專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫 氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核 酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別
診斷，重癥聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鑒別的重要診斷標志。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據
申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結
晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) +氨離子(NH/)，此反 映過程生成的肌苷會在波長為265ran處顯現，因此可以通過測定此波長處吸 光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院 的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣 應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺 苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現該方法的腺苷脫 氨酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨
氨+丙酮酸+過氧化氫甘氨酸氧化酶丙氨酸+水+氧 丙氨酸+水+輔酶丙氨酸脫氫酶氨+丙酮酸+還原型輔酶
這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)聯甘 氨酸氧化酶(glycine oxidase; ECX.X.X.X)、丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.3.19; EC 1.41.1)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應產生氨，再通過(偶) 聯合甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔 酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可 以測算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘氨酸氧化酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 8000 U/L
腺苷 5 mmol/L
丙酮酸 12mmol/L 過氧化氫 7 mmol/L本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮 酸、過氧化氫。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶。 輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其
輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘氨酸氧化酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 8000 U/L
月泉昔 5 mmol/L
丙酮酸 12mmol/L 過氧化氫 7 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約l分鐘左 右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。 '實施例二
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷 5 mmol/L
丙酮酸 12 mmol/L
過氧化氫 7 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
甘氨酸氧化酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37-C，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大
約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃
度大小。
實施例三本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷 5 mmol/L
丙酮酸 12 mmol/L
過氧化氫 7 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L
試劑
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
:試劑，可以直接使用。
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
甘氨酸氧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」
測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反 應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應 方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nrn吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0005;吸光 度時間反應曲線應呈直線上升；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可達500 U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重 復性)的變異系數(CV)《2%;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年;
——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣 應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨氨+丙酮酸+過氧化氫 甘氨酸氧化酶 丙氨酸+水+氧丙氨酸+水+輔酶 丙氨酸脫氫酶 氨+丙酮酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20-500 mmol/L穩(wěn)定劑1-4000 mmol/L輔酶1 6 mmol/L甘氨酸氧化酶1000——腦00U/L丙氨酸脫氫酶1000——80000 U/L腺苷1- 50匪ol/L丙酮酸1- 50mmol/L過氧化氫1- 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、 過氧化氫組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、 過氧化氫組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮 酸、過氧化氫組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶組成。輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、過氧 化氫在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、 過氧化氫組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮 酸、過氧化氫組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成；試 劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶組成。輔酶、甘氨酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫在試劑l、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。
6. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、丙酮酸、過氧化氫、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101609009SQ20081012282
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司