專利名稱：：人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭elisa檢測試劑盒的制作方法人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
-本發(fā)明公開一種人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒，通過酶標(biāo)抗體與血清抗體的競爭反應(yīng)來準(zhǔn)確定量檢測人和動(dòng)物血清中狂犬病中和抗體效價(jià)，屬于生物疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：狂犬病是一種重要的人獸共患傳染病，狂犬病感染人或動(dòng)物后，病死率100%。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行狂犬病的主動(dòng)預(yù)防和對(duì)狂犬病暴露人群進(jìn)行暴露后治療(疫苗和免疫球蛋白注射)是防止狂犬病發(fā)生的關(guān)鍵。狂犬病疫苗在機(jī)體內(nèi)可以誘導(dǎo)針對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白的五種抗體產(chǎn)生，其中針對(duì)糖蛋白的中和抗體是目前唯一公認(rèn)的抗感染抗體。世界衛(wèi)生組織(冊(cè)0)和動(dòng)物世界衛(wèi)生組織(或國際獸疫局，OIE)規(guī)定，狂犬病病毒中和抗體在達(dá)到0.5IU/ml時(shí)，機(jī)體就可足以抵抗狂犬病病毒的自然感染，中和抗體水平越高，機(jī)體具備的抗狂犬病感染能力越強(qiáng)，在低于該水平時(shí)，有必要對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以提高機(jī)體的抗狂犬病感染能力。目前，廣為采用的檢測狂犬病病毒中和抗體的方法包括WHO推薦的快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)、OIE推薦的熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)。雖然二者可以精確測定狂犬病中和抗體水平的高低，但是，二者均釆用活的細(xì)胞和病毒進(jìn)行測定，操作復(fù)雜，需要時(shí)間長，影響因素較多。近年來，先后發(fā)展了多種狂犬病中和抗體檢測技術(shù)，如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、間接ELISA技術(shù)、層析診斷試紙條技術(shù)等，這些技術(shù)和上述兩種推薦方法相比，敏感性和特異性均較差，獲得的抗體效價(jià)值差異較大，且不能準(zhǔn)確定量，尤其是對(duì)中和抗體臨界值(0.5IU/ml)左右的抗體水平測定效果難以做出準(zhǔn)確的測定。因此，幵發(fā)一種可以簡單快速且準(zhǔn)確測定狂犬病中和抗體的方法具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開一種人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒，該試劑盒利用標(biāo)記的狂犬病中和性抗體、標(biāo)準(zhǔn)血清和包被抗原，能夠簡單快速準(zhǔn)確定量地檢測人和動(dòng)物血清中的狂犬病中和抗體。本發(fā)明提供了上述檢測試劑盒的制備和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是以含有狂犬病病毒糖蛋白的溶液作為包被抗原，以酶標(biāo)記的抗狂犬病病毒糖蛋白抗體作為指示，待檢血清和標(biāo)記抗體混合并與包被抗原反應(yīng)后，通過與已知人或動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)比，計(jì)算人或動(dòng)物血清中狂犬病中和抗體水平的競爭ELISA。包被抗原可以是狂犬病病毒顆粒或單一的病毒糖蛋白。所述的狂犬病病毒培養(yǎng)液為B服-21細(xì)胞等可以支撐狂犬病病毒生長的細(xì)胞培養(yǎng)出的病毒液。其酶標(biāo)抗體指的是抗狂犬病病毒糖蛋白的中和抗體。使用的已知中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清，指的是采用狂犬病疫苗免疫人和動(dòng)物，分別收獲其血清后，與WHO和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清比對(duì)標(biāo)定，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的標(biāo)準(zhǔn)血清。使用的標(biāo)準(zhǔn)血清，針對(duì)檢測對(duì)象的不同，分別來自人和動(dòng)物的狂犬病抗血清。具體制備工藝包括以下步驟采用狂犬病病毒顆粒或病毒糖蛋白包被酶聯(lián)板，以中和效價(jià)分別為0、0.25、0.5、1、2、4和8IU/ml的血清作為標(biāo)準(zhǔn)，將酶標(biāo)記的狂犬病中和抗體按一定比例與待檢血清混合，與包被在酶聯(lián)板上的狂犬病抗原反應(yīng)，顯色后根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)血清中和抗體效價(jià)，計(jì)算待檢血清的中和抗體效價(jià)，從而定量確定人和動(dòng)物的狂犬病免疫水平。其中采用的包被抗原溶液，可以是狂犬病病毒顆粒，也可以是單一的狂犬病病毒糖蛋白?？袢〔《绢w粒是通過BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒，狂犬病病毒糖蛋白由狂犬病病毒顆粒純化而來或是基因工程表達(dá)產(chǎn)物。酶標(biāo)抗體來自狂犬病病毒糖蛋白高度免疫的動(dòng)物抗血清、或抗糖蛋白單克隆抗體、或采用細(xì)胞系生產(chǎn)的基因工程抗狂犬病糖蛋白抗體。標(biāo)準(zhǔn)血清為狂犬病疫苗免疫的人或動(dòng)物的血清，是通過與WHO和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清比對(duì)標(biāo)定的針對(duì)不同檢測宿主(人或動(dòng)物)的血清?？袢≈泻涂贵w競爭ELISA檢測試劑盒的制備與應(yīng)用方法1.包被抗原的制備和包被包被用抗原包括以下3類(1)將狂犬病病毒接種朋K-21細(xì)胞后，孵育7296h后，收獲培養(yǎng)液。包被時(shí)用包被液將病毒稀釋成總蛋白濃度為100"g/ml，取100yl加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜；(2)將上述培養(yǎng)的病毒通過梯度離心和裂解的方法，破壞狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)，通過層析分離獲得糖蛋白。包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4"g/ml，取100yl加到酶聯(lián)板上，4。C包被過夜；(3)利用狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞系，獲得穩(wěn)定表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞系，將收獲培養(yǎng)的細(xì)胞系后，用包被液將糖蛋白稀釋成4iig/ml，按100yl/孔的量，4'C包被酶聯(lián)板過夜。2.酶聯(lián)板的封閉和保存上述包被的酶聯(lián)板取出后，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100y1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37'C放置lh。棄封閉液后，采用鋁箔袋真空封口，4'C保存。3.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備分別以市售的疫苗按照免疫程序免疫人、犬和貓，采集免疫前及免疫后2周的血液，分離血清，采用FAVN技術(shù)分別測定血清中的狂犬病中和抗體效價(jià)，根據(jù)效價(jià)水平，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，制成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0國際單位(IU)/ml的標(biāo)準(zhǔn)血清，再次利用FAVN對(duì)稀釋的血清進(jìn)行效價(jià)確定。無菌分裝保存?zhèn)溆谩?.中和性抗體的制備和標(biāo)記中和性抗體的制備包括下3種方法(1)抗糖蛋白中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，腹腔接種BALB/c小鼠腹腔，約兩周后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，穿刺采取腹水，獲得單克隆抗體。(2)將純化的狂犬病病毒糖蛋白高度免疫動(dòng)物后，采集血清，獲得血清中和性抗體。