專利名稱：婦女體液樣品中涉及存在唾液酸酶或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險確定的酶檢驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了用于婦女體液樣品中涉及唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險的評價方法。
特別地，本發(fā)明提供的方法用于定性和定量地確定病理風(fēng)險，所述病理如低出生體重(LBW)，早產(chǎn)(PTD)，膜早期破裂，羊膜內(nèi)感染，自然流產(chǎn)，子宮內(nèi)膜炎，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染，上生殖道感染(PID)，這些病理風(fēng)險可引起不育癥，宮頸炎，對乳頭瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性傳播疾病易感性，HIV感染的垂直傳播。
主要由早產(chǎn)(PTD)引起的低出生體重(LWB)是導(dǎo)致新生兒發(fā)病、死亡和長期嬰兒神經(jīng)障礙的主要風(fēng)險因子。
對于大部分的低出生體重病例還未得到公認(rèn)的因果因子，這使得目前的預(yù)防方案不夠有效。然而一些研究已經(jīng)表明細(xì)菌性陰道病(BV)與早產(chǎn)(PTD)、低體重嬰兒的早產(chǎn)、前期和后期流產(chǎn)有關(guān)系，并且通常與母系并發(fā)癥有關(guān)，與未患有BV情況相比，相關(guān)風(fēng)險可從1.4倍增加到6.9倍。另外近年來細(xì)菌性陰道病與性獲得HIV病毒感染和垂直母嬰HIV傳播的風(fēng)險增高有關(guān)。細(xì)菌性陰道病在西歐未妊娠婦女中的發(fā)病率為約10％，在西歐妊娠婦女中的發(fā)病率為約15％，在美國妊娠婦女中的發(fā)病率為10-30％，在非洲血統(tǒng)有色人種婦女中的發(fā)病率超過30％，在就診于性傳播疾病門診的婦女中的發(fā)病率超過60％。總之，值得注意的是在暴露于HIV病毒增高的風(fēng)險的個體中，患有BV的婦女中只有一小部分會產(chǎn)生不利妊娠后果或者獲得HIV感染，因此需要一種選擇性指示劑用于對處于增高的風(fēng)險并需要治療的患者的個體化。
細(xì)菌性陰道病是由不同菌種引起的，這些菌種包括陰道加德納氏菌(G.vaginalis)，擬桿菌屬菌種(Bacteroides spp.)，普雷沃氏菌屬菌種(Prevotella spp.)和動彎桿菌屬菌種(Mobiluncus spp.)，解脲脲枝原體(Ureaplasma urealyticum)和人枝原體(Mycoplasmahominis)。細(xì)菌性陰道病的發(fā)病機(jī)理仍不清楚，并且這種病理條件的存在經(jīng)常不易被診斷。
特別地，還不知道是什么引發(fā)了從正常乳酸桿菌集群到變化的陰道菌群的轉(zhuǎn)變，也還不知道陰道微生物菌群變化的何種程度才是真正病理狀況的指標(biāo)。
細(xì)菌性陰道病的一個至關(guān)重要的論點是陰道加德納氏菌與厭氧菌的協(xié)同作用。
在95％以上的細(xì)菌性陰道病病例中發(fā)現(xiàn)高滴定度的陰道加德納氏菌，而在未患有細(xì)菌性陰道病的婦女中也發(fā)現(xiàn)低滴定度的陰道加德納氏菌。
然而已經(jīng)論證了陰道加德納氏菌集群和細(xì)菌性陰道病狀況之間的嚴(yán)格相關(guān)性。
唯一被全部定性的由陰道加德納氏菌釋放的毒力因子為β-溶血毒素(Gvh)，其分子量為約59,000道爾頓。
此外，研究已顯示約半數(shù)未妊娠婦女對Gvh產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在陰道粘膜水平產(chǎn)生IgA抗體?；加蠦V的婦女不產(chǎn)生抗Gvh IgA抗體主要由于IgA的失活，且這種現(xiàn)象與高的陰道唾液酸酶活性水平有關(guān)。這種失活源自IgA結(jié)構(gòu)的被破壞，這種結(jié)構(gòu)的被破懷可能是由厭氧菌釋放的一群因子的水解作用所導(dǎo)致。
目前還未知在患有細(xì)菌性陰道病的婦女亞群中，抗微生物宿主防御的哪些因子是妥協(xié)的，或者哪些毒力因子激發(fā)了IgA的裂解。
首先，還未知這種狀況是否與BV并發(fā)癥的增高的風(fēng)險有關(guān)。
