專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫 氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核 酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別
診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)
申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié) 晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) +氨離子(朋4+)，此反 映過程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測(cè)定此波長(zhǎng)處吸 光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無(wú)法用一般醫(yī)院 的可見光分析儀測(cè)定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定腺 苷脫氨酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫 氨酶診斷試劑盒，釆用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng) 生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨 肌苷+磷酸根 5'核苷酸酶肌苷單磷酸+水 肌苷單磷酸+氨+輔酶鳥苷單磷酸還原酶 鳥苷單磷酸+
還原性輔酶
這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)5， 核苷酸酶(5'Nucleotidase; EC 3.1.3.5)、鳥苷單磷酸還原酶(GMPreductase; EC 1.7丄7)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應(yīng)產(chǎn)生肌苷，再通 過(偶)聯(lián)合5，核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定 還原型輔酶在340nrn處吸光度上升的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的 速度，可以測(cè)算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú) 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
5'核苷酸酶 6000 U/L
鳥苷單磷酸還原酶 8000 U/L
腺苷 8 mmol/L
磷酸根 20 mmol/L氯化銨 3 mmol/L
本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸 根、氯化銨。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、磷酸根、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶。 輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸根、氯化銨在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、磷酸根、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶。 輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸根、氯化銨在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水
6溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
3 mmol/L
5'核苷酸酶 6000 U/L
鳥苷單磷酸還原酶 8000 U/L
腺苷 8 mmol/L
磷酸根 20 mmol/L
氯化銨 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左 右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷 8 mmol/L
磷酸根 20 mmol/L
氯化銨 3 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
5'核苷酸酶 6000 U/L
鳥苷單磷酸還原酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
《0.1,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大
約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃
度大小。實(shí)施例三
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括-
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷 8 mmol/L
磷酸根 20 mmol/L
氯化銨 3 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
鳥苷單磷酸還原酶 8000 U/L 試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
5'核苷酸酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反 應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右， 理論K值2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0005;吸光 度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)500 U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過±4%;試劑測(cè)試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年;
——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨肌苷+磷酸根 5’核苷酸酶 肌苷單磷酸+水肌苷單磷酸+氨+輔酶 鳥苷單磷酸還原酶 鳥苷單磷酸+ 還原性輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2.-種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括20--500 mmol/L—4000 mmol/L 一 6 mmol/L1000-1000—緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶5'核苷酸酶 鳥苷單磷酸還原酶腺苷 磷酸根 氯化銨試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。-80000 U/L ■00 U/L —50 mmol/L ——50 mmol/L —50 mmol/L
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸 根、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸 根、氯化銨組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、磷 酸根、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶、鳥苷單磷 酸還原酶組成。輔酶、5，核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸根、 氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷、磷酸 根、氯化銨組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、磷 酸根、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶組成。輔酶、5'核苷酸酶、鳥苷單 磷酸還原酶、腺苷、磷酸根、氯化銨在試劑l、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1^000 mmol/L或0.1 %-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、磷酸根、氯化銨、5′核苷酸酶、鳥苷單磷酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/25GK101609012SQ20081012282
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司