專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的方法
環(huán)介導(dǎo)紫顯擴(kuò)增-微孔板雜魏米電化雜測繊球菌的方法獄繊本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)^T增(LAMP) M與納米fei己基因序列電化學(xué)分析技7(^檢測!^^lt屬特異性DNA序列的方法，即環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增嶺 L^^^米電化^^PM^菌的方法。 背景獄Ig^^菌(streptococcus suis)是一種廣泛分布預(yù)乳動(dòng)物和人體內(nèi)的溶血性^^菌，卵圓形，大小 為O. 7—1. 4 ，往^^兩個(gè)以上的菌#^^^成 。革蘭R^陽生。i^^g^W雖，對千燥、 濕^ ，常用消毒I^T將其殺死。在動(dòng)辦幾W^;力斷轎卩外gW:^f七誘導(dǎo)下，i^0會(huì)引發(fā)豬 ^^菌病，屬國家規(guī)定的二類動(dòng)物賺，是一種人畜共患傳染病。彭l^急性出血'l4Pfofl癥、心內(nèi)膜炎、 腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、哺乳條下痢和孕豬,等。離球菌麟不僅聰豬艦翻市炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎 及心內(nèi)膜炎，而且可li^寺定人群魏^E亡，危害嚴(yán)重。在lfg^上，急鵬^^^菌病以腦炎和tt 癥為雄，慢鵬以關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、淋巴結(jié)鵬中為,。本病4四執(zhí)可姓，以冬春季多發(fā)， 不同年,可;t^，病豬和病愈帶菌豬是本病的主對專 ，病原^^于各臟器、血液、肌肉、關(guān)節(jié)和 Mtl中，主要經(jīng)消雌和損傷的 。病源性^^e菌也可以ii^^，引m^病。病魚眼球明顯突出，其周圍充血，鰓蓋內(nèi)頂^lflLMr^g燃出血，夏季高水溫時(shí)病^Mffi3i。婦K溫2or以下時(shí)，除J^^l^M較綴歐卜，各鰭和體表 敏，Mi^gl^往會(huì)有l(wèi)lML布疫^^爛。解剖魚體，！iit^炎艦，幽門垂、肝、腎、脾等 ^出血。病魚絲t欲，離^t游于水面^^于水底，數(shù)日內(nèi)即死亡。 通綱IJ^^菌,蹄三沐1.生敏化鑒定技術(shù)，該微時(shí)，操條貞，不能滿鵬害防治的需要；2. ^^吸附i離，3潔^^gjS法(PCR法)，跡^ttr照傷法腿、靈敏，但需要昂貴的pcR儀。目前尚未j,環(huán)介導(dǎo)^r增方法與電化學(xué)分析技7i^ffl檢測^^s的方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的^^納米硫化鎘敏己 "序列微孑1^^交電化學(xué)分析與環(huán)介導(dǎo)# "增糊檢測豬 麟謝屬特異性基因w^法，即環(huán)介導(dǎo)^ "增嶺孔^^窮內(nèi)米電化^#測 ^菌，以剋野見有技術(shù)的不足，從而為^^菌的檢測^i，單易行的'I^I方法，^i^，品、t^斗和生物體內(nèi)^^^菌本發(fā)明的主要原鵬(1) !ft^設(shè)it"組可以i鄉(xiāng)鵬DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)引物(上游內(nèi)引 物和下游內(nèi)弓物)和兩個(gè)外弓胸(上嫩卜引物和下微卜弓胸)，內(nèi)引^^含耙DNA的!BC鏈mSX能 (2)其中一個(gè)內(nèi)引救信先和耙DNA雜交，隨后的^g換DNA合自具有高度OT換活性的DNA聚5娜的參與下由^h外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA，荊乍為由雜效鵬的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外 引物啟動(dòng)的DNA合j^fc產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)弓物以原始執(zhí)DNAm^fc啟繊 置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一^f 