一種降低牛乳過(guò)敏蛋白免疫特性的方法
【專利摘要】一種降低牛乳過(guò)敏蛋白免疫特性的方法，其特征是按以下步驟：（1）用0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β-乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的蛋白溶液；（2）將步驟（1）配制好的β-乳球蛋白溶液分裝于密閉的PE管內(nèi)，浸沒(méi)于水浴超聲處理裝置，頻率設(shè)定為40KHz，功率300W，處理時(shí)間30min。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了降低牛乳β-乳球蛋白的潛在致敏性的目的，經(jīng)過(guò)超聲波處理后β-乳球蛋白，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA方法分析，其過(guò)敏原性顯著降低，IgE的結(jié)合能力降低83.8%。
【專利說(shuō)明】一種降低牛乳過(guò)敏蛋白免疫特性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種通過(guò)非熱加工技術(shù)降低牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白潛在致敏性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳球蛋白是牛乳中主要的過(guò)敏原之一。由于乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，因此該蛋白經(jīng)過(guò)人體胃腸道消化后，還會(huì)有部分完整的β_乳球蛋白或其肽段，容易導(dǎo)致過(guò)敏人群產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。因此利用各種加工手段降低β_乳球蛋白的過(guò)敏原性，可保障過(guò)敏人群的安全食用。
食物過(guò)敏原不是通過(guò)完整的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，這些引起食物過(guò)敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)就是過(guò)敏原表位。而表位包括線性表位和構(gòu)象性表位，是其過(guò)敏原性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0003]目前已有用于降低牛乳過(guò)敏原蛋白β_乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化學(xué)加工、物理加工等技術(shù)。其中，生物加工是利用基因工程技術(shù)改變過(guò)敏蛋白的基因序列；化學(xué)加工則通過(guò)酶改性和糖基化等方式改變過(guò)敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到降低其致敏性的目的。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以構(gòu)象性表位為主，難以通過(guò)序列變化大幅度改變構(gòu)象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，導(dǎo)致酶改性的效果不佳，且糖基化過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，會(huì)引起人們對(duì)食物安全性的考慮。
[0004]物理加工又可分為熱加工和非熱加工。熱加工是牛乳及其乳制品生產(chǎn)過(guò)程中常用的滅菌技術(shù)，加熱過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致牛乳過(guò)敏蛋白產(chǎn)生去折疊或聚合等結(jié)構(gòu)變化，從而誘導(dǎo)牛乳過(guò)敏蛋白的潛在致敏性的改變。但是，熱加工也會(huì)致使牛乳中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。而非熱加工技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)熱加工預(yù)期的加工效果，并能降低食品中有害微生物菌群的數(shù)量，同時(shí)可維持食品原有的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，保留其中的熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分。在非熱加工處理中，同時(shí)改變牛乳的潛在致敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種降低牛乳過(guò)敏蛋白免疫特性的方法。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0007](I)制備蛋白溶液:用0.05Μ，ρΗ6.8的磷酸鹽緩沖液將乳球蛋白稀釋成
0.2mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0008](2)將步驟(1)配制好的β -乳球蛋白溶液分裝于密閉的PE管內(nèi)，浸沒(méi)于水浴超聲處理裝置，頻率設(shè)定為40ΚΗζ，功率為300W，樣品處理時(shí)間分別為30min。
[0009]水浴超聲處理裝置內(nèi)部盛滿樣品，超聲傳感器附著于液體容器外側(cè)，并且釋放出超聲波福射樣品。