這種不確定定義使得臨床醫(yī)生面對的問題為是否對患有細(xì)菌性陰道病的婦女實施藥理學(xué)治療。已知有兩種不同的藥物用于治療細(xì)菌性陰道病甲硝唑和克林霉素。這兩種藥物的主要缺點在于其副作用，尤其是甲硝唑能引起胃腸綜合癥，并且被認(rèn)為是致畸劑，因此不推薦用于妊娠期，另外克林霉素能引起腹瀉和可能致命的假膜性結(jié)腸炎。另外這兩種藥物都能引起酵母菌性陰道炎。
基于以上原因，非常需要開發(fā)出一種方法用于確定病理并發(fā)癥風(fēng)險，所述病理并發(fā)癥如低出生體重(LBW)，早產(chǎn)(PTD)，自然流產(chǎn)，膜早期破裂，子宮內(nèi)膜炎，獲得性HIV感染，獲得性HPV感染(其可導(dǎo)致子宮頸上皮內(nèi)瘤形成)，上生殖道感染(PID)，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染。
本發(fā)明提供一種可靠方法，通過為醫(yī)生配備一種有價值的工具用于決定是否實施藥理學(xué)治療，以解決上述并發(fā)癥風(fēng)險的確定問題。
通過主要權(quán)利要求所描述的病理風(fēng)險的確定方法解決了這個問題。
本發(fā)明方法的進(jìn)一步的特征和先進(jìn)性會通過隨后的優(yōu)選實施例的描述變得更加突出，這些特征和先進(jìn)性是在指示性的描述中給出的，但不限于這些描述。
為建立本發(fā)明的方法，對臨床病例進(jìn)行了研究并且與不具有公認(rèn)的病理狀況的婦女對照組進(jìn)行了比較。
特別地，對116名生產(chǎn)低出生體重嬰兒(LBW)的婦女，86名發(fā)生早產(chǎn)(PTD)的婦女和417名妊娠期間具有正常體重嬰兒(NTD)的婦女進(jìn)行了檢查。
檢查了所有這些婦女陰道液樣品中的唾液酸酶和/或氨?；彼岫傅幕钚裕送鈱λ鐾僖核崦负桶滨；彼岫富钚运竭M(jìn)行了評價。
唾液酸酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的酶，并且出現(xiàn)在幾種疾病的發(fā)病機(jī)理中。這些酶激發(fā)包括IgA的各種糖蛋白的唾液酸酶的水解，改變免疫應(yīng)答。
氨?；彼岫甘怯杉?xì)菌產(chǎn)生的利于細(xì)胞浸潤的蛋白水解酶。這些酶可激活細(xì)胞因子和其它免疫介質(zhì)。
唾液酸酶活性的確定是通過將50μl陰道液樣品與50μl的底物在pH5.0進(jìn)行培養(yǎng)，使用方法見Cauci等人，美國婦科學(xué)雜志(Am JObstat Gynecol)，1998；178511-515頁的描述。用底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毫微摩爾甲氧苯酚表示具體活性，并對照純甲氧苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。唾液酸酶活性水平的評價如下低于0.19nmol甲氧苯酚的值為無活性，等于或者大于0.19nmol甲氧苯酚的值為+1截斷值，等于或者大于0.38nmol甲氧苯酚的值為+2截斷值，等于或者大于2.50nmol甲氧苯酚的值為+3截斷值，等于或者大于5.0nmol甲氧苯酚的值為+4截斷值。
氨?；彼岫富钚缘拇_定方法見Cauci等人，傳染病雜志(J Infect Dis)，1998；1781698-1706頁的描述。氨?；彼岫富钚运降脑u價如下低于22mOD值為無活性，等于或者大于22mOD值為+1截斷值，等于或者大于44mOD值為+2截斷值，等于或者大于1000mOD值為+3截斷值，等于或者大于2000mOD值為+4截斷值。
使用健康對照人群(沒有任何一種陰道癥狀和除了乳酸桿菌以外的微生物陰道集群)中測得的平均值加上一個標(biāo)準(zhǔn)偏差計算唾液酸酶和氨?；彼岫富钚缘?1截斷值。對+1截斷值加倍得到+2截斷值。對+4截斷值減半得到+3截斷值。
特別地，為建立本發(fā)明的方法，所述唾液酸酶和氨酰基脯氨酸二酞酶活性與LBW和PTD有關(guān)。
下面表1顯示的分析數(shù)據(jù)分別為生產(chǎn)低出生體重嬰兒(LBW)，早產(chǎn)(PTD)或者正常足月分娩(NTD，對照組)婦女的百分?jǐn)?shù)，粗體數(shù)據(jù)表示LBW或者PTD婦女的百分?jǐn)?shù)與NTD婦女的百分?jǐn)?shù)的比值(讓步比，OR)。使用SPSS計算機(jī)統(tǒng)計程序?qū)Υ酥颠M(jìn)行計算和用標(biāo)準(zhǔn)因子進(jìn)行修正。