的由兩倍莖長度的，DNA; (4)在^M斜牛 下，內(nèi)弓物以莖環(huán)DNA為微，ilil^g娜成多^^有耙DNAfifim列的執(zhí)DNA，在一小時(shí)內(nèi) 該循環(huán)鵬可使耙DNA累積剷109拷貝;擴(kuò)增的/^t^微孑Lfei:固定后與納米硫化鎘feia的mf"序列發(fā) 生好雜交鵬而結(jié)合，利用強(qiáng)鵬躲頓鏈DNA掘雜子溶解后細(xì)高靈敏的電化學(xué)分析旅測 定溶解的鏑離子'產(chǎn)生的電化學(xué)分析信號與擴(kuò)增，的鵬目關(guān)，進(jìn)而翻電化雜測檢測^^菌 種屬特異性DNA序列的目的。本發(fā)明涉及的納米硫化錄CdS)feia探針序列微 版固定電化學(xué)分析與環(huán)介導(dǎo)^M擴(kuò)增連用檢測豬 ^^菌W^法，其中的淑訴嗨液包括如下(1) - (4):(1) 環(huán)介導(dǎo)雛擴(kuò)增(LAMP)鵬液包括lOxThermopol a^M沖液、300—500 Mmol/LdNTP、 2—4mmol/L硫,、0.8—1.2nmol/L上 游內(nèi)引物、0.8—1.2 Mmol/L下游內(nèi)弓胸、0.2—0.3 pmol/L上微卜弓,、0.2—0.3 pmol/L下嫩卜弓物和1 —1.5mol/L甜魏；1U/mLUNG酵；其中l(wèi)OxThermopol S^^沖液含有200mmol/LpH8.8的三縫甲 基MS甲烷一&^、 100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫,、20mmol/L硫m^和1 ^曲^MX—100;其中，上游內(nèi)引物5-TGArcnTCTrGTCACCTGTrCCArCTGTCCGTArGGATGTrC-3、下游內(nèi)弓l物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGAnTCAACAACAGCTTCT隱3、上齢卜引物5-CGTGCGCnAAArTCTATGC-3、下微卜弓物5- GAGAAAITCCITCACCGTAC -3;(2) BstDNA聚德8U/mL;J^盼混"^tldNTP內(nèi)的四種脫fl^糖核酸的質(zhì)量比為dinP:dAIP:dGTP:dCIP=2:l:l:l0(3) J^的環(huán)介導(dǎo)^W增a^液敏23ML的劇趙賊為2.5pLl(KIlieimopolMi^夷沖液、1.0 nL10mmol/LdNTP (四種脫ft^糖核酸階混^tl)、 1.0pL20MmoI/L上游內(nèi)弓l物(FIP)、 1.0ML20Mmol/L 下游內(nèi)引物(bip)、 0.25nL20Mmol/L上微卜弓嫩(F3)、 0.25^iL20Mmol/L下微卜弓卿(B3)、 0.5mL100 mmol/LMgS04、 12單1.511101^甜^^口爭鵬0 (鄉(xiāng)雙蒸冰)。(4) ^^^菌種屬特異性基因(recA)微序列的納米硫化鎘(CdS)曙Mf序列iHB液，其帝恪 方法如下將3.84mL,乙酸加到50mL濃度為0.w.4mmol/L的氯化鎘(002 )溶液中混合均勻，用0.5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH歡10.5-11.5，通氮?dú)饩t2545 min后，在勸J^^和氮?dú)庾鱿孪驊?zhàn)混合液中緩漫滴加1.34mmol/L的硫化鈉(Na2S)溶液2540mL，滴加完畢后，^^^^24h，混合液 逐船也^m色，即可得到納米CdS溶膠；再取5.0mL納米CdS溶麟心純化，7乂船分散于2.0mL 水中，加入100 mL 40.輔.0 mmol/L乙教3-二甲基氨M^)^二3a^k麟(EDC)、 100 mL 40.0<60.0 mmoI/LN隱^^aWl安(NHS)及O.l mmo!/L徽序列(5'"GATTTCAACAACAGCTrCT-3')，室溫 下 15-20h， ^gj3Z驗(yàn)1,r/minTM心2545min，用PBS溶液洗滌多次，再分散于PBS溶液中， 得到含有硫徽序列的納米CdS-微序列硫液，于-2t下保存?！额Dj^環(huán)介導(dǎo)^rms^檢測it^^菌的方法，依次包括下列步驟(1)陽(3):(1) 待檢樣品腿微的提恥提取樣品核酸，提取方法不限定，只要會(huì)^^證其中提取的DNAOD26028o會(huì)嫩超lM4l.6"2.0范圍 內(nèi)即可，^iiSlJ救l(MOOn^ML范圍內(nèi)即可以。