專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫 氨酶活性濃度的方法，屬于檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核 酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別
診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù) 申請(qǐng)人:了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié)
晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) +氨離子(NH/),此反 映過程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265mn處顯現(xiàn)，因此可以通過測(cè)定此波長(zhǎng)處吸 光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院 的可見光分析儀測(cè)定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián) 法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時(shí)， 本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不 僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨
過氧化氫+氨+ 2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水 谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨+ 2-酮戊二酸+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、谷氨酸脫氫酶 (Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4.1.2、 EC L4丄3、 EC 1.4.1.4)酶促反應(yīng)連 續(xù)監(jiān)測(cè)法。腺苷脫氨酶作為作用酶，功能為將腺苷酶解產(chǎn)生氨。谷氨酸氧化
酶能將氨作用成為谷氨酸；谷氨酸脫氫酶作為循環(huán)酶它的酶促作用使谷氨 酸產(chǎn)生氨，使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，同時(shí)不斷地產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酸脫
氫酶又作為顯色酶，在谷氨酸底物作用下，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè) 算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
腺苷 6 mmol/L
過氧化氫 5 mmol/L
2-酮戊二酸 5 mmol/L
本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧 化氫、2-酮戊二酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸在試
劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
月泉昔 6 mmol/L
過氧化氫 5 mmol/L
2-酮戊二酸 5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃
度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶 腺苷
過氧化氫 2-酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑 1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大 約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
100讓ol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃
度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括-試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶 腺苷
過氧化氫 2-酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷氨酸氧化酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反 應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃 度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果一一空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0006;吸光 度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(ID0.99)線形范圍可達(dá)500 U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過±5%;試劑測(cè)試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達(dá)0.005 ± 0.002 AA/min/U/L;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度 高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨過氧化氫+氨+2-酮戊二酸 谷氨酸氧化酶 谷氨酸+氧+水谷氨酸+水+輔酶 谷氨酸脫氫酶 氨+2-酮戊二酸+ 還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L輔酶卜6 mmol/L谷氨酸氧化酶1000———80000 U/L谷氨酸脫氫酶1000——-80000 U/L腺苷卜-50 mmol/L過氧化氫l-50 mmol/L2-酮戊二酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化 氫、2-酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化 氫、2-酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、 過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、 谷氨酸脫氫酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、 過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶組成。輔酶、谷氨酸氧 化酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l一"4000mmol/L或0.P/。-100Q/()體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、過氧化氫、2-酮戊二酸、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101609011SQ20081012282
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司