專利名稱：一種電化學(xué)傳感界面及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種電化學(xué)用 傳感界面及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
電化學(xué)檢測技術(shù)具有靈敏度高，響應(yīng)迅速，成本低廉等優(yōu)勢，是包括DNA 在內(nèi)的生物傳感檢測的重要手段之一。需要指出的是，由于電化學(xué)檢測技術(shù)涉 及到復(fù)雜的界面問題，電化學(xué)生物傳感器尚遠(yuǎn)不如基于光學(xué)檢測技術(shù)的生物傳 感器發(fā)展成熟。而電化學(xué)傳感界面的穩(wěn)定性及抗非特異吸附的能力正是限制電 化學(xué)生物傳感檢測從基礎(chǔ)研究領(lǐng)域向?qū)嵱眯苑矫孓D(zhuǎn)變的"瓶頸"。如DNA生 物傳感檢測時，DNA探針在電極表面的固定首先要考慮實現(xiàn)其與電極的穩(wěn)定連 接及雜交活性的保持，因此電化學(xué)DNA傳感器的性質(zhì)，包括靈敏度，使用壽 命等，很大程度上與探針DNA的固定化方法密切相關(guān)。較為理想的探針固定 方法是通過末端修飾基團實現(xiàn)DNA與電極表面的共價連接，因為末端連接可 以使DNA骨架在空間構(gòu)型上具有很大的自由度，有利于堿基的暴露和雙螺旋 結(jié)構(gòu)的形成。隨著以分子自組裝技術(shù)(self-assembly monolayer)為代表的界面分 子設(shè)計技術(shù)的發(fā)展與成熟，電化學(xué)DNA生物傳感器獲得了前所未有的發(fā)展機 遇。
金電極是最為常用的電化學(xué)電極之一。由于金原子與巰基之間的自組裝過 程非常快速、穩(wěn)定，而且易于操作，通過末端巰基修飾的DNA分子從溶液本 體相自發(fā)擴散到固液界面并通過金-硫配位在金基底上牢固地吸附，形成自組裝 單分子層。但是這種方法難以避免DNA探針與金表面的非特異吸附，導(dǎo)致單 鏈DNA會平躺在金表面上，所以常常需要再組裝第二層巰基層，通常是一些 巰基小分子，如巰基己醇，它可以取代堿基與金之間的相互作用，使探針DNA 大部分是通過末端連接到電極表面上，有效地提高了雜交效率。同時，巰基己 醇還可以對非互補序列DNA在電極表面的吸附起到一定阻礙作用，降低了假 陽性檢測信號；但是它對大多數(shù)蛋白質(zhì)的吸附較為嚴(yán)重，大大限制了這種電化學(xué)界面在含有大量蛋白質(zhì)的復(fù)雜生物體系中的應(yīng)用。DNA分子以外的其它種類 的分子的電化學(xué)生物傳感檢測也存在類似的問題。
因此，本領(lǐng)域還需要研究新的基于電化學(xué)技術(shù)的傳感器，以克服現(xiàn)有傳感 器特異性差、易于出現(xiàn)假陽性等技術(shù)缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便、具有良好的特異性和穩(wěn)定性的電化
學(xué)傳感界面(分子捕獲傳感界面)。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述分子捕獲傳感界面的制備方法。 本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述分子捕獲傳感界面來檢測待測樣品中
特異性分子的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分子捕獲傳感界面，其包括 金屬基面(l);
固定于金屬基面(1)上的檢測分子(2)，其用于捕獲與其相互作用(如可發(fā)生
特異性結(jié)合)的分子；和固定于金屬基面(1)上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)，
且化學(xué)分子(3)包圍在檢測分子(2)的周圍；
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自l-12(較佳的選自1-6，更佳的是2-3)的正整數(shù)； n為選自3-15(較佳的選自5-13，更佳的為8-12，最佳的是ll)的正整數(shù)。 在一個優(yōu)選例中，所述的檢測分子(2)選自核酸(如探針)，抗體或配體。 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測分子(2)是核酸，其在金屬基面(l)上的密度是
lX10'o-5X10!3條/cm2;更佳地是lX10'2-2X103條/cm2。 在另一優(yōu)選例中，所述的金屬選自金，鉑，鈀，銀。 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測分子(2)是一端經(jīng)巰基修飾的分子。 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測分子(2)是核酸，其固定方法是將含有0.1 10
pM(優(yōu)選1-8 pM)所述檢測分子的溶液加樣到金屬基面(l)，使之鋪展覆蓋金屬
基面(l)，固定0.5-10小時，去除多余溶液；或者
在另一優(yōu)選例中，所述的檢測分子(2)是抗體，其固定方法是將含有50
500ng/mL(優(yōu)選100-300 ng/mL)抗體的溶液加樣到金屬基面(1)，使之鋪展覆蓋金屬基面(l)，固定0.5-10小時，去除多余溶液。