(2) 進(jìn)倆介導(dǎo)^r增破久皿有23 pLLAMP M^液的aS管中加入1 mL上述待檢樣品,dna和0.5 pL的UNG酶， 于疸^7K浴上50。C腿3min，于恒溫95 。C驢3—5min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在鵬管中加入1 pLBstDNA聚娜；C. 于直溫60—65。C方爐45—90min;D. 將^jg調(diào)到80-95 。C，鵬3—5min后中ihgjM躬杯介導(dǎo)^T增鵬的擴(kuò)增,-^^ 節(jié)幅特異性基因(recA)的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。(3) J^X鏈目標(biāo)序列繊所得的單鏈目標(biāo)序列與納米CdS^t"序列硫液中,己微序列雜 頓進(jìn)行電化翔定將J^X鏈目標(biāo)序列在100 。CtK浴中穀弗10min，然后在冰浴中'I^I7賴卩得到單鏈目標(biāo)序列，取100 pL單鏈目標(biāo)序列的溶^M微孑版中，37<€ ^W過夜，再于60^千燥箱中0,5-L5h蒸干，用含有1% 吐溫20的磷離緩贈(zèng)液(PBS"瘠鵬去未固定的單鏈目標(biāo)序列；再取100 jiL繊己微序列的納 米CdS^f序列t就輕固定了單鏈目標(biāo)序列的微孑版中，45^水^^交2040min， ^!^^tf雙 鏈DNA，然后取出微孑,PBST、 PBS和水各沖冼5次，每次一倂中，以清鵬去除去未雜交的豐斜己 微序列。3紛L中殘留的溶^^輕拍出，取100ML1.0moI/L的5g^溶液^A射L，靜置5min，氧化溶 解雜^tl雙鏈DNA上的納米CdS，然后狄20 pL 5.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH輕中性；再取 150uLpH4.7含1.8Xl(Mmol/L汞離刊Hg2+)的,-lt^(NaOAoHOAc)加入微孑版中，直接以微 孑L為^Mfe，以玻碳電極為工作電極，在-1.4V下 ^只120-180s，靜止5s后從-1.2V向-0.6V溶出 掃描，在-1.01 V處出現(xiàn)的陽極溶出峰電流即為領(lǐng)糧信號，此信號即為豬^^菌,異性基因的響應(yīng)信號，荊乍為環(huán)介導(dǎo)等尉廣增嶺孔fe^窮內(nèi)米電化^^測^^^的依據(jù)。進(jìn)行同位 陽極溶出伏安法 4頓的電化學(xué)工作站的其它織體如下電位增量0.004 V，振幅0.05V，脈沖繊0.06 3，采樣驗(yàn) 0.02 s，脈沖周期02s。下列織例進(jìn)"^i兌明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。 鄉(xiāng)例l按下歹鵬方制乍納米硫化鎘撒序列硫漲將3.84 mL統(tǒng)基乙働口到50 mL濃度為1.0 mmol/L的CdCl2溶液中混合均勻，用0.5 mol/L NaOH溶 液調(diào)節(jié)混合液的pH働ll，通氮?dú)怊?0min后，在動(dòng)^^和氮?dú)馕⑾孪騄^混合液中緩漫滴加 1.34mmol/L的Na2S溶液30mL。滴加完畢后，^^24h，混合 1^^^色，即可得到納米 CdS溶膠。取5.0 mL納米CdS溶麟心純化，水船分散于2.0mL水中，力口入100 pL 50.0 mmol/LEDC、 100 ML50.0mmol/LNHS及0.1mmo]/LMf序列，室溫下,18h， i^gj^t^ l畫i/minT^心30min，用PBs溶液洗滌多次，再分散于pbs溶液中，得到含有feia徽序列的納^i^f七鎘^f序列feia液，于-2t下保機(jī)用。按照以下辦進(jìn)行檢測(1) Mt#品DNA的提取 ^^ GBT 19495.3-2004方^^取樣品的DNA。(2) 進(jìn)fi1^^菌EPSPS基因環(huán)介導(dǎo)^r增^^a. 23 mLLAMP HJ^液的鵬管中加入1 ml待檢微dna，和0.5 的ung酶，于恒溫 7K浴上50。C腿3min， 95。C腿5min,立即置于冰上lmin;B. 在破管中加入l pLBstDNA聚娜；C. 于恒^7K浴上65 。C體1小時(shí)；D. 將水浴調(diào)到80'。，鵬3111]11后中11^^得到環(huán)介導(dǎo)^^增鵬的擴(kuò)增 /- a^^薪中屬特 異性基因(recA)的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。