專(zhuān)利名稱(chēng)：：煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條及其制備方法煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用發(fā)明涉及一種煙草病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種煙劃復(fù)合病毒的快速檢測(cè)試約條，還涉及這種試紙條的制備方法。技術(shù)背景20世紀(jì)90年代以來(lái)，煙草病毒病在我國(guó)煙區(qū)頻頻發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已成為煙草生產(chǎn)上威脅最大的一類(lèi)災(zāi)害，2003年我國(guó)煙草因煙草病毒病經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50419.459萬(wàn)元。當(dāng)前，煙草病毒病還呈現(xiàn)出病毒病種類(lèi)不斷增加和多種病毒復(fù)合感染的新特點(diǎn)。常見(jiàn)的復(fù)合感染病毒有煙草普通花葉病(TMV)、黃瓜花葉病(CMV)、馬鈴薯Y病毒病(PVY)。由于煙草病毒病迄今尚無(wú)有效的防治措施，因此，煙草病毒病的防治應(yīng)突出早檢測(cè)、早預(yù)報(bào)、早防治。目前煙草病毒的檢測(cè)方法有電鏡法和血清學(xué)法兩種。電鏡法是檢測(cè)病毒最可靠最有效，主要有負(fù)染法和組織超薄切片法，可以直接觀察到病毒的形態(tài)特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及病毒混合感染的情況。血清學(xué)法需要制備完整病毒的抗血清，用各種血清反應(yīng)方法進(jìn)行檢測(cè)。但這兩種方法都需要將樣品中病毒或核酸提取和純化，需要超高速離心機(jī)以及電子顯微鏡等設(shè)備，雖然血清學(xué)法特異性比較強(qiáng)，但在病毒濃度較低時(shí)，制備的抗血清效價(jià)不高,檢測(cè)效果不理想。在我國(guó)煙草病毒的檢測(cè)方法主要是采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、PCR檢測(cè)法和核酸點(diǎn)雜交法等。這些方法僅適宜于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不能用于田間快速檢測(cè)。而且目前煙草病毒的檢測(cè)試紙條，每種試紙條只能檢測(cè)一種煙草病毒，功能單一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種可快速簡(jiǎn)便地進(jìn)行檢測(cè)且可靠性高的煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條，以及這種試紙條的制備方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條，該試紙條是在PVC層上設(shè)膠體金層析檢測(cè)試紙，膠體金層析檢測(cè)試紙的一端搭接引水層，另一端搭接吸水層，膠體金抗體結(jié)合物硝酸纖維素膜設(shè)在引水層下與膠體金層析檢測(cè)試紙銜接，膠體金層析檢測(cè)試紙上設(shè)檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)由羊多克隆抗體點(diǎn)樣形成的，質(zhì)控線(xiàn)是由兔多克隆抗體點(diǎn)樣形成的。上述煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法，由以下步驟a.煙草復(fù)合病毒抗原的制備5①分別取感染煙草花葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的發(fā)病煙草葉片，加兩倍體積內(nèi)含O.1%的巰基乙醇的0.lmol/LPBSpH7.2，研碎，過(guò)濾；②在步驟①所得濾液中加7-9%正丁醇，攪拌12-18min;③取步驟②所得濾液10000g離心30min，棄沉淀，得上清液；④將步驟③所得上清液中加入3-5%PEG、2-4%NaCl攪拌至溶解，4。