粉碎并過100目篩，干燥藻粉室溫干燥保存。
2、 藍(lán)藻樣品前處理
取O.l g干藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室溫下置于超聲波細(xì)胞破碎儀中 提取30min， 3000 rpm離心10min，收集上層清液，沉淀再抽提兩次(條件同 前)，合并上清液并過濾。濾液減壓濃縮至少于l mL，加10mL去離子水后， 過SPE柱富集毒素(過柱前SPE柱分別用2mL純甲醇、2 mL去離子水活化處 理)。待樣品全部吸附，分別以5 mL去離子水、5 mL 10%的甲醇水溶液沖洗SPE 柱后用5 mL純甲醇洗脫柱上毒素。洗脫液用甲醇定容至5 mL，取10 加1 mL 去離子水后過IAC (使用前柱子用2mL純甲醇、2mL去離子水活化)，IAC用 2mL蒸餾水洗后用5 mL純甲醇洗脫。洗脫液減壓蒸干，殘留物用lmL甲醇溶 解后進(jìn)LC-MS分析。
3、 儀器檢測(cè)條件
流動(dòng)相A: 20%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B: 80%乙腈水溶液(含 0.1%甲酸)。線性梯度洗脫程序0 15min: 20°/。 50%B， 15 20min: 50% 100%B， 20 30min: 100% 20%B，其余為A。色譜柱為SunFire C18柱(150 mmx2.1 mm, 5,)，柱溫30 °C,流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 jiL，紫外-檢測(cè) 器200-400 nm。
電離方式電噴霧電離源，正離子模式(ESI+);離子源溫度12(TC;脫溶
劑氣(N2)溫度30(TC，氣體流速300L/h;噴霧電壓4.5kV，錐孔電壓45V; 掃描范圍m/z300 1200。質(zhì)譜條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行優(yōu)化。4、 SPE柱富集與IAC凈化效果比較
圖1 3分別為MC-RR和MC-LR標(biāo)樣及SPE和IAC凈化藻樣的總離子流 色譜圖、SPE和IAC凈化藻樣中MC-RR和MC-LR的SIR色譜圖。從圖1中可 以看出，在總離子流色譜圖上，MC-RR和MC-LR能得到較好的分離。藻樣提 取液只經(jīng)過SPE柱富集(樣品l)，會(huì)保留大量雜質(zhì)，其中對(duì)MC-LR的干擾較 大。經(jīng)過IAC進(jìn)一歩凈化(樣品2)，能除去絕大部分雜質(zhì)。
在選擇離子(SIR)模式下，MC-RR能得到較好的分離(圖2)。藻樣提取 液只經(jīng)過SPE柱富集(樣品1)，雖然仍保留有雜質(zhì)，但對(duì)MC-RR的干擾不大。 經(jīng)過IAC進(jìn)一步凈化(樣品2)，在SIR模式下色譜圖上基本不顯示雜質(zhì)。定量 結(jié)果也表明，樣品1和2的結(jié)果基本一致，說明MC-RR的測(cè)定只用SPE柱富 集就能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。
但從圖3中可以看出，SIR模式下，只經(jīng)過SPE柱富集(樣品l)，雜質(zhì)對(duì) MC-LR的干擾嚴(yán)重，經(jīng)過IAC進(jìn)一步凈化(樣品2)，基本上能除去雜質(zhì)。定量 結(jié)果也顯示，樣品1和2的結(jié)果偏離很大，并且樣品l的重復(fù)性較差，說明雜 質(zhì)能顯著影響MC-LR的測(cè)定結(jié)果。
5、 實(shí)際藻樣的檢測(cè)
采用建立的方法，對(duì)2007年6月上旬收集的太湖不同地區(qū)的藍(lán)藻干粉樣品 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在所有樣品中均檢出MC-RR和MC-LR兩種藻毒素，干 重含量分別在0.212 0.331mg/g， 0.076 0.098 mg/g。
權(quán)利要求
1、一種微囊藻毒素-LR單抗免疫親和柱的制備方法，其特征是(1)用水溶性碳二亞胺法制備微囊藻毒素-LR與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)物，以下簡(jiǎn)稱MC-LR-BSA，微囊藻毒素-LR簡(jiǎn)稱MC-LR，用MC-LR-BSA作為免疫原，用混合酸酐法制備MC-LR與載體蛋白OVA的偶聯(lián)物，以下簡(jiǎn)稱MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作為檢測(cè)抗原，通過免疫方法獲得MC-LR單抗；(2)瓊脂糖凝膠Sepharose4B的活化用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠Sepharose4B，活化過程如下(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分兩次洗滌后抽干，加少量的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3洗滌，立即轉(zhuǎn)入100mL燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；(b)在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，邊加邊攪拌，同時(shí)測(cè)pH值，通過滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反應(yīng)完全，pH保持不變，停止攪拌；(c)將活化的Sepharose 