(3) 微孑,交電化雜測將J^X鏈目標(biāo)序列在100 。CtK浴中蕭弗10min，然后在冰浴中'l^im卩得到單鏈目標(biāo)序列，取100 HL單鏈目標(biāo)序列的溶^M微孑版中，37 孵育過夜，再于60T千燥箱中l(wèi)h蒸干，用含有1%吐溫 20的PmSM沖溶液(PBST) 、mit去未固定的單鏈目標(biāo)序列;再取100ML ^t射己^h序列的納米CdS陽微序列^i己輕固定了單鏈目標(biāo)序列附微孑版中，45X:7乂m^交30 min， 4^^^t/雙鏈DNA， 然Jg取出微孔OT PBST、 PBS和7K各i^冼5次，每次一併中以除去未固定的^H己W"序列，)I狩L中殘 留的溶^g拍出，取100 pL 1.0mol/L的石ft^溶液SA射L靜置5 min，氧化溶解雜^tf雙鏈DNA 上的納米CdS，然后SA 20 mL 5.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH iSS中性；再取150 nL pH 4.7含 1.8Xl()4mol/L汞離節(jié)Hg2"的醋酸-醋,(NaOAc-HOAc)加入微孑版中，直接以微孑l^h時(shí)微孔為鵬 化柳池，以繊電極為工作電極，在-1.4V下l5^只150s，靜止5s后從-1.2V向-0.6V溶出掃描， 在-1.01 V處出現(xiàn)的陽極溶出峰電流即為測量信號，此信號即為豬^^菌屬特異性基因的響應(yīng)信號，并 作為環(huán)介導(dǎo)^T增溜孑L^^^I米電化^^測^^0的依據(jù)。進(jìn)行同位 陽極溶出伏安齒^的 電化學(xué)工j憐的其它織體如下電位增量0.004V，振幅0.05V，脈沖繊0,06s，釆樣驗(yàn)0.023， 脈沖周期0,2s。 鄉(xiāng)例2按下歹歸制微頂ilW薪中屬特異性基因recA的環(huán)介導(dǎo)離擴(kuò)增淑愴(1) lamp鵬液含有2.5 pL lOxThermopol Mi^劍液、1.010mmol/LdNTP、 1.0 ^L20Mmol/L上游內(nèi)引物(F1P)、 1.0nL20Mmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25nL20Mmol/L上嫩卜引物(F3)、 0.25nL20nmol/L下微卜引物 (B3)、 0.5ML100mmol/LMgSO4、 12.5ML2mol/l甜魏、1U/jjLUNG醒1 U4iL和4nLddH20 。 其中戶腿的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上嫩卜引物、下微卜引物同上。(2) BstDNA聚鏽B: 8U/mL; 離照以下辦進(jìn)行檢測(1) 樣品DNA的提取A取200mg待檢樣品，置于L5mL離心管中，用臺式離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清瓶B. 力口入1.5mL滅菌)5^7K，混勻，用臺式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清液；C. 力口入150ML滅菌雙蒸水，混勻，100。C沸水浴中力口熱15min;D. 用臺式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心5min，IU:清至一個(gè)新的1.5mL離心管中，即為待檢微DNA;(2) 進(jìn)行，沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)^r增a^A. 23pL LAMP ^gj^液的鵬管中力口入1 mL待檢豐鎌DNA，和0.5 的UNG酶，于恒溫 7K浴上50。C艘3min， 95。C腿5min，立即置于冰上lmin;B. 在^S管中力口入1 pLBstDNA聚娜；C. 亍恒船K浴上65 。C腿1 h;D.將7]C浴調(diào)到80°C， Mi^3min后中ihSiS得到環(huán)介導(dǎo)^rmSiS的擴(kuò)增 ^tMi^薪中屬特 異性基因(recA)的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。 (3)銜鵬交電化雜測將±3*^鏈目標(biāo)序列在100 。C7K浴中煮沸10min，然后在冰浴中'鵬y賴瞎到單鏈目標(biāo)序列，取100 ^tL單鏈目標(biāo)序列的溶^M微孑版中，37 <€孵育過夜，再于60^千燥箱中1 h蒸干，用含有1%吐溫 20的磷ma緩沖溶液(PBST)清洗除去未固定的單鏈目標(biāo)序列。