C冰箱內(nèi)過(guò)夜；⑤取步驟④所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液；⑥將步驟⑤所得沉淀物溶于0.01mol/LPBSpH7.2緩沖液中，緩沖液加入量是步驟④制得溶液每100ml加20ml的量，取10000g溶液離心12-18min，取上清；⑦將步驟⑥所得上清液按每10ml加入0.4gNaCl及0.4gPEG，隨加隨攪拌至溶解，然后放置于4'C冰箱內(nèi)過(guò)夜；⑧取步驟⑦所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液，按步驟⑦所得溶液每100ml用2ml的量的0.Olmol/LPBS將沉淀物溶解；⑨取步驟⑧所得溶液10000g離心12-18min，棄沉淀得上清液，上清液即為粗提純病毒液，分別將提純的病毒液體保存在4"C冰箱內(nèi)即可；⑩蔗糖梯度是用0.lmol/LPBSpH7.2緩沖液進(jìn)行配制，配制成10%_40%的蔗糖濃度梯度，按等量小心依次從高濃度到低濃度加入到離心管中，在4"C下放置過(guò)夜，形成連續(xù)的密度梯度，將1.6ml病毒液加入梯度柱上，超速離心25000rpm，1.5h，棄上清，離心后將上清液中形成的條帶從離心管中用注射器抽提出來(lái)，使用透析袋進(jìn)行脫糖，脫糖后超速離心40000rpm，1.5h，棄上清，用lml0.lmol/LpH7.2PBS緩沖液溶解所得的沉淀物，即為精提純病毒液，作為純化的煙草病毒抗原用；b.兔多克隆抗體的制備抗原注射量為0.10.2mg/kg，每次注射抗原用量0.03~0.1mg，選用2~3Kg的兔子，采取靜脈注射方式注射，分三次完成，間隔時(shí)間為10d，用無(wú)菌生理鹽水將抗原即純化的煙草普通花葉病(TMV)、黃瓜花葉病(CMV)、馬鈴薯Y病毒病(PVY)稀釋為2mg/ml，第一次注射加等量的完全Freund's佐劑F5881(Sigma公司)，然混合均勻，注射便可，第二次注射是加等量的不完全佐劑F5506(Sigma公司)，混合均勻注射，第三次同第二次相同，末次注射10d后進(jìn)行放血，放血前動(dòng)物禁食12h，采用耳靜脈放血40-60ml，收集后離心除去血細(xì)胞，純化得兔多克隆抗體，將制得的兔多克隆抗體在-20。C保存，再將制得的煙草花葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的兔多克隆抗體按重量比1:1:1混合得純化的煙草復(fù)合病毒抗體，將制得的煙草復(fù)合病毒抗體在6-2(TC保存；C.羊多克隆抗體市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)得到，本發(fā)明用的是北京瑞澤康科技有限公司，編號(hào)JA27名稱(chēng)羊抗兔IgG規(guī)格0.5ml;d.膠體金的制備取0.01%HAuCU100ml，加入1%檸檬酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15-30min，直至顏色變紅，冷卻至常溫加入0.1M/L&(:03溶液0.2-lml，混勻即可，調(diào)pH至7.2-7.5，得膠體金溶液，然后用0.22pm濾膜進(jìn)行過(guò)濾制得20-30nm膠體金顆粒；e.膠體金抗體結(jié)合物的制備取步驟b制得的lmg純化的煙草復(fù)合病毒抗體，邊攪拌邊注入到30-60ml步驟d制得的膠體金溶液中，15-30度下攪拌lh，然后加入10%牛血清蛋白2-5ml，15-30度下攪拌5min,12000-15000rpm離心50min，沉淀溶于4-10mlTBS緩沖液中，所述緩沖液的成分及含量如下四硼酸鈉O.lg，BSA0.25g,用6mol/LHC1調(diào)pH至7.4，補(bǔ)水至250mL,用0.45p，用0.45pm濾膜過(guò)濾即可得到膠體金抗體結(jié)合物，4'C保存；f.膠體金層析檢測(cè)試紙制備將步驟e制得的膠體金抗體結(jié)合物3ml和3ml稀釋液混勻，所述稀釋液的成分及含量如下Na2HPCV12H206.1g，NaCl8.5g，PVP405g,硼酸2.1g，PEGlg，10%BSA50mL，用6mol/LHC1調(diào)pH至7.07.5，加水使終體積為1L，將玻璃纖維素紙放入混勻后的溶液中浸泡5-15min，取出在25-4rC烘箱中烤干，熱合封口，得膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素紙，4°C保存?zhèn)溆?；然后將步驟b制得的煙草復(fù)合病毒兔多克隆抗體用PBSPH7.4緩沖液稀釋成3mg/ml，取1^1稀釋后的煙草復(fù)合病毒兔多克隆抗體點(diǎn)樣在NC膜上，即成檢測(cè)線(xiàn)，所述的NC膜是硝酸纖維素膜，將步驟c的煙草復(fù)合病毒羊多克隆抗體用固相溶液稀釋成lmg/ml，取lpl稀釋后的煙草復(fù)合病毒羊多克隆抗體點(diǎn)樣在NC膜上，即成質(zhì)控線(xiàn)，這樣帶檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的NC膜便是固相抗體NC膜，固相抗體NC膜在0.5。