(3)通過基因工程手段，利用細(xì)胞系表達(dá)中和性抗體。對(duì)以上方法獲得的抗體以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，進(jìn)行抗體純化。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良的過碘酸鈉法進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。5.試劑盒的其他成分、組裝及保存TMB顯色液購自Invitrogen公司、終止液為0.2M的硫酸、洗液為Sigma公司的PBS—吐溫20緩沖液(pH7.4)。真空包裝鋁箔塑料袋定做。坐標(biāo)紙一張。說明書一份。試劑盒保存在4C冰箱中。6.血清中狂犬病中和抗體效價(jià)的測定程序取人或動(dòng)物血清50ul，在Eppendorf管中混合等量的酶標(biāo)記的中和性單克隆抗體工作液，加入96孔板中以后，放在37'C濕盒中反應(yīng)lh，取出甩掉反應(yīng)液，利用PBS-吐溫20緩沖液淋洗3遍，3min/次，加入顯色液，放置37。C濕盒中反應(yīng)15min，取出加入終止液100u1，在酶聯(lián)檢測儀上讀取0D45,)數(shù)值。以標(biāo)準(zhǔn)血清的OD很,值為橫軸，已知中和效價(jià)為縱軸，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待檢血清樣品測定的0D45。值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出對(duì)應(yīng)的中和效價(jià)(IU/ral)。本發(fā)明的積極效果在于該試劑盒可以準(zhǔn)確地定量測定狂犬病病毒中和抗體，其操作簡單，所用時(shí)間短，和冊(cè)0、OIE推薦的中和試驗(yàn)方法檢測結(jié)果具有良好的一致性。圖l人血清OD，值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2犬血清OD報(bào),值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3貓血清OD⑩值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1:試劑盒的制備方法(一)1.狂犬病病毒的制備和包被狂犬病病毒接種BHK-21單層細(xì)胞，培養(yǎng)34天后，凍融2次，裂解細(xì)胞，收獲培養(yǎng)液。包被時(shí)用包被液將病毒稀釋成總蛋白濃度為100ug/ml，取100u1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜；以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100y1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37'C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4°C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60ul，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60yl，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白中和性單克隆抗體的標(biāo)記抗糖蛋白中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，腹腔接種BALB/c小鼠腹腔，約兩周后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，穿剌采取腹水。以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化腹水內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良的過碘酸鈉法對(duì)上述兩株單抗分別進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一20。C保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)OD，值為LO時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為100Pg/ml(如表1所示)。表1不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表2所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表2狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50ii1與50u1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50"1與50"1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100ul，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100nl終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD，值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例2:試劑盒的制備方法(二)1.狂犬病病毒的制備和包被狂犬病病毒接種BHK-21單層細(xì)胞，培養(yǎng)34天后，凍融2次，裂解細(xì)胞，收獲培養(yǎng)液。包被時(shí)用包被液將病毒稀釋成總蛋白濃度為100ug/ml，取100u1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜；以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100u1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37'C放置lh后，棄封閉液，釆用鋁箔袋真空封口，4'C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.ORJ/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60ul，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60ul，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白血清抗體的標(biāo)記將純化的狂犬病病毒糖蛋白高度免疫動(dòng)物后，采集血清，以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化血清內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(冊(cè)P)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)0D"。值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為100Pg/ml(如表3所示)。表3不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)1:8001:16001:32001:6400502.1001.4320.9680.4661002.245L6791.0210.6341502.3611.8471.2110.7782002.4041.9111.3420.8765.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表4所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表4狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容編號(hào)內(nèi)容數(shù)量備注1說明書l份2預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板1塊(96孔)3-13-7人和動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)參照血清各7管(08IU/ml)，60u1/管4酶標(biāo)抗體(iox)500u15抗體稀釋液5ml6PBS-T洗液(10X)25ml7顯色液10ml8終止液l(M9坐標(biāo)紙l張5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50n1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50iU待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37'C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100ul，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清0045。