再取100pL創(chuàng)斜己微序列的納米CdS-Mf序列iH2^M固定了單鏈目標(biāo)序列的微孑版中，45^7乂^^交30min， ^^^t/雙鏈DNA， 然后取出微孔棚PBST、 PBS和水各沖洗5次，每次一併中。^l射L中殘留的溶^g拍出，以除去未 固定的feieW靜U，取IOO mL 1.0 mol/L的^^^iA祝L靜置5 min，氧化溶解雜^tl雙鏈 DNA上的納米CdS，然后^A20ML5.0mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH輕中性。翻同位頓陽極溶出 伏安法檢測微孑版中溶解的鎘離柳"的糧取150uLpH47含1.8X104mol/L汞離刊Hg^的醋 酸-lM(NaOAoHOAc)加入微孑版中，直接以微孔為^k，以臓電極為工作電極，在-1.4V下沉 積150s，靜止5s后從-1.2￥向-0.6￥溶出掃描，在-1.01 V處出現(xiàn)的陽極溶出峰電流即為測量信號， 此信號即為^^^菌屬特異性基因的響應(yīng)信號，荊乍為環(huán)介導(dǎo)^W增嶺孑U^^^米電化^^測, 球菌的依據(jù)。進(jìn)行同位^^陽極溶出伏安齒^的電化學(xué)工作站的其它皿i^a如下:電位增量0.004 V， 振幅0.05V，脈沖離0.06s，采樣寬度0.02s，脈沖周期(X2s。核苷,列表<iio>山東出入境檢驗(yàn)^S局檢驗(yàn);j^S技術(shù)中心<120>環(huán)介導(dǎo)^T增-微孑U^^^米電化^t測^^球菌的方法<160>4<210>1<211>43<212>DNA<213> AX序列<220><221>prim_bind<222>(1)...(43)<400>1屯atctttct tgtcacctgt tccatctgtc cgtatggatg ttc 4310<210>2<211>42<212>DNA<213> AX序列 <221> prim—bind <222>(1> (42) ,0>2acgttggtaa ggaaaccaag gatgatttca acaacagctt ct 42<210>3<211>20<212>DNA<213> AX序列<221>prim_bind々22>(1)...(20)<400>3cgtgcgctta aattdatgc 20<210>4<211>20<212>DNA<213> AI序列<221>prim_bind<222>(1)...(21)<400>4gagaaattcc ttcaccgtac 20<210>5<211>19<212>DNA〈13> AX序列<221>prim_bind<222>(1). (19)<400>5Gatttcaaca acagcttct 19
權(quán)利要求
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟以上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物在內(nèi)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增反應(yīng)物--待測豬鏈球菌種屬特異性基因的雙鏈目標(biāo)序列，將該雙鏈目標(biāo)序列在水浴中熱解成單鏈目標(biāo)序列后在微孔板上進(jìn)行固定，然后將納米硫化鎘對來源于豬鏈球菌種屬特異性基因的探針序列進(jìn)行標(biāo)記得到標(biāo)記探針序列，將該標(biāo)記探針序列與固定在微孔板上的目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交并進(jìn)行同位鍍汞陽極溶出伏安法的電化學(xué)測定。
2. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的 方法，其特征在于上述的兩對引物為上游內(nèi)弓l物5,- TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3，、 下游內(nèi)引物5'-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGATTTCAACAACAGCTTCT -3，、 上游外引物5，- CGTGCGCTTAAATTCTATGC -3，、 下游外引物5，- GAGAAATTCCTTCACCGTAC -3，。
3. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的 方法，其特征在于上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的試劑包括(1) 10xThermopo1反應(yīng)緩沖液、300 —500 pmol/L dNTP、 2 — 4 mmol/L硫酸鎂、 0.8 — 1.2pmol上游內(nèi)引物、0.8—1.2 pmol/L下游內(nèi)引物、0.2 — 0.3 nmol/L上游外引物、 0.2 — 0.3nmol/L下游外引物和1 — 1.5 mol/L甜菜堿；l U/nLUNG酶；其中l(wèi)OxThermopol 反應(yīng)緩沖液含有200 mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一 鹽酸、100 mmol/L氯化 鉀、100mmol/L硫酸銨、20 mmol/L硫酸鎂和1 %曲拉通X—100;(2) BstDNA聚合酶8U L
4. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的 方法，其特征在于上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)包括下列步驟(1) 待檢樣品DNA模板的提取提取待檢樣品DNA作為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的模板，其中提取樣品DNA的光密 度值OD26omo在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度在10-100 ng/^L之內(nèi);(2) 進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A.在裝有23pLLAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入l^L上述待檢樣品模板DNA，和UNG酶，恒溫50 。C放置3min后于恒溫95 。C放置3_5 min，立即置于冰上l一3min;B. 在反應(yīng)管中加入1 ^LBstDNA聚合酶；C. 于恒溫60 — 65 。C放置45 — 90 min;D. 將溫度調(diào)到80 — 95 °C，反應(yīng)3 — 5 min后中止反應(yīng)得到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 的豬鏈球菌種屬特異性基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。
5. 如權(quán)利要求1中所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌 的方法，其特征是上述的雙鏈目標(biāo)序列在水浴中熱解成單鏈目標(biāo)序列后在微孔板上進(jìn) 行固定，其步驟如下將擴(kuò)增產(chǎn)物--待測豬鏈球菌種屬特異性基因的雙鏈目標(biāo)序列在100 'C水浴中煮沸 IO分鐘，然后在冰浴中快速冷卻得到待測豬鏈球菌種屬特異性基因的單鏈目標(biāo)序列， 取100nL所得單鏈目標(biāo)序列的溶液至微孔板中，37 。C孵育過夜，再于60。C干燥箱 中0.5-1.5 h蒸干，用含有1%吐溫20的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液清洗除去未固定的 單鏈目標(biāo)序列，即得到固定了單鏈目標(biāo)序列的微孔板。
6. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的 方法，其特征在于上述的納米硫化鎘對來源于豬鏈球菌種屬特異性基因的探針序列進(jìn) 行標(biāo)記含有標(biāo)記探針序列的納米硫化鎘-探針序列標(biāo)記液，其步驟如下將3.84 nL巰基乙酸加到50 mL濃度為0.6-1.4 mmol/L的氯化鎘溶液中混合均勻， 用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值為10.5-11.5，通氮?dú)獬?5-45 min后， 在磁力攪拌下向上述混合液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加1.34 mmol/L的硫化鈉溶液25-40 