/。BSA封閉液中，37。C下孵育lh后，在0.02mol/LPBpH7.0洗滌液中洗2次，室溫下風(fēng)干即得膠體金層析檢測(cè)試紙，4-8'C保存；g.煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備取一塊潔凈的PVC板，將步驟f制得的膠體金層析檢測(cè)試紙固定在PVC板適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，將引水材料連接在的膠體金層析檢測(cè)試紙下端即成吸水紙層，吸水材料連接在膠體金層析檢測(cè)試紙的上端，膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素膜置于引水材料下與膠體金層析檢測(cè)試紙銜接，用切割機(jī)將組裝后的PVC板縱向切成5-7mm寬的測(cè)試條，將其裝入板殼即樣品墊即可。上述煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法，所述步驟a②在濾液中加8%正丁醇，攪拌15min，④在上清液中加入4%PEG、3%NaCl攪拌至溶解，4。C冰箱內(nèi)過(guò)夜，離心15min，⑧離心15min，⑨取步驟⑧所得溶液10000g離心15min，步驟d.膠體金的制備中加熱煮沸23min，直至顏色變紅，PH值調(diào)至7.4，步驟e.膠體金抗體結(jié)合物的制備取步驟b制得的lmg純化的煙草復(fù)合病毒抗體，邊攪拌邊注入到45ml膠體金溶液中，23度下攪拌lh，然后加入10%牛血清蛋白3.5ml，23度下攪拌5min，13500rpm離心50min，沉淀溶于7mlTBS緩沖液中，用0.45pm濾膜過(guò)濾即可得到膠體金-抗體結(jié)合物，4'C保存，步驟f.膠體金層析檢測(cè)試紙制備將步驟e制得的膠體金抗體結(jié)合物3ml和3mlTBS緩沖液混勻，滴加入玻璃纖維浸泡10min，取出在33'C烘箱中烤干，熱合封口，4'C保存?zhèn)溆?；步驟g.煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備用切割機(jī)將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測(cè)試條，將其裝入板殼即樣品墊即可。上述煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法所述步驟b、c和d可以同時(shí)進(jìn)行也可以分別進(jìn)行。上述步驟中，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，PVP40是聚乙烯吡咯烷酮40000，PEG是聚乙二醇，PVP和PVP40是常規(guī)的生化試劑，BSA是牛血清蛋白，TrtonX是聚乙二醇辛基苯基醚，PB是聚丁烯。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明檢測(cè)適溫15-35'C，檢樣量0.1-0.3g的樣品，相當(dāng)于葉面積大約3-5cm2;將煙葉在裝有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條浸入，30min出結(jié)果；假陽(yáng)性率低于1%。可見(jiàn)本發(fā)明使用方便，特別適用于田間快速檢測(cè)，并且可靠性很高，而且本發(fā)明能檢測(cè)多種煙草病毒，適合煙草復(fù)合病毒的檢測(cè)，功能較全面。圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例列表如表l:表l是本發(fā)明的實(shí)施例列表表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>NaCl2%2.5%3%3.5%4%⑥離心時(shí)間min1214151718⑧離心時(shí)間min1213151718離心時(shí)間min1214151818步驟b選制抗原兔子Kg22.12.532.9抗原注射量mg0.030.050.070.090.1力口熱時(shí)間min1518232930步驟dK2C03ml0.20.30.60.91PH值7.27.27.27.27.2膠體金顆粒nm2022252830膠體金溶液ml3032455860攪拌溫度°c1518232930步驟e牛血清蛋白