值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例3:試劑盒的制備方法(三)1.狂犬病病毒的制備和包被狂犬病病毒接種BHK-21單層細(xì)胞，培養(yǎng)34天后，凍融2次，裂解細(xì)胞，收獲培養(yǎng)液。包被時(shí)用包被液將病毒稀釋成總蛋白濃度為100yg/ml，取100u1加到酶聯(lián)板上，4"C包被過夜；以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100ii1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01°/。硫柳汞)，37'C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4'C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ILJ/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60iil，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60ul，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白基因工程抗體的標(biāo)記通過基因工程手段，利用細(xì)胞系表達(dá)中和性抗體。以A鵬rsham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化基因工程表達(dá)的抗糖蛋白抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(PH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，結(jié)果為2.0mg/ml。超濾濃縮至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度IOmg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔0D45(,值，當(dāng)0D45。值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為lOOM/ml(如表5所示)。表5不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD報(bào),值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表6所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表6狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50ix1與50yl不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50wl與50"1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100ul，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD45。值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD，值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例4:試劑盒的制備方法(四)1.純化的狂犬病病毒糖蛋白的制備和包被實(shí)施例1中的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，通過梯度離心和裂解的方法，破壞狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4txg/ml，取100y1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100y1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37。C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4'C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.OIU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60^1，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60yl，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。3.抗糖蛋白中和性單克隆抗體的標(biāo)記抗糖蛋白中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，腹腔接種BALB/c小鼠腹腔，約兩周后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，穿刺采取腹水。以Amersh柳公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化腹水內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良的過碘酸鈉法對(duì)上述兩株單抗分別進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD柳值，當(dāng)OD報(bào),值為l.O時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為4化/na(如表7所示)。表7不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表8所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4。C保存。表8狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50nl與50u1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50"1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100iil，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD很,值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例5:試劑盒的制備方法(五)1.純化的狂犬病病毒糖蛋白的制備和包被實(shí)施例1中的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，通過梯度離心和裂解的方法，破壞狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4wg/ml，取IOOp1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100u1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37。C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4。C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ral，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60nl，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入E卯endorf管，每管60ul，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白血清抗體的標(biāo)記將純化的狂犬病病毒糖蛋白高度免疫動(dòng)物后，采集血清，以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化血清內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10rag/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)0D化。值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為扭g/ml(如表9所示)。表9不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)Pg/ml1:8001:16001:32001:640032.1001.4320.9680.艦42.2451.6791.0210.63452.3611.8471.2110.77862.4041.9111.3420.8765.