mL，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌24h，混合液逐漸地變成黃色，即得到納米硫化鎘溶膠， 取5.0 mL納米硫化鎘溶膠離心，水洗后分散于2.0 mL水中，加入100 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽、100 pL 40.0-60.0 mmol/LN-羥基琥珀 酰亞胺及O.l mmol/L探針序列5'-GATTTCAACAACAGCTTCT-3'，室溫下攪拌15-20 h， 該反應(yīng)物在10000 r/in下離心25-45 min，用磷酸緩沖溶液洗滌多次，再分散于磷酸 緩沖溶液中，得到含有標(biāo)記探針序列的納米硫化鎘-探針序列標(biāo)記液，于-2 。C下保存 待用。
7. 如權(quán)利要求1中所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌 的方法，其特征是上述納米硫化鎘探針序列標(biāo)記液中的標(biāo)記探針序列與固定了單鏈目標(biāo)序列的微孔板上的單鏈目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交并進(jìn)行同位鍍汞陽極溶出伏安法的 電化學(xué)測定，其步驟如下取100 pL含納米硫化鎘標(biāo)記探針的雜交緩沖溶液至固定了單鏈目標(biāo)序列的微孔 板中，在45。C水浴中雜交20-40 min，得到雜交產(chǎn)物雙鏈DNA,然后取出微孔板，用 含有1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液和水各沖洗5次，每次一分鐘， 除去為雜交的除去未雜交的標(biāo)記探針序列，將微孔板中殘留的溶液輕輕拍出，取100 HL 1.0 mol/L的硝酸溶液注入微孔板各孔中靜置5 min，氧化溶解雜交產(chǎn)物雙鏈DNA 上的納米硫化鎘，然后注入20 5.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值到中性；取 150jiLpH4.7含1.8xlO—4mol/L汞離子的醋酸緩沖溶液加入微孔板中，直接以微孔板 上的微孔為微型化電解池，采用同位鍍汞陽極溶出伏安法檢測溶解的鎘離子的含量， 以玻碳電極為工作電極，在-1.4V下沉積120-180s，靜止5 s后從-1.2 V向-0.6 V溶出 掃描，在-1.01 V處出現(xiàn)的陽極溶出峰電流即為鎘離子的含量的測量信號，此信號即 為豬鏈球菌屬特異性基因的響應(yīng)信號，并作為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué) 檢測豬鏈球菌的依據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-微孔板雜交納米電化學(xué)檢測豬鏈球菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟以上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物在內(nèi)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增反應(yīng)物-待測豬鏈球菌種屬特異性基因的雙鏈目標(biāo)序列，將該雙鏈目標(biāo)序列在水浴中熱解成單鏈目標(biāo)序列后在微孔板上進(jìn)行固定，然后將納米硫化鎘對來源于豬鏈球菌種屬特異性基因的探針序列進(jìn)行標(biāo)記得到標(biāo)記探針序列，將該標(biāo)記探針序列與固定在微孔板上的目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交并進(jìn)行同位鍍汞陽極溶出伏安法的電化學(xué)測定，檢測出與豬鏈球菌種屬特異性基因相應(yīng)的鎘離子。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且使用方便。
文檔編號G01N27/48GK101324542SQ20081009398
公開日2008年12月17日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者偉 孫, 超 林, 奎 焦, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心