4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3抽洗；(3)MC-LR單抗免疫親和柱的制備將MC-LR單抗與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B偶聯(lián)得到的親和吸附劑，填充入柱中得到MC-LR單抗免疫親和柱，簡(jiǎn)稱IAC，操作步驟如下(d)偶聯(lián)將上述制備純化好的MC-LR單抗置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3的偶聯(lián)緩沖液中透析12h；將上述活化好的Sepharose4B置于砂芯漏斗中用偶聯(lián)緩沖液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR單抗溶液中進(jìn)行偶聯(lián)，紫外掃描監(jiān)控偶聯(lián)過程；用5倍MC-LR單抗溶液體積以上的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的MC-LR單抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物；收集全部的洗脫液，通過測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量計(jì)算未偶聯(lián)上MC-LR單抗的量；(e)封閉活性基團(tuán)將瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入5倍體積pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl緩沖液中，保持2h，以封閉Sepharose4B中多余的活性基團(tuán)；(f)洗滌步驟(e)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物依次用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸緩沖液和5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液洗滌，此洗滌過程重復(fù)三次；然后用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的PBS洗滌兩次；(g)防腐處理步驟(f)制備好的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物如需放置一段時(shí)間，應(yīng)使用含有1/10000疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡，然后瀝去多余的溶液后放入包裝袋或瓶中在4℃密閉保存；(h)裝柱將步驟(f)或(g)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在負(fù)壓下用PBS將凝膠壓緊，即制成MC-LR單抗IAC；(i)保存瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物或填充好的MC-LR單抗IAC切勿冷凍，保存在4℃的冰箱內(nèi)；(j)IAC的再生IAC使用后，用4-10個(gè)柱床體積pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液，和用4-10個(gè)柱床體積pH4.5含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉緩沖液輪流清洗IAC兩次，再用PBS緩沖液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱內(nèi)供下次使用。
2、權(quán)利要求1所述方法制備的MC-LR單抗IAC的使用方法，其特征是(1) 采集的藍(lán)藻水華經(jīng)晾曬干燥后，粉碎并過100目篩，干燥藻粉室溫干 燥保存；(2) 藍(lán)藻樣品前處理取O.l g千藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室溫下置于超聲波細(xì)胞破碎儀中 提取30min， 3000 rpm離心10 min，收集上層清液，沉淀再重復(fù)抽提兩次，合 并上清液并過濾，濾液減壓濃縮至少于1 mL，加10mL去離子水稀釋；SPE柱 先分別用2mL純甲醇、2mL去離子水預(yù)處理；稀釋后的濾液過SPE柱富集； 再分別用5 mL去離子水、5 mL 10%的甲醇水溶液沖洗SPE柱后用5 mL純甲醇 洗脫柱上藻毒素；IAC使用前先用2 mL純甲醇、2 mL去離子水預(yù)處理；洗脫 液用甲醇定容至5mL，取10pL，力tU mL去離子水后過IAC; IAC用2 mL蒸 餾水洗后用5 mL純甲醇洗脫，洗脫液減壓蒸干，殘留物用lmL甲醇溶解后進(jìn) LC-MS分析。
全文摘要
一種微囊藻毒素-LR(MC-LR)單抗免疫親和柱(IAC)的制備和使用方法，屬于免疫親和層析及微囊藻毒素(MC)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所研制的IAC是將MC-LR單抗固定于柱中，通過藍(lán)藻樣品的溶劑提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC凈化，然后進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量測(cè)定，能得到MC-LR和MC-RR含量的準(zhǔn)確結(jié)果。只用SPE凈化，不用IAC凈化，雜質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明建立的方法能應(yīng)用于水樣、其它藻類及類似的生物樣品中MC的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101446576SQ20081024251
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
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