專利名稱：一種牛乳中a-乳白蛋白含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測乳中蛋白的方法，特別是一種檢測牛乳 中a-乳白蛋白含量的方法。屬于分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)沒有oc -乳白蛋白含量的檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 5413. 2 - 1997嬰幼兒配方食品和乳粉-乳清蛋白的測定。國外，相關(guān)國標(biāo)有DIN-10466 - 2001牛奶和牛奶 制品的全部蛋白中乳清蛋白含量的測定、DIN-10470 -1999牛奶和牛 奶制品的全部蛋白質(zhì)中乳蛋白含量和酪蛋白含量測定、DIN - 10472 -1996牛奶和乳制品總蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量測定.電泳 法。常用a -乳白蛋白的檢測方法是液相色譜法。該方法試驗步驟較 繁雜，檢測到出結(jié)果時間需3-4h。毛細管電泳儀是一類包括電泳、 色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分離技術(shù)，它能快速精確檢測出牛奶中的 摻假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、 糖、添加劑和其他小分子的含量。該方法操作筒便、準(zhǔn)確，檢測到出 結(jié)果時間^義為lh左右。目前，毛細管電泳4義的應(yīng)用前景非常廣泛。許多國際官方權(quán)威機構(gòu)，如FDA、 U.S. P、 CBER、 CDER等均已認可毛細管電泳方法。權(quán) 威機構(gòu)European Pharmacopoeia中認可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜 質(zhì)的CE測定；歐洲藥典中還認可促紅細胞生成素(EP0)的CE測定 等。它已成為化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物工程、藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的一個 常規(guī)科研工具。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是得到一種牛乳中a-乳白蛋白含量的檢測方法。本發(fā)明的一種檢測a-乳白蛋白含量的檢測方法，其中，包括如 下步驟1)將a-乳白蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含量 a-乳白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對多個溶液分別4企測后得到a-乳白蛋白 含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對樣品進行檢測，并得到檢測 結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到樣品中a-乳白蛋白的含量；其中，檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細管電泳分析儀。上述步驟1)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法如下配制a-乳白蛋白標(biāo) 準(zhǔn)溶液，在樣品緩沖液中溶解a-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為 lmg/ml 、 0.5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0.05mg/ml,制備4尋到 標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即得到 a-乳白蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測結(jié)果 按照如下方法計算按峰面積計算出平均校正因子。將樣品與緩沖液按照l: 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機l~10min,使用 毛細管電泳儀測定。上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖 液，優(yōu)選如下緩沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷石黃酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時添加 5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 4%。使用O. IM氫氧化 鈉調(diào)至pH值為8.5。上述的搖勻步驟采用旋渦混合器。上述高壓毛細管電泳分析的使用檢測參數(shù)如下毛細管電泳檢測 檢測的溫度控制在20-4(TC之間，毛細管柱直徑25 ~ 75 ii m、長度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓 力為0 lpsi，進樣時間為ls 20s，分離溫度為20~40°C,工作電 壓為15~30 kV。上述的毛細管柱為石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH3. 0~8. 0,主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、 硼酸或檸檬酸。上述的4全測結(jié)果的處理方法如下檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜， 運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實際濃度。常乳里a -乳白蛋白含量O. 8g~2g/L，質(zhì)量百分比約O. 2%。毛細管電泳儀檢測限制濃度l 0—5 ~ 1 (T8 mo 1 /L。所以毛細管電泳儀能檢測 出其含量。使用毛細管電泳儀開發(fā)檢測a-乳白蛋白含量的方法包括 樣品性質(zhì)的了解、分離模式、建立緩沖體系、優(yōu)化緩沖體系和換分離 模式等步驟。本發(fā)明使用毛細管電泳儀能準(zhǔn)確測定a-乳白蛋白的含量，從而應(yīng) 用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析檢測領(lǐng)域中。本發(fā)明在在傳統(tǒng)的電泳和色譜的原理的基礎(chǔ)上，使用高壓毛細管 電泳儀檢測a-乳白蛋白的含量，達到準(zhǔn)確檢測出乳制品中a-乳白蛋 白的含量。通過試-驗，最終確定檢測方法的最佳^t條件。具體如下 檢測a-乳白蛋白含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢 觀'J，還包括校準(zhǔn)讀數(shù)等步驟。毛細管電泳檢測檢測的溫度控制在 30 40。C之間，毛細管柱直徑50 75um、長度50 ~ 600 mm的石英 毛細管柱，DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣，壓力為0.5psi， 進樣時間為5s 10s,分離溫度為30~40°C,工作電壓為25 kV。 檢測步驟為把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在3000r/min離心條件下 離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩 沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩渦混合器混勻。精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機3min，使用毛細 管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):才艮據(jù)樣品分離的圖譜,運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分各峰高(或峰面積)，計算出試樣濃度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實際濃度。 有益效果目前，國內(nèi)毛細管電泳儀檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用到乳品領(lǐng)域里，如產(chǎn)品開發(fā)和控制質(zhì)量問題等領(lǐng)域中。但毛細管電泳技術(shù)尚未開發(fā)^r測a-乳白蛋白的方法。本發(fā)明成功彌補了乳品領(lǐng)域中的缺點，能準(zhǔn)確測定 a-乳白蛋白的含量，從而有利于產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制當(dāng)中。本發(fā)明是樣品在毛細管電泳儀上跑電泳，從而毛細管色語系統(tǒng)檢 測出樣品的吸光值，以圖語的形式表達出來，從而能準(zhǔn)確檢測出a-乳白蛋白的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。本發(fā)明方法現(xiàn)行回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0. 99，其線性范圍在 0. Olmg/ml ~ 2mg/ml ,最低4企出線為0. 04ng ,最低檢出濃度為 0. 001mg/ml。精確度達90%以上，柱子回收率達到90%以上，沖羊品回 收率達70%以上。能有效^f企測出奶樣中的a-乳白蛋白的含量。
具體實施方式