在另一優(yōu)選例中，化學(xué)分子(3)的固定方法是將含有l(wèi) 10mM化學(xué)分子(3) 的溶液加樣到固定了檢測分子(2)的金屬基面(1)，使之鋪展覆蓋金屬基面(l)，固 定1-16小時，去除多余溶液。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備所述的分子捕獲傳感界面的方法，所 述方法包括
(a) 在金屬基面(1)上固定檢測分子(2)，獲得固定了檢測分子(2)的金屬基面
(b) 使用具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)處理所述固定了檢測分子(2)的金屬 基面(l)，從而獲得所述的分子捕獲傳感界面；
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R選自0H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)之前，還包括步驟清洗所述的金屬基面(l)。 在一個優(yōu)選例中，步驟(a)中，所述的檢測分子(2)是核酸；且步驟(a)包括將
濃度0.1 10nM(優(yōu)選1-8 pM)所述檢測分子的溶液加樣到金屬基面(l),使之鋪
展覆蓋金屬基面(l)，固定0.5-10小時，去除多余溶液，獲得固定了檢測分子(2)
的金屬基面(l);或者
步驟(b)中，將含有1 10mM化學(xué)分子(3)的溶液加樣到所述固定了檢測分子
(2)的金屬基面(1)，使之鋪展覆蓋金屬基面(l)，固定1-16小時，去除多余溶液，
從而獲得所述的分子捕獲傳感界面。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)的用途，用 于制備所述的分子捕獲傳感界面；
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。在本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測待測樣品中與檢測分子(2)相互作用的 分子的電極，所述的電極的表面具有 金屬基面(l);
固定于金屬基面(1)上的檢測分子(2)，其用于捕獲與其相互作用的分子；和 固定于金屬基面(1)上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)，且化學(xué)分子(3)包圍在 檢測分子(2)的周圍；
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I);
其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測待測樣品中與檢測分子(2)相互作用的分 子的方法，所述方法包括
(A) 用經(jīng)可特異性催化電流反應(yīng)的酶標(biāo)記的待測樣品處理所述的電極，獲得 具有"分子捕獲傳感界面-與檢測分子(2)相互作用的分子-可特異性催化電流反應(yīng) 的酶"復(fù)合物的電極；
(B) 將(A)的電極置于含有所述可特異性催化電流反應(yīng)的酶的底物，和/或電子 傳遞媒介的溶液中；檢測電流信號，從而確定待測樣品中檢測分子(2)的存在與 否或存在的量。
可選擇地，在步驟(A)中，包括(i)用經(jīng)酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子標(biāo)記的待測 樣品處理所述的電極，獲得具有"分子捕獲傳感界面-與檢測分子(2)相互作用的 分子-酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子"復(fù)合物的電極；(ii)用"酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子的偶 聯(lián)物-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"復(fù)合物處理所述電極，從而獲得具有"分子 捕獲傳感界面-與檢測分子(2)相互作用的分子-酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子-酶聯(lián)免疫可 偶聯(lián)分子的偶聯(lián)物-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"復(fù)合物的電極。
在另一優(yōu)選例中，所述的可特異性催化電流反應(yīng)的酶選自辣根過氧化物酶 (HRP)，堿性磷酸(酯)酶(AP)，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶，或葡萄糖脫氫酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的辣根過氧化物酶的底物選自鄰苯二胺(OPD)、四 甲基聯(lián)苯胺(TMB)或2，2，-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS);所述堿性磷 酸酶的底物選自對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)或5-溴-4-氯 -3-吲哚-磷酸/硝基四氮唑藍(lán)(8(:1 ^8丁)。在另一優(yōu)選例中，所述酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子選自生物素(biotin)，地高辛， 熒光素。所述酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子的偶聯(lián)物選自親和素，抗地高辛抗體，抗 熒光素抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種檢測試劑盒，其中含有所述的電極。 在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有酶聯(lián)免疫試劑(選自但不限于辣