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表10所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表10狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容編號(hào)內(nèi)容數(shù)量備注1說明書1份2預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板1塊(96孔)3-1~3-7人和動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)參照血各7管(08nJ/ml)，60ii1/18清管4酶標(biāo)抗體(iox)500u15抗體稀釋液5ml6PBS-T洗液(10X)25ml7顯色液麵8終止液10ml9坐標(biāo)紙l張5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50n1與50u1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50u1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100pl，37。C濕盒中顯色15min,每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD柳)值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清0D4M值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例6:試劑盒的制備方法(六)1.純化的狂犬病病毒糖蛋白的制備和包被實(shí)施例1中的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，通過梯度離心和裂解的方法，破壞狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4yg/ml，取100ul加到酶聯(lián)板上，4。C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100U1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37。C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4'C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別釆取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60yl,作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60ul，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白基因工程抗體的標(biāo)記通過基因工程手段，利用細(xì)胞系表達(dá)中和性抗體。以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化基因工程表達(dá)的抗糖蛋白抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，結(jié)果為2.0mg/ml。超濾濃縮至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(服P)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度IOmg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，—20。C保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD45。值，當(dāng)0D4幼值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為化g/ml(如表11所示)。表11不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表12所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表12狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50y1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50y1與50u1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100ul，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD，值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例7:試劑盒的制備方法(七)1.表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白細(xì)胞系的制備和包被利用狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)染B服-21細(xì)胞系，獲得穩(wěn)定表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞系，將收獲培養(yǎng)的細(xì)胞系后，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4yg/ml，取100w1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100"1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37。C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4°C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60Hl，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別釆取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60yl，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。3.抗糖蛋白中和性單克隆抗體的標(biāo)記抗糖蛋白中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，腹腔接種BALB/c小鼠腹腔，約兩周后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，穿刺采取腹水。以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化腹水內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良的過碘酸鈉法對(duì)上述兩株單抗分別進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)0D45。值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為叫g(shù)/ml(如表13所示)。表13不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的0D45。值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)Pg/ml1:8001:16001:32001:640032.1001.4320.9680.46642.2451.6791.0210.63452.3611.8471.2110.778<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表14所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4'C保存。表14狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50ul與50yl不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50u1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37。C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以raS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100yl，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100yl終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD報(bào))值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD，值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例8:試劑盒的制備方法(八)1.