特別地，陰道液樣品的獲得取自婦女妊娠期的前3個月和第4-6月，并且優(yōu)選妊娠期的第7整周到第24整周。
按照以下標(biāo)準(zhǔn)這些組婦女被進(jìn)一步分組，陰道液樣品中單獨唾液酸酶的活性，單獨氨酰基脯氨酸二酞酶的活性，這些酶的活性并且pH≥4.7，這些酶的活性和細(xì)菌性陰道病(BV)的病理狀況，或者這些酶的活性和陰道加德納氏菌細(xì)菌。
表1陽性％OR測量參數(shù) NTD LBW PTD和/或陰道集群n＝417 n＝116 n＝86唾液酸酶活性≥+1 15.3 28.7 2.220.01.4≥+2 10.3 18.3 1.911.81.2≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5氨?；彼岫富钚浴?1 33.7 41.6 1.434.91.1≥+2 26.0 37.2 1.724.10.9≥+3 3.9 7.1 1.96.0 1.6≥+4 1.0 4.4 4.83.6 3.9pH≥4.7 30.5 37.1 1.332.61.1pH≥4.7和唾液酸酶活性≥+1 9.8 19.0 2.011.61.2≥+2 7.9 13.8 1.810.51.4≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.4 3.62.3 2.4pH≥4.7和氨?；彼岫富钚浴?1 20.9 31.0 1.625.61.3≥+2 18.5 30.2 1.720.91.2≥+3 3.6 6.0 1.84.7 1.4≥+4 0.7 3.4 5.12.3 3.5BV 14.6 20.7 1.512.80.9BV和唾液酸酶活性≥+1 9.1 15.7 1.97.1 0.8≥+2 7.4 12.2 1.77.1 0.9≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.2≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5BV和氨?；彼岫富钚浴?1 13.5 18.6 1.512.00.9≥+2 13.0 18.6 1.510.80.8≥+3 2.7 3.5 1.32.4 0.9≥+4 0.2 2.7 11.3 1.2 5.0陰道加德納氏菌 36.2 42.2 1.336.01.0陰道加德納氏菌和唾液酸酶活性≥+1 11.0 18.3 1.811.81.1≥+2 8.2 13.0 1.79.4 1.2≥+3 3.8 7.8 2.14.7 1.3≥+4 1.0 3.5 3.72.4 2.5陰道加德納氏菌和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+1 23.4 31.0 1.526.51.2≥+2 21.0 30.1 1.722.91.1≥+3 3.6 7.1 2.06.0 1.7≥+4 0.7 4.4 6.43.6 5.2
表1顯示的主要結(jié)果為OR值，因為OR代表低出生體重(LBW)或者早產(chǎn)(PTD)的風(fēng)險指數(shù)。
如果比值低于1意味著婦女沒有或者有低的并發(fā)癥風(fēng)險。比值為1-2表示并發(fā)癥的中等風(fēng)險。如果比值為2-4表示婦女有并發(fā)癥的高風(fēng)險，如果比值高于4則表示婦女具有發(fā)生低出生體重或者早產(chǎn)的極高風(fēng)險。
特別地，在實施例描述中，對應(yīng)OR值等于2的中等風(fēng)險意味著與普通婦女相比患者具有發(fā)生并發(fā)癥的兩倍風(fēng)險，也就是說，風(fēng)險相對高100％。
優(yōu)選地，這種結(jié)果可用記分表示-表示低風(fēng)險或者無風(fēng)險，+表示中等風(fēng)險，++表示高風(fēng)險，+++表示極高風(fēng)險。
表1突出了相對于唾液酸酶活性或者氨?；彼岫富钚缘脑黾?，OR值具有基本遞增的性質(zhì)。
特別地，唾液酸酶活性水平為+1至+3截斷值，LBW的OR值為2-4，而PTD的OR值為1-2。因此不考慮BV狀況和陰道加德納氏菌的存在，所述陰道液樣品中的唾液酸酶水平表示LBW風(fēng)險高和PTD風(fēng)險中等。
對于唾液酸酶活性等于或者高于+4，LBW和PTD的OR值為2-4。因此LBW或PTD風(fēng)險高。
同樣的，氨?；彼岫富钚运綖?1至+3截斷值，LBW和PTD的OR值為1-2，因此LBW和PTD風(fēng)險中等。