[0010]本發(fā)明建立了一種非熱加工方法，即超聲波技術(shù)，實(shí)現(xiàn)降低牛乳β-乳球蛋白的潛在致敏性。超聲加工 技術(shù)應(yīng)用于蛋白改性主要是依據(jù)蛋白質(zhì)具有聲空穴現(xiàn)象，當(dāng)液體蛋白受到超聲波沖擊時(shí)，一系列的擠壓和折射波引起液體介質(zhì)中蛋白分子的變化。超聲波處理的蛋白，其分子性能發(fā)生了很大的變化，這是由于超聲處理是將電負(fù)性基團(tuán)引入蛋白分子中的過(guò)程，增大蛋白分子的靜電斥力，使其趨于分散，且構(gòu)象發(fā)生變化，且蛋白與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，因此溶解性和聚穩(wěn)定性提高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]附圖1為本發(fā)明超聲處理對(duì)β-乳球蛋白IgE結(jié)合能力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013]實(shí)施例1。
[0014]1、材料。
[0015]I)配制緩沖液:稱取8.775g磷酸氫二鈉，3.975g磷酸二氫鈉，超純水溶解并定容至1L，配制成0.05M, pH6.8的磷酸鹽緩沖液。
[0016]2)制備蛋白溶液:用0.05M，ρΗ6.8的磷酸鹽緩沖液將β-乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0017]2、方法。
[0018]I)超聲波技術(shù)處理β -乳球蛋白
超聲波處理:將配制好的乳球蛋白溶液分裝于密閉的PE管內(nèi)，浸沒(méi)于水浴超聲處理裝置(40KHz，300W)，樣品處理時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60min。
[0019]2) 乳球蛋白致敏性變化的定量分析。
[0020]超聲波處理后的β_乳球蛋白溶液作為被分析的蛋白樣品，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA檢測(cè)其潛在致敏性的變化。對(duì)照未處理蛋白，可以判斷出該過(guò)敏蛋白潛在致敏性的降低程度。
[0021]3)檢測(cè)超聲處理后的乳球蛋白的致敏性變化
⑴構(gòu)建牛乳過(guò)敏患者血清池:選定11位符合既定條件的牛乳過(guò)敏患者的血清混合制備而成。這些患者的血清符合以下條件:對(duì)牛乳過(guò)敏呈陽(yáng)性；總的IgE水平均>100 IU/mL ；特異性IgE水平均>1 IU/mL。
[0022]⑵抗原包被:將不同超聲波處理時(shí)間后的各個(gè)乳球蛋白溶液稀釋至2.5yg /mL，在一塊酶標(biāo)板上分別包被上100 μ L，以未處理的β-乳球蛋白溶液為對(duì)照。4°C過(guò)夜后PBST洗板三次，每次5min。
[0023]⑶明膠封阻:每孔加入250 μ L 3%明膠，37°C封阻lh。洗板三次。
[0024]⑷一抗反應(yīng):另準(zhǔn)備一塊酶標(biāo)板以同樣的方式進(jìn)行封阻，洗滌之后，每孔加入1:20稀釋度的人血清100 μ L，37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，每孔吸取100 μ L轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0025](5)二抗反應(yīng):每孔加入1:5000稀釋度的生物素標(biāo)記羊抗人IgE 二抗100 μ L, 37°C反應(yīng)lh。PBST洗板。
[0026](6)親和素反應(yīng):每孔加入1:60稀釋的HRP-鏈霉素標(biāo)記的親和素100 μ L,37°C反應(yīng)，洗板。(7) OPD顯色和檢測(cè):每孔加入100 μ L現(xiàn)配制的OPD顯色液，37°C避光反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后每孔50 μ L加入2Μ H2SO4終止液，在490nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值
(8)結(jié)果的計(jì)算,IgE結(jié)合能力(%) = (1-B/B。)X 100%, B0:無(wú)競(jìng)爭(zhēng)蛋白時(shí)的OD值；B:各加工條件下競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值。
[0027]3、結(jié)果。[0028]經(jīng)過(guò)超聲波處理后β -乳球蛋白，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA方法分析其IgE結(jié)合能力的變化即潛在致敏性變化，如附圖1所示。經(jīng)過(guò)20min、40min、50min及60min的超聲處理的β -乳球蛋白，過(guò)敏原性幾乎無(wú)變化。但經(jīng)過(guò)IOmin和30min的超聲處理的β -乳球蛋白樣品，其過(guò)敏原性均有顯著降低，其中30min的超聲處理可使其IgE的結(jié)合能力降低最明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種降低牛乳過(guò)敏蛋白免疫特性的方法，其特征是按以下步驟:(1)用0.05M, pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β -乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的蛋白溶液； (2)將步驟(1)配制好的β-乳球蛋白溶液分裝于密閉的PE管內(nèi)，浸沒(méi)于水浴超聲處理裝置，頻 率設(shè)定為40ΚΗζ，功率300W，處理時(shí)間30min。
【文檔編號(hào)】C07K1/113GK103910792SQ201410148144
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】陳紅兵, 李欣, 白雨鑫, 高金燕, 龍偉, 吳志華, 楊安樹(shù), 佟平 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)