實施例1 一種牛乳中a-乳白蛋白含量的檢測方法毛細管電泳溫度控制在30。C，使用直徑為50um、長度為600咖 的石英毛細管柱，DAD4全測器，進樣壓力為0. 5psi,進樣時間為5s, 工作電壓為25 kV。校準(zhǔn)曲線的制定利用a-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的封面積分別為282154、 140793、 66924、 16810、 3520，利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸相關(guān)系數(shù)為0.9993，最低檢出線為0. 08ug,最低檢出含量為 0. 02mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達94%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基甲烷緩沖 液中力口40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的巰基乙醇，曱基羥 乙基纖維素0. 5%， pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 5%。才企測步-驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 旋渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機3min,之后使用毛細管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖語，運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分a-乳白蛋白的峰面積為24186,利用分析軟件自動套 入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計算出試樣濃度為0. 17mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實際濃度為0. 85mg/ml,所以該奶樣含有的a-乳白蛋白濃度為 0. 85g/L。實施例2 —種牛乳中a-乳白蛋白含量的檢測方法毛細管電泳溫度控制在4(TC,使用直徑為75um、長度為50mm 的石英毛細管柱，DAD檢測器，進樣壓力為0. 5psi，進樣時間為10s， 工作電壓為25 kV。校準(zhǔn)曲線的制定利用a-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的封面積分別為292457、 151022、 71042、 18245、 3700,利用軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸 相關(guān)系數(shù)為0.9982,最低檢出線為0. 09ug,最低檢出含量為0. 025mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)4羊品回收率達93%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基甲烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷石黃酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的0 -巰基乙醇，曱基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調(diào)至pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0.4%。檢測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在2000r/min 離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取樣品100ul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機3min,之后使用毛細管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜,運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分a-乳白蛋白的峰面積為29865,利用分析軟件自動套 入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計算出試樣濃度為0. 21mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實際濃度為1.05mg/ml,所以該奶樣含有的a-乳白蛋白濃度為1. 05g/L。
權(quán)利要求
1. 一種檢測a-乳白蛋白含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)將a-乳白蛋白溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含量a-乳白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對多個溶液分別檢測后得到a-乳白蛋白含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)對樣品進行檢測，并得到檢測結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到樣品中a-乳白蛋白的含量；其中，檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細管電泳分析儀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟l)中 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定的方法如下配制a-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，在樣 品緩沖液中溶解a-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成分別為lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml，制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶 液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即得到 a-乳白蛋白含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測 結(jié)果按照如下方法計算按峰面積計算出平均校正因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)溶 液或待;險測樣品的處理方法為4巴標(biāo)準(zhǔn)溶液或待;險測樣品裝入離 心管中，在2000-5000r/min離心條件下離心5-15min，將樣品 與緩沖液按照1: 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機1 ~ 10min， 使用毛細管電泳儀測定。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于:,所述的樣品緩 沖液為能夠^f吏蛋白質(zhì)M的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 :丙烷磺酸，60咖ol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時 添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0.4%,使用 0, 1M氬氧化鈉調(diào)至pH值為8. 5。
5. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于所述的搖勻步 驟采用凝渦混合器。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述高壓毛細 管電泳分析的使用檢測參數(shù)如下毛細管電泳檢測檢測的溫度控 制在20 40。C之間，毛細管柱直徑25 75ixm、長度20 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓力為0~ lpsi,進樣時間為ls 20s,分離溫度為20~40°C,工作電壓為 15~30 kV。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述的毛細管柱為 石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述的高壓毛 細管電泳分析的4企測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH3. 0~8. 0,主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的檢測方法，其特征在于所述的檢測結(jié) 果的處理方法如下^r測結(jié)果為樣品分離的圖i普，運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃度,再乘稀 釋倍數(shù)，即得實際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測乳中成分的方法，特別是一種檢測a-乳白蛋白含量的檢測方法。屬于分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明毛細管電泳儀檢測a-乳白蛋白含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢測，還包括校準(zhǔn)讀數(shù)等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細管電泳儀上跑電泳，從而毛細管色譜系統(tǒng)檢測出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達出來，從而能準(zhǔn)確檢測出a-乳白蛋白的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。
文檔編號G01N33/02GK101281203SQ20081008898
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司