另外，氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+4，LBW的OR值高于4，PTD的OR值為2-4。因此LBW風(fēng)險極高，而PTD風(fēng)險中等。
從表1表示的臨床數(shù)據(jù)分析，有可能將LBW和PTD的風(fēng)險與患者體液中檢測出的唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运较嚓P(guān)，優(yōu)選陰道液樣品。
以上面表示結(jié)果為基礎(chǔ)，并且根據(jù)本發(fā)明，建立了一種體液樣品中涉及唾液酸酶或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險的確定方法，病理如低出生體重(LBW)，早產(chǎn)(PTD)，膜早期破裂，羊膜內(nèi)感染，自然流產(chǎn)，子宮內(nèi)膜炎，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染，上生殖道感染(PID)，這些病理可引起不育癥，宮頸炎，對乳頭瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性傳播疾病的易感性，和HIV感染的垂直傳播。
所述方法依次包括如下步驟a)確定所述體液樣品中的唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运?；b)將所述唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平與所述活性的前置值范圍進(jìn)行比較；c)計算風(fēng)險因子。
很顯然已設(shè)計了一種有效的評價婦女體液樣品中涉及唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理風(fēng)險的方法。這種方法利于進(jìn)行非常精確和可靠的評價。
另外，如前所述，表1報道了pH≥4.7的婦女陰道液樣品的分析數(shù)據(jù)和唾液酸酶或者氨?；彼岫傅幕钚?。
值得注意的是，陰道pH≥4.7的婦女中，對于唾液酸酶活性水平為+1至+2，LBW或者PTD的OR值為1-2，因此LBW和PTD風(fēng)險中等。而唾液酸酶活性水平為+3時，LBW的OR值為2-4，PTD的OR值為1-2，因此LBW風(fēng)險高，而PTD風(fēng)險中等。最后唾液酸酶活性水平為+4，LBW或者PTD的OR值為2-4，因此相應(yīng)的風(fēng)險高。
pH≥4.7的陰道液樣品中氨?；彼岫富钚运綖?1至+3時，LBW和PTD的OR值為1-2，因此相應(yīng)風(fēng)險中等。不同的是，對于氨?；彼岫富钚运綖?4時，LBW的OR值大于4，PTD的OR值為2-4，因此LBW風(fēng)險極高而PTD風(fēng)險高。
根據(jù)本發(fā)明實施例，可對pH值等于或大于4.7的陰道液樣品使用該方法。
另外，如前所述，表1報道了患有BV的婦女陰道液樣品的分析數(shù)據(jù)和唾液酸酶或氨?；彼岫富钚缘臏y定數(shù)據(jù)。
特別地，在患有BV的婦女中對于唾液酸酶活性水平在+1至+2，LBW的OR值為1-2，PTD的OR值低于1，因此LBW風(fēng)險中等，而PTD風(fēng)險低或者沒有風(fēng)險。對于唾液酸酶活性水平在+3至+4時，LBW的OR值為2-4，因此LBW風(fēng)險中等。
對于PTD水平等于或大于+3與等于或大于+4是有區(qū)別的。前一種情況OR值為1-2，風(fēng)險中等，第二種情況OR值為2-4，風(fēng)險高。
對于氨?；彼岫富钚运綖?1至+3時，LBW的OR值為1-2，LBW風(fēng)險中等。對于同樣的氨?；彼岫富钚运街?，PTD的OR值低于1，因此PTD的風(fēng)險低或者沒有風(fēng)險。
值得注意的是，氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或大于+4時，LBW和PTD的OR值高于4，因此二者的風(fēng)險極高。
從以上所述，根據(jù)第一個實施例，本發(fā)明的用于確定并發(fā)癥風(fēng)險的方法可用于患有BV婦女的體液樣品。
最后，表1顯示了患有陰道加德納氏菌集群的婦女的陰道液樣品的分析數(shù)據(jù)和對唾液酸酶或者氨?；彼岫赋赎栃缘臄?shù)據(jù)。
特別地，對于唾液酸酶活性水平為+1至+2時，LBW和PTD的OR值為1-2，風(fēng)險中等。唾液酸酶活性水平等于或高于+3時，LBW的OR值為2-4，而PTD的OR值為1-2，因此LBW風(fēng)險高，而PTD的風(fēng)險中等。唾液酸酶活性水平等于或者大于+4時，LBW和PTD的OR值為2-4，因此不利妊娠后果的風(fēng)險高。
氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平為+1至+2時，LBW和PTD的OR值為1-2，因此LBW和PTD的風(fēng)險中等。氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+3時，LBW的OR值為2-4，相應(yīng)風(fēng)險高，而PTD的OR值為1-2，因此相應(yīng)風(fēng)險中等。最后氨酰基脯氨酸二酞酶活性水平等于或者大于+4，LBW和PTD的OR值均大于4，因此相應(yīng)風(fēng)險極高。
從以上所述，根據(jù)第二個實施例，本發(fā)明的用于確定并發(fā)癥風(fēng)險的方法可用于患有陰道加德納氏菌集群的婦女的體液樣品。
本發(fā)明中這兩個實施例的先進(jìn)性在于，通過結(jié)合使用細(xì)菌學(xué)分析方法或者BV的診斷或者陰道pH值的測定，可通過導(dǎo)致高風(fēng)險的唾液酸酶和氨?；彼岫傅幕钚缘暮唵蔚拇_定方法選擇具有極高風(fēng)險的婦女。
正如本說明書的前言部分所述，本發(fā)明的方法可利于確定病理風(fēng)險如獲得性HIV病毒感染，HPV病毒感染，上生殖道感染(PID)，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染，自然流產(chǎn)，子宮內(nèi)膜炎，宮頸炎。
下面的部分將要描述關(guān)于獲得性HIV病毒感染的研究。
為建立方法，最初征集了50名具有高風(fēng)險的性獲得性HIV病毒感染的婦女。三年之后，這些婦女中的42名婦女亞群仍然為HIV血清陰性(對照組)，有8名婦女亞群為HIV血清陽性。
根據(jù)體液樣品中的唾液酸酶活性值，氨酰基脯氨酸二酞酶活性值，pH值等于或者大于4.7，細(xì)菌性陰道病(BV)的診斷和陰道加德納氏菌的存在將這些組做了進(jìn)一步的分組。
表2顯示了在42名HIV血清陰性婦女亞群(對照組)和8名變?yōu)镠IV血清陽性婦女亞群的陰道的酶活性值。
表2陽性％OR測量參數(shù)血清陰性 血清陽性和/或陰道集群 N＝42N＝8唾液酸酶活性≥+164.3 75.01.3≥+240.5 62.51.6≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2氨?；彼岫富钚浴?183.3 100.1.1≥+273.8 87.51.3≥+316.7 50.03.2≥+411.9 50.04.4pH≥4.7 81.0 87.51.2pH≥4.7和唾液酸酶活性≥+159.5 75.01.4≥+235.7 62.51.8≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2pH≥4.7和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+173.8 87.51.3≥+271.4 87.51.4≥+314.3 50.03.6≥+411.9 50.04.4BV 71.4 87.51.4BV和唾液酸酶活性≥+154.8 75.01.5≥+233.3 62.52.0≥+311.9 50.04.3≥+49.5 37.54.2BV和氨?；彼岫富钚浴?173.8 87.51.3≥+269.0 87.51.5≥+311.9 50.04.3≥+49.5 50.05.5陰道加德納氏菌 100.0100.0 1.0陰道加德納氏菌和唾液酸酶活性≥+164.3 75.01.3≥+240.5 62.51.6≥+314.3 50.03.6≥+49.5 37.54.2陰道加德納氏菌和氨酰基脯氨酸二酞酶活性≥+183.3 100.0 1.1≥+273.8 87.51.3≥+316.7 50.03.2≥+411.9 50.04.4
表2表示的主要結(jié)果為OR值，因為OR值代表了通過性傳播患有HIV感染的風(fēng)險指數(shù)。
如果該比值低于1，則婦女具有性獲得病毒感染的低風(fēng)險或者無風(fēng)險。比值為1-2表示病毒感染的獲得為中等風(fēng)險。如果比值為2-4，則婦女具有病毒感染獲得的高風(fēng)險，如果比值大于4則為婦女具有病毒感染獲得的極高風(fēng)險。特別地，例如對應(yīng)OR值為2的中等風(fēng)險表示患者具有相對于普通婦女兩倍的病毒感染獲得的可能性，即風(fēng)險相對高100％。