表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白細(xì)胞系的制備和包被利用狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)染B服-21細(xì)胞系，獲得穩(wěn)定表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞系，將收獲培養(yǎng)的細(xì)胞系后，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4ug/ml，取100"1加到酶聯(lián)板上，4'C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100ii1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37r放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4'C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0,免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60"1，作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一20。C保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入E卯endorf管，每管60ul，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白血清抗體的標(biāo)記將純化的狂犬病病毒糖蛋白高度免疫動(dòng)物后，采集血清，以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化血清內(nèi)抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，稀釋至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(冊(cè)P)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一20。C保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)OD，值為l.O時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為化g/ml(如表15所示)。表15不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)1，1:16001:32001:640032.1001.4320.9680眉42.2451.6791.0210.63452.3611.8471.2110.77862.4041.9111.3420.8765.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表16所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4t:保存。表16狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容編號(hào)內(nèi)容數(shù)量備注l份1塊(96孔)各7管(08IU/ml)，60u1/管1說明書2預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板人和動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)參照血3—13—1清<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5ml。(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50ii1與50u1不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50u1與50u1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37"溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100iil，37'C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD.傾值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清OD，值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例9:試劑盒的制備方法(九)1.表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白細(xì)胞系的制備和包被利用狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞系，獲得穩(wěn)定表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞系，將收獲培養(yǎng)的細(xì)胞系后，通過層析等方法，分離獲得糖蛋白，將糖蛋白溶解到磷酸鹽緩沖液中，包被時(shí)用包被液將糖蛋白稀釋成4tig/ml，取100u1加到酶聯(lián)板上，4。C包被過夜后取出，以PBS-吐溫20緩沖液淋洗三遍，每孔內(nèi)加入100ii1封閉液(含5%脫脂奶粉和0.01%硫柳汞)，37'C放置lh后，棄封閉液，采用鋁箔袋真空封口，4°C保存。2.標(biāo)準(zhǔn)血清的制備2.1人標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售人用狂犬病疫苗(大連金港安迪生物制品有限公司)，按照暴露前免疫程序，對(duì)志愿者進(jìn)行3次免疫，免疫前及末次免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。結(jié)果免疫前中和效價(jià)為0，免疫后14天，血清中和抗體效價(jià)為40.5IU/ml，以免疫前血清將40.5IU/ml的免疫后血清稀釋成O.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清l次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60^1,作為標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。2.2動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清的制備購買市售獸用狂犬病疫苗(美國富道動(dòng)物保健公司)，對(duì)狂犬病抗體陰性的犬和貓分別進(jìn)行1次免疫，免疫前及免疫后14天，分別采取血液，分離血清。以熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)檢測血清中和抗體效價(jià)。以免疫前血清將免疫后血清稀釋成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0IU/ml。再以FAVN法檢測上述稀釋血清1次，結(jié)果與計(jì)算數(shù)值完全符合。上述稀釋后血清，無菌分裝入Eppendorf管，每管60yl，分別作為犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)血清，于一2(TC保存。3.抗糖蛋白基因工程抗體的標(biāo)記通過基因工程手段，利用細(xì)胞系表達(dá)中和性抗體。以Amersham公司的nProteinAS印harose4F親和層析凝膠，按說明書操作，純化基因工程表達(dá)的抗糖蛋白抗體。純化后抗體以甘氨酸緩沖液(pH3.0)溶解，紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度，結(jié)果為2.0mg/ml。超濾濃縮至5mg/ml后，參考有關(guān)文獻(xiàn)，以改良過碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。標(biāo)記后的抗體，以S印hardexG75凝膠過柱純化后，加入終濃度10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和等體積甘油，一2(TC保存。4.抗原、抗體最適工作濃度的選擇用方陣法對(duì)直接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇。以0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液為包被介質(zhì)將包被抗體稀釋成不同濃度，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度均與不同濃度的酶標(biāo)抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以酶標(biāo)儀讀取各孔OD，值，當(dāng)0045。