ml22.53.54.55離心速度rpm120001280013500145(1015000TBS加入量ml4910浸泡時(shí)間min7101415步驟f烘箱溫度°c2530334041保存溫度°C448步驟g測(cè)試條寬度mm5.5678步驟序號(hào)參數(shù)實(shí)施例6實(shí)施例7實(shí)施例8實(shí)施例9實(shí)施例10②正丁醉7%7.5%8%8.5%9%攪拌時(shí)間min1214151718④PEG3%3.4%4%4.5%5%步驟a⑤NaCl2%2.5%3%3.5%4%離心時(shí)間min1214151718⑧離心時(shí)間min1213151718離心時(shí)間min1214151818步驟b選制抗原兔子Kg22.12.532.9抗原注射量mg0.030.050.070.090.1步驟d加熱時(shí)間min1518232930K2CO3ml0.20.30.60.91PH值7.257.257.257.257.259<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>離心速度ipm135001280013500145W15000TBS加入量ml6910步驟f浸泡時(shí)間min8101415烘箱溫度°c3030334041保存溫度°c478步驟g測(cè)試條寬度mm65.5678步驟序號(hào)參數(shù)實(shí)施例31實(shí)施例32實(shí)施例33實(shí)施例34實(shí)施例35步驟a②正丁醉9%8.5%8%7,5%7%攪拌時(shí)間min1412171518PEG5%3.4%4%4.5%3%NaCl4%2.5%3%3.5%2%⑥離心時(shí)間min1512151718離心時(shí)間min1318151712離心時(shí)間min1214151818步驟b選制抗原兔子Kg22.12.532.9抗原注射量mg0.10.090.070.050.03步驟d加熱時(shí)間min1518232930K2C03ml0.20.30.60.91PH值7.47.27.37.357.4膠體金顆粒nm2022252830步驟e膠體金溶液ml3032455860攪拌溫度°C1518232930牛血清蛋白ml22.53.54.5離心速度rpm1200012800135001450015000TBS加入量ml457910步驟f浸泡時(shí)間min7101415烘箱溫度°c3330254041保存溫度°c8474步驟g測(cè)試條寬度mm55.5678試紙條的使用步驟取0.1-0.3g的煙葉樣品，葉面積大約3-5cm2，在裝有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條引水端插入檢測(cè)樣中，樣品向試13紙的另一端爬行。若試紙條上只有質(zhì)控線(xiàn)出現(xiàn)紅色而檢測(cè)線(xiàn)未顯色，結(jié)果為陰性；若試紙條上質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)均出現(xiàn)紅色，結(jié)果為陽(yáng)性；若試紙條上質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)均未顯色，則說(shuō)明次試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無(wú)效。權(quán)利要求1、一種煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條，其特征在于該試紙條是在PVC層(7)上設(shè)膠體金層析檢測(cè)試紙(1)，膠體金層析檢測(cè)試紙(1)的一端搭接引水層(4)，另一端搭接吸水層(5)，膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素紙(6)設(shè)在引水層(4)下與膠體金層析檢測(cè)試紙(1)銜接，膠體金層析檢測(cè)試紙(1)上設(shè)檢測(cè)線(xiàn)(2)和質(zhì)控線(xiàn)(3)，檢測(cè)線(xiàn)(2)由兔多克隆抗體點(diǎn)樣形成的，質(zhì)控線(xiàn)(3)是由羊多克隆抗體點(diǎn)樣形成的。2、如權(quán)利要求l所述的煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于由以下步驟a.