優(yōu)選該結(jié)果可用記分表示-表示低風(fēng)險或者無風(fēng)險，+表示中等風(fēng)險，++表示高風(fēng)險，+++表示極高風(fēng)險。
表2中表示的LBW或者PTD的值與表1中的值意義相同，在此不再詳述。
從表1和表2可得出結(jié)論為隨著唾液酸酶或者氨?；彼岫富钚运降脑龃?，OR值具有基本遞增的性質(zhì)。
下文將報道確定陰道液樣品中唾液酸酶和氨?；彼岫富钚缘膶嵤├?，用來闡明本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
唾液酸酶活性確定將50μl陰道液樣品與50μl溶解于50mM醋酸鈉的2-(3’-甲氧苯基)-N-乙?；?D-神經(jīng)氨酸(Sigma供應(yīng))底物在pH＝5時于室溫培養(yǎng)90分鐘。加入4mM的4-氨基安替比林和6mM鐵氰酸鉀顯色溶液后，具有唾液酸酶活性的樣品在492納米顯可測的紅色。測定結(jié)果以加入顯色劑后的樣品吸收和未加入顯色劑的相同樣品的吸收之間的差異來表示。對照已知量純甲氧苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線表示具體活性。
作為選擇，可使用不同于2-(3’-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神經(jīng)氨酸(Sigma，M1393)的生色底物或者熒光底物進(jìn)行唾液酸酶活性的檢驗，如2-O-(鄰硝基苯基)-α-D-N-乙?；窠?jīng)氨酸(Sigma，N1266，N1516)，2’-(4-甲基-7-羥基香豆素基(umbelliferyl))-α-D-N-乙?；窠?jīng)氨酸鈉鹽(Sigma，M8639)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰基神經(jīng)氨酸(X-NeuNAc)，(Sigma，B4666；或者Calbiochem 203770)。
氨酰基脯氨酸二酞酶活性確定將50μl陰道液樣品與50μl溶解于100mM醋酸鈉的L-脯氨酸-對硝基苯胺底物(Sigma)在pH＝5時在37℃培養(yǎng)24小時，具有氨酰基脯氨酸二酞酶活性的樣品在405納米顯黃色，使用無底物相同樣品用于消除樣品背景，用不含有陰道液的兩個空白液的平均值消除底物的自發(fā)水解。結(jié)果以千分之一光學(xué)密度單位(mOD)表示。
作為選擇，可使用不同于L-脯氨酸-對硝基苯胺(Sigma P5267)的生色底物或者熒光底物進(jìn)行氨?；彼岫富钚缘臋z驗，如L-脯氨酸-β-萘酰胺(Sigma P1380)，N-芐基氧羰基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，N-芐基氧羰基-L-脯氨酸-對硝基苯酯(Sigma C4877)，羥基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素(Sigma P5898)，L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘酰胺(Sigma P9655)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種確定婦女體液樣品中涉及唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險的試劑盒。
試劑盒包括在溶液中的唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚詸z驗，該溶液含有用于接種生物樣品的無色底物溶液；配備分液器容器內(nèi)的顯色劑溶液；通過顯色強(qiáng)度評價酶活性水平的參考刻度。
根據(jù)實施例，試劑盒也包括在固相載體上的唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚詸z驗，該載體作為一個平臺包括由固相框架支持的兩層膜，并且含有酶底物和顯色劑，生物樣品流過其中；和通過顯色強(qiáng)度評價酶活性水平的參考刻度。
根據(jù)進(jìn)一步的實施例，所述試劑盒也可包括在固相載體上的唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚詸z驗，該載體包括充滿酶的生色底物或者熒光底物的膜和顯色劑，并被惰性帶所承載，用于與生物樣品接觸。所述試劑盒將裝有通過顯色強(qiáng)度評價酶活性水平的參考刻度。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施例，所述試劑盒也可包括pH指示劑，優(yōu)選變色范圍為4-7的pH顯色紙。