值為1.0時(shí)，抗原抗體用量較少，此時(shí)抗原和抗體的濃度即為工作濃度。經(jīng)方陣法測定，直接競爭ELISA中酶標(biāo)抗體的工作濃度為1:3200，相應(yīng)的抗原包被濃度為扭g/ml(如表17所示)。表17不同稀釋度的酶標(biāo)抗體和包被抗原組合的OD，值抗原包被濃度酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5.試劑盒的組成和使用方法5.1試劑盒的組成按表18所列試劑盒內(nèi)容，裝配試劑盒，組裝后于4。C保存。表18狂犬病中和性抗體競爭ELISA檢測試劑盒內(nèi)容<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5.2試劑盒操作說明(1)以滅菌蒸餾水將PBS-T洗液(10X)稀釋至250ml;將酶標(biāo)抗體稀釋(10X)至5mL(2)打開鋁塑復(fù)合袋，取出預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板，以稀釋好的PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(3)以稀釋好的酶標(biāo)抗體50yl與50ul不同效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清混合，按效價(jià)梯度依次加入酶標(biāo)板的A1G1孔內(nèi)。以稀釋好的酶標(biāo)抗體50ii1與50"1待檢血清混合，加入酶標(biāo)板其它孔內(nèi)，作好記錄，37'C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，以PBS-T洗液洗板3次，每次3min。(5)加TMB顯色液，每孔100ul，37。C濕盒中顯色15min，每孔加100ul終止液終止反應(yīng)。(6)在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD，值。(7)在坐標(biāo)紙上，繪制標(biāo)準(zhǔn)參照血清的中和效價(jià)(縱軸)與相應(yīng)OD，值(橫軸)間的曲線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。(8)在標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸上找到待測血清0D45。值的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱軸坐標(biāo)，即為待測血清的狂犬病中和效價(jià)(IU/ml)。實(shí)施例10:試劑盒檢測人血清中和抗體的應(yīng)用20份待檢人血清，編號(hào)分別為120，按實(shí)施例5進(jìn)行狂犬病中和抗體檢測，人標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢人血清OD，值見表19，繪制標(biāo)準(zhǔn)平滑曲線如圖1，所有血清0^。值與其中和效價(jià)的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表19。表19標(biāo)準(zhǔn)血清、待檢人血清OD，值及其中和抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>參見圖1人血清OD，值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例11:動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒的應(yīng)用1.犬狂犬病中和抗體的檢測24份待檢犬血清，編號(hào)分別為124,按實(shí)施例5進(jìn)行狂犬病中和抗體檢測，犬科動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢犬血清0D45。值見表20，繪制標(biāo)準(zhǔn)平滑曲線如圖2，所有血清OD他,值與其中和效價(jià)的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表20。表20標(biāo)準(zhǔn)血清、待檢犬血清OD，值及其中和抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>參見圖2犬血清0D45。值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.貓狂犬病中和抗體的檢測22份待檢貓血清，編號(hào)分別為122，按實(shí)施例5進(jìn)行狂犬病中和抗體檢測，貓科動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢貓血清OD，值見表21，繪制標(biāo)準(zhǔn)平滑曲線如圖3，所有血清OD，值與其中和效價(jià)的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表21。表21標(biāo)準(zhǔn)血清、待檢貓血清0D45。值及其中和抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>參見圖3貓血清OD，值與相應(yīng)中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線權(quán)利要求1、一種人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒，其特征在于以含有狂犬病病毒糖蛋白的溶液作為包被抗原，以酶標(biāo)記的抗狂犬病病毒糖蛋白抗體作為指示，待檢血清和標(biāo)記抗體混合并與包被抗原反應(yīng)后，通過與已知人或動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)比，計(jì)算人或動(dòng)物血清中狂犬病中和抗體水平的競爭ELISA。2、權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被抗原可以是狂犬病病毒顆?；騿我坏牟《咎堑鞍住?、權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的狂犬病病毒培養(yǎng)液為BHK-21細(xì)胞等可以支撐狂犬病病毒生長的細(xì)胞培養(yǎng)出的病毒液。4、權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其酶標(biāo)抗體指的是抗狂犬病病毒糖蛋白的中和抗體。5、權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于使用的己知中和效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)血清，指的是采用狂犬病疫苗免疫人和動(dòng)物，分別收獲其血清后，與WHO和OIE標(biāo)準(zhǔn)血清比對(duì)標(biāo)定，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的標(biāo)準(zhǔn)血清。6、權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于使用的標(biāo)準(zhǔn)血清，針對(duì)檢測對(duì)象的不同，分別來自人和動(dòng)物的狂犬病抗血清。全文摘要本發(fā)明公開一種人和動(dòng)物狂犬病中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒，該試劑盒利用標(biāo)記的狂犬病中和性抗體、標(biāo)準(zhǔn)血清和包被抗原，能夠簡單快速準(zhǔn)確定量地檢測人和動(dòng)物血清中的狂犬病中和抗體。采用狂犬病病毒顆?；虿《咎堑鞍装幻嘎?lián)板，將酶標(biāo)記的狂犬病中和抗體按一定比例與待檢血清及標(biāo)準(zhǔn)血清分別混合，與包被在酶聯(lián)板上的狂犬病病毒糖蛋白抗原反應(yīng)，顯色后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)的OD值與已知中和效價(jià)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待檢血清反應(yīng)的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得相應(yīng)的中和抗體效價(jià)。該試劑盒可以準(zhǔn)確地定量測定狂犬病病毒中和抗體，其操作簡單，所用時(shí)間短，和WHO、OIE推薦的中和試驗(yàn)方法檢測結(jié)果具有良好的一致性。文檔編號(hào)G01N33/53GK101251537SQ20081005046公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日發(fā)明者曄劉,菲張,張守峰,扈榮良申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所