煙草復(fù)合病毒抗原的制備-①分別取感染煙草花葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的發(fā)病煙草葉片，加兩倍體積內(nèi)含O.1%的巰基乙醇的0.lmol/LPBSpH7.2，研碎，過(guò)濾；②在步驟①所得濾液中加7-9%正丁醇，攪拌12-18min;③取步驟②所得濾液10000g離心30min，棄沉淀，得上清液；④將步驟③所得上清液中加入3-5%PEG、2-4%NaCl攪拌至溶解，4'C冰箱內(nèi)過(guò)夜；⑤取步驟④所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液；⑥將步驟⑤所得沉淀物溶于0.01mol/LPBSpH7.2緩沖液中，緩沖液加入量是步驟④制得溶液每100ml加20ml的量，取10000g溶液離心12-18min，取上清；⑦將步驟⑥所得上清液按每10ml加入0.4gNaCl及0.4gPEG，隨加隨攪拌至溶解，然后放置于4"C冰箱內(nèi)過(guò)夜；⑧取步驟⑦所得溶液10000g離心12-18min，棄上清液，按步驟⑦所得溶液每100ml用2ml的量的0.Olmol/LPBS將沉淀物溶解；⑨取步驟⑧所得溶液10000g離心12-18min，棄沉淀得上清液，上清液即為粗提純病毒液，分別將粗提純的病毒液體保存在4t:冰箱內(nèi)即可；⑩蔗糖梯度是用0.lmol/LPBSpH7.2緩沖液進(jìn)行配制，配制成10%-40%的蔗糖濃度梯度，按等量小心依次從高濃度到低濃度加入到離心管中，在4'C下放置過(guò)夜，形成連續(xù)的密度梯度，將1.6ml病毒液加入梯度柱上，超速離心25000rpm，1.5h，棄上清，離心后將上清液中形成的條帶從離心管中用注射器抽提出來(lái)，使用透析袋進(jìn)行脫糖，脫糖后超速離心40000rpm，1.5h，棄上清，用lml0.1mol/LpH7.2PBS緩沖液溶解所得的沉淀物，即為精提純病毒液，作為純化的煙草病毒抗原用；b.兔多克隆抗體的制備抗原注射量為0.10.2mg/kg，每次注射抗原用量0.03~0.1mg，選用2~3Kg的兔子，采取靜脈注射方式注射，分三次完成，間隔時(shí)間為10d，用無(wú)菌生理鹽水將抗原即純化的煙草普通花葉病(TMV)、黃瓜花葉病(CMV)、馬鈴薯Y病毒病(PVY)稀釋為2mg/ml，第一次注射加等量的完全Freund，s佐劑F5881(Sigma公司)，然混合均勻，注射便可，第二次注射是加等量的不完全佐劑F5506(Sigma公司)，混合均勻注射，第三次注射步驟同第二次相同，末次注射lOd后進(jìn)行放血，放血前動(dòng)物禁食12h，采用耳靜脈放血40-60ml，收集后離心除去血細(xì)胞，純化得兔多克隆抗體，將制得的兔多克隆抗體在-2(TC保存，再將制得的煙草花葉病毒、煙草黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的兔多克隆抗體按重量比1:1:1混合得純化的煙草復(fù)合病毒抗體，將制得的煙草復(fù)合病毒抗體在-2(TC保存；c.羊多克隆抗體從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)羊多克隆抗體；d.膠體金的制備取0.01%HAuCl4100ml，加入1%檸檬酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15-30min，直至顏色變紅，冷卻至常溫加入0.1M/L1(2(:03溶液0.2_lml，混勻即可，調(diào)pH至7.2-7.5，得膠體金溶液，然后用0.22pm濾膜進(jìn)行過(guò)濾制得20-30nm膠體金顆粒；e.膠體金抗體結(jié)合物的制備取步驟b制得的lmg純化的煙草復(fù)合病毒抗體，邊攪拌邊注入到30-60ml步驟d制得的膠體金溶液中，15-30度下攪拌lh，然后加入10%牛血清蛋白2-5ml，15-30度下攪拌5min，12000-15000rpm離心5Omin，沉淀溶于4-10mlTBS緩沖液中，用0.45nm濾膜過(guò)濾即可得到膠體金抗體結(jié)合物，4'C保存；f.膠體金層析檢測(cè)試紙制備:將步驟e制得的膠體金抗體結(jié)合物3ml和3ml稀釋液混勻，所述稀釋液成分及含量如下Na2HP04*12H206.1g,NaCl8.5g，PVP405g，硼酸2.1g，PEGlg，10%BSA50mL，用6mol/LHCl調(diào)pH至7.07.5，加水至體積為1L;把玻璃纖維素紙放入混勻后的溶液中浸泡5-15min，取出在25-41'C烘箱中烤干，熱合封口，得膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素紙，4"C保存?zhèn)溆茫蝗缓髮⒉襟Eb制得的煙草復(fù)合病毒兔多克隆抗體用PBSPH7.4緩沖液稀釋成3mg/ml，取lnl稀釋后的煙草復(fù)合病毒兔多克隆抗體點(diǎn)樣在NC膜上，即成檢測(cè)線(xiàn)，將步驟c的煙草復(fù)合病毒羊多克隆抗體用固相溶液稀釋成lmg/ml，取l^il稀釋后的煙草復(fù)合病毒羊多克隆抗體點(diǎn)樣在NC膜上，即成質(zhì)控線(xiàn)，固相抗體NC膜在封閉液中，所述封閉液是0.5。