值得注意的是本發(fā)明的試劑盒可有利地是聯(lián)合試劑盒。所述試劑盒例如可包括在溶液中或者在固相載體上進(jìn)行的確定唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚缘臋z驗和pH指示劑。
顯然參考以上表格所示的評價結(jié)果和來自描述的或者任何可得分析檢驗的評價結(jié)果，試劑盒提供了一種確定上述病理風(fēng)險的快速方法，該試劑盒的主要意義是為醫(yī)生提供有效工具以決定對患者進(jìn)行藥理學(xué)治療并且可檢驗療效。
由以上描述可正確評價本發(fā)明的確定病理風(fēng)險的方法，該方法可用于實現(xiàn)本發(fā)明前言部分所述要求。所述病理風(fēng)險如低出生體重(LBW)，早產(chǎn)(PTD)，膜早期破裂，羊膜內(nèi)感染，自然流產(chǎn)，子宮內(nèi)膜炎，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染，上生殖道感染(PID)，這些病理可引起不育癥，宮頸炎，對乳頭瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性傳播疾病的易感性，HIV感染的垂直傳播。
顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員為了滿足偶然的或者特殊的要求，可對上述方法引進(jìn)數(shù)種改進(jìn)和實施例，但所有這些都包含在下面權(quán)利要求所限定的發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.婦女體液樣品中涉及存在唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理風(fēng)險的確定方法，該方法依次包括以下步驟a)確定所述體液樣品中唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运?；b)比較所述唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚院退龌钚缘那爸弥捣秶?；c)計算風(fēng)險因子。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中在步驟a)后確定所述唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运降挠浄?。
3.權(quán)利要求1或2所述方法，其中在pH等于或者大于4.7的陰道液樣品中呈現(xiàn)病理風(fēng)險。
4.權(quán)利要求1或2所述方法，其中在患有BV婦女的體液樣品中呈現(xiàn)病理風(fēng)險。
5.權(quán)利要求1或2所述方法，其中在陰道加德納氏菌集群的婦女的體液樣品中呈現(xiàn)病理風(fēng)險。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述方法，其中對陰道液樣品使用該方法。
7.權(quán)利要求1-6任一項所述方法，其中涉及存在唾液酸酶和/或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理包括低出生體重(LBW)，早產(chǎn)(PTD)，膜早期破裂，羊膜內(nèi)感染，自然流產(chǎn)，子宮內(nèi)膜炎，分娩后感染或者婦科手術(shù)術(shù)后感染，上生殖道感染(PID)，這些病理可引起不育癥，宮頸炎，對由乳頭瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒感染的性傳播疾病易感性，和HIV感染的垂直傳播。
8.權(quán)利要求1-7任一項所述方法，其中對第一個或者第二個三個月妊娠期間婦女的體液樣品使用該方法。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述方法，其中對第7-24整周妊娠期婦女的體液樣品使用該方法。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述方法，其中對妊娠期婦女的體液樣品使用該方法。
11.用于定量確定婦女體液樣品中唾液酸酶活性的試劑盒。