根過氧化物酶及其底物，堿性磷酸酶及其底物，或生物素及親和素)，電極清洗試劑等。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1為本發(fā)明的傳感界面的制備示意圖，其中A為金屬基面上組裝了檢測 分子；B為金屬基面上組裝了檢測分子和具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子。
圖2為分別用巰基己醇與垸基乙氧基硫醇修飾金電極表面對過氧化物酶吸
附后催化電流-時間曲線圖。
圖3為10 nM靶向DNA與10 nM非互補DNA對應(yīng)的酶催化反應(yīng)的循環(huán) 伏安圖。
圖4為對40個堿基長度，100 pM的乙肝病毒基因片斷在雜交緩沖液體系 與50%血清體系中檢測信號比較圖。
圖5為傳感界面對100 ng/mL乙肝表面抗原及相同濃度的牛血清蛋白的檢 測信號對比圖。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在制備電化學(xué)傳感器的過程中，在 將檢測分子組裝于金屬基面后，利用通式(I)的化合物來進行封閉組裝，所獲得 的傳感界面(捕獲界面)具有極其優(yōu)異的特異性和穩(wěn)定性，抗非特異性吸附的 能力很強，特別適用于復(fù)雜生物體系中的檢測。
如本文所用，所述的"分子捕獲傳感界面"，"分子捕獲界面"，"傳感界面"，"捕獲界面"或"捕獲傳感界面"可互換使用。
如本文所用，所述的"檢測分子"與所述的"與所述檢測分子相互作用的 分子"是指可發(fā)生結(jié)合、雜交或偶聯(lián)的兩種分子，所述的"檢測分子"可特異 性地識別"與所述檢測分子相互作用的分子"。例如，當(dāng)所述的"檢測分子" 是一種核酸探針，則"與所述檢測分子相互作用的分子"是具有與該探針相互 補的序列的核酸分子；當(dāng)所述的"檢測分子"是一種抗體，則"與所述檢測分 子相互作用的分子"是一種可與該抗體特異性結(jié)合的抗原分子。
傳感界面
本發(fā)明提供了一種分子捕獲傳感界面，其包括
金屬基面；
固定于金屬基面上的檢測分子，其用于捕獲與其相互作用(如可發(fā)生特異性 結(jié)合)的分子；和固定于金屬基面上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子，且化學(xué)分子 包圍在檢測分子的周圍；
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自l-12(較佳的選自1-6，更佳的是2-3)的正整數(shù)； n為選自3-15 (較佳的選自5-13，更佳的為8-12，最佳的是ll)的正整數(shù)。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的金屬是與硫有共價鍵或成鍵能力的金屬(也 即可發(fā)生金-硫自組裝作用)，從而可將經(jīng)含硫基團(如巰基)修飾的檢測分子固
定到所述金屬基面上。通常，所述的金屬是貴金屬，例如選自金，鉬，鈀，
銀。最佳的，采用的金屬是金。
所述的"檢測分子"是指可特異性地從樣品中識別出需要被檢測出的分子 的分子。換言之，所述需要被檢測出的分子也即"與所述檢測分子相互作用的 分子"。檢測分子的類型或序列通常根據(jù)需要被檢出的分子的類型或序列而定。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測分子選自核酸(如探針)，抗體，配體。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測分子是核酸，其在金屬基面上的密度
是1Xl(T-5X10"條/cm2 (更佳地是1X10^2Xl(^個/cm2;最佳的是1X1012 個/cr^左右)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測分子是經(jīng)含硫基團修飾的分子。含硫基團修飾的分子可通過化學(xué)鍵(如共價鍵)與金屬基面連接，從而將檢測分子固定到金 屬基面上。優(yōu)選的，所述的含硫基團是巰基。當(dāng)所述的金屬是金時，巰基與金之 間可形成的金-硫共價鍵。
本發(fā)明人的實驗充分證明，利用通式(I)所示的化學(xué)分子來封閉組裝有檢測 分子的金屬界面，經(jīng)過封閉后的傳感界面具有抗非特異吸附能力強，本底電流 小的優(yōu)勢，同時保證檢測分子的特異識別能力不受影響，可以大大提高電化學(xué) 生物傳感檢測的信噪比。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，通式(I)所示的化學(xué)分子中，R是OH，該化合物 也稱為垸基乙氧基硫醇(SH-EG-OH);更佳的，所述的化合物是n為ll, m為 2的烷基乙氧基硫醇。
傳感界面的制備
本發(fā)明還提供了一種制備所述的分子捕獲傳感界面的方法，所述方法包括
(a) 在金屬基面上固定檢測分子，獲得固定了檢測分子的金屬基面；
(b) 使用具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子處理所述固定了檢測分子的金屬基面，
從而獲得所述的分子捕獲傳感界面。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟(a)之前，還包括步驟清洗所述的金屬基面。
對基礎(chǔ)的金屬基面進行清洗有利于后續(xù)檢測分子和通式(I)分子的固定，有利于消除 非特異性結(jié)合。