/。PVP，0.5%TritonX-IOO，37'C下孵育lh后，在0.02mol/LPBpH7.0的洗滌液中洗2次，室溫下風(fēng)干即得膠體金層析檢測(cè)試紙，4-8"C保存；g.煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備取一塊潔凈的PVC板，將步驟f制得的膠體金層析檢測(cè)試紙固定在PVC板適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，將引水材料連接在的膠體金層析檢測(cè)試紙下端即成吸水紙層，吸水材料連接在膠體金層析檢測(cè)試紙的上端，膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素膜置于引水材料下與膠體金層析檢測(cè)試紙銜接，用切割機(jī)將組裝后的PVC板縱向切成5-7mm寬的測(cè)試條，將其裝入板殼即樣品墊即可。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述步驟a②在濾液中加8%正丁醇，攪拌15min，④在上清液中加入4%PEG、3%NaCl攪拌至溶解，4'C冰箱內(nèi)過(guò)夜，⑤離心15min,⑧離心15min，⑨取步驟⑧所得溶液10000g離心15min，步驟d.膠體金的制備中加熱煮沸23min，直至顏色變紅，PH值調(diào)至7.4，步驟e.膠體金抗體結(jié)合物的制備取步驟b制得的lmg純化的煙草復(fù)合病毒抗體，邊攪拌邊注入到45ml膠體金溶液中，23度下攪拌lh,然后加入10%牛血清蛋白3.5ml，23度下攪拌5min，13500rpm離心50min，沉淀溶于7mlTBS緩沖液中，用0.45拜濾膜過(guò)濾即可得到膠體金-抗體結(jié)合物，4'C保存，步驟f.膠體金層析檢測(cè)試紙制備將步驟e制得的膠體金抗體結(jié)合物3ml和3mlTBS緩沖液混勻，滴加入玻璃纖維浸泡10min，取出在33'C烘箱中烤干，熱合封口，4'C保存?zhèn)溆茫徊襟Eg.煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備用切割機(jī)將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測(cè)試條，將其裝入板殼即樣品墊即可。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條的制備方法其特征在于所述步驟b、c和d可以同時(shí)進(jìn)行也可以分別進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草復(fù)合病毒田間快速檢測(cè)試紙條，該試紙條是將膠體金層析檢測(cè)試紙固定在PVC板適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，將引水材料連接在的膠體金層析檢測(cè)試紙下端即成吸水紙層，吸水材料連接在膠體金層析檢測(cè)試紙的上端，膠體金抗體結(jié)合物玻璃纖維素膜置于引水材料下與膠體金層析檢測(cè)試紙銜接，用切割機(jī)將組裝后的PVC板縱向切成5-7mm寬的測(cè)試條，將其裝入板殼即樣品墊即可，本發(fā)明還公開(kāi)了這種試紙條的制備方法，本發(fā)明檢測(cè)適溫15～35℃，檢樣量0.1～0.3g的樣品，相當(dāng)于葉面積大約3～5cm²；將煙葉在裝有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條浸入，30min出結(jié)果；假陽(yáng)性率低于1％。可見(jiàn)本發(fā)明使用方便，特別適用于田間快速檢測(cè)，并且可靠性很高。文檔編號(hào)G01N33/558GK101556282SQ20081004951公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2008年4月9日優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日發(fā)明者欣劉,戚元成,李富欣,王豹祥,邱立友,高玉千申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)