12.用于定量確定婦女體液樣品中氨?；彼岫富钚缘脑噭┖?。
13.用于定量確定婦女體液樣品中唾液酸酶和氨?；彼岫富钚缘脑噭┖?。
14.權(quán)利要求11-13任一項所述試劑盒，該試劑盒包括帶有唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚詤⒖伎潭鹊恼f明性散頁。
15.權(quán)利要求11-14任一項所述試劑盒，該試劑盒包括說明性散頁，該散頁給出了評價病理風(fēng)險的說明無或者低(-)，中等(+)，高(++)，極高(+++)。
16.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在溶液中用于確定唾液酸酶活性的檢驗。
17.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在溶液中用于確定氨?；彼岫富钚缘臋z驗。
18.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在溶液中用于確定唾液酸酶活性和氨?；彼岫富钚缘臋z驗。
19.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在固相載體上的檢驗，優(yōu)選活性帶檢驗或者平臺檢驗，用于確定唾液酸酶活性。
20.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在固相載體上的檢驗，優(yōu)選活性帶檢驗或者平臺檢驗，用于確定氨酰基脯氨酸二酞酶活性。
21.權(quán)利要求11-15任一項所述試劑盒，該試劑盒包括在固相載體上的檢驗，優(yōu)選活性帶檢驗或者平臺檢驗，用于分別確定唾液酸酶活性和氨酰基脯氨酸二酞酶活性。
22.權(quán)利要求11或者13所述的試劑盒，該試劑盒包括用于確定唾液酸酶活性的作為生色底物或者熒光底物的試劑，所述試劑選自2-(3’-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神經(jīng)氨酸，2-O-(鄰硝基苯基)-α-D-N-乙?；窠?jīng)氨酸，2’-(4-甲基-7-羥基香豆素基)-α-D-N-乙?；窠?jīng)氨酸鈉鹽，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰基神經(jīng)氨酸。
23.權(quán)利要求12或者13所述的試劑盒，該試劑盒包括用于確定氨?；彼岫富钚缘淖鳛樯孜锘蛘邿晒獾孜锏脑噭?，所述試劑選自L-脯氨酸-對硝基苯胺，L-脯氨酸-β-萘酰胺，N-芐氧羰基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，N-芐氧羰基-L-脯氨酸-對硝基苯酯，羥基-L-脯氨酰-β-萘酰胺，L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素，L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘酰胺。
24.權(quán)利要求11-23任一項所述試劑盒，該試劑盒包括pH指示劑。
25.權(quán)利要求24所述試劑盒，該試劑盒包括pH值參考刻度，和/或唾液酸酶活性的參考刻度，和/或氨?；彼岫富钚缘膮⒖伎潭?。
26.權(quán)利要求24所述試劑盒，該試劑盒包括散頁，該散頁給出了評價病理風(fēng)險的說明無或者低(-)，中等(+)，高(++)，極高(+++)。
全文摘要
本發(fā)明描述了婦女體液樣品中涉及存在唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險的確定方法，該方法依次包括以下步驟a)確定所述體液樣品中唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运剑籦)比較所述唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚运胶退龌钚缘那爸弥捣秶?；c)計算風(fēng)險因子。這種方法對于準(zhǔn)確和可靠地評價婦女體液樣品中涉及唾液酸酶和/或氨?；彼岫富钚缘牟±盹L(fēng)險特別有效。因此這種方法為醫(yī)生提供了一種有效工具以決定是否進(jìn)行藥理學(xué)治療。
文檔編號G01N33/50GK1503908SQ01822652
公開日2004年6月9日 申請日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者薩比納考茲 申請人:尤尼拜爾有限公司