當(dāng)進行固定時，檢測分子在金屬基面上的組裝密度主要取決于檢測分子的類 型、大小，檢測分子與所識別的相應(yīng)的分子之間的作用強度，以及待檢測樣品的情 況，對于已知類型的檢測分子，本領(lǐng)域人員了解適合的組裝密度。并且，組裝的密
度也可根據(jù)本領(lǐng)域人員的實踐經(jīng)驗進行調(diào)整。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測分子是核酸。本發(fā)明人實踐發(fā)現(xiàn)，將含
有0.1 10 ^M(優(yōu)選1-8 ^M，更優(yōu)選的約5 左右)所述檢測分子的溶液(其中 溶劑可以是水或水配置的常規(guī)緩沖溶液)加樣到金屬基面上是較為合適的，可獲 得較適宜的探針密度；加樣的溶液體積以以使溶液鋪展覆蓋整個金屬基面為 宜。
檢測分子在金屬基面上的組裝時間沒有特別的限制，只要所述時間足以使 檢測分子穩(wěn)定地連接到金屬基面上。較佳的，組裝的時間是0.5-10小時。
在組裝通式(I)的分子時，較佳的是將含有1 10mM(更佳的是1.5-5 mM;最佳的是2mM左右)化學(xué)分子的溶液加樣到所述組裝了檢測分子的金屬基面，使之 鋪展覆蓋金屬基面，封閉l-16小時(更佳的，封閉時間在8-14小時；最佳的， 封閉時間是12小時左右)，去除多余溶液，從而獲得所述的分子捕獲傳感界面。 作為本發(fā)明的一個較佳實施例，所述的檢測分子是DNA，且所述方法包括 ①在潔凈的純金電極表面組裝巰基修飾的DNA捕獲探針；②利用垸基乙氧基硫 醇對組裝了捕獲探針的金表面進行封閉。
電極及試劑盒
本發(fā)明還提供了一種電極，所述的電極的表面具有所述的分子捕獲傳感界面。
所述的電極可以是合金的或是由單一金屬制備的，只要其表面具有本發(fā)明 所述的分子捕獲傳感界面。
本發(fā)明還提供了具有所述的電化學(xué)傳感界面的電極的用途，用于檢測待測樣 品中與所述檢測分子相互作用的分子。
本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，其中含有 一電極，所述電極的表面具有 所述的分子捕獲傳感界面。
為了便于操作，所述的試劑盒中還可含有進行電化學(xué)傳感檢測，電流檢測或酶 聯(lián)免疫，電極清洗等所需的其它試劑。所述的酶聯(lián)免疫試劑例如選自辣根過氧化物 酶及其底物，堿性磷酸酶及其底物，或生物素及親和素等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或電流分析儀器等。
檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的檢測方法基于酶聯(lián)免疫技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)，也即將可從待 測樣品中識別出特定分子的檢測分子固定在金屬基面上，將攜帶可特異性催化 電流反應(yīng)的酶或后續(xù)可被標(biāo)記上所述可特異性催化電流反應(yīng)的酶的待測樣品與固 定有所述檢測分子的金屬基面接觸，從而如果待測樣品中含有檢測分子可識別 的特定分子時，可使得金屬基面上形成"檢測分子-與所述檢測分子相互作用的 分子-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"，通過加入所述酶對應(yīng)的底物，可檢測到電 流的發(fā)生。反推知，可通過檢測到電流的發(fā)生，得知待測樣品中含有與所述檢 測分子相互作用的分子。因此，本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品中與檢測分子相互作用的分子的 方法，所述方法包括
(A) 提供一電極，所述電極的表面具有所述的分子捕獲傳感界面；
(B) 用經(jīng)可特異性催化電流反應(yīng)的酶標(biāo)記的待測樣品處理所述的電極，獲得具 有"分子捕獲傳感界面-檢測分子相互作用的分子-可特異性催化電流反應(yīng)的酶" 復(fù)合物的電極；
(C) 將(B)的電極置于含有所述可特異性催化電流反應(yīng)的酶的底物，和/或電子 傳遞媒介的溶液中；檢測電流信號，從而確定待測樣品中檢測分子的存在與否或 存在的量。
可選擇地，在步驟(B)中，包括(i)用經(jīng)酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子標(biāo)記的待測 樣品處理所述的電極，獲得具有"分子捕獲傳感界面-與檢測分子相互作用的分 子-酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子"復(fù)合物的電極；(ii)用"酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子的偶聯(lián) 物-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"復(fù)合物處理所述電極，從而獲得具有"分子捕獲 傳感界面-與檢測分子相互作用的分子-酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子-酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分 子的偶聯(lián)物-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"復(fù)合物的電極。
所述的可特異性催化電流反應(yīng)的酶可以是一類酶，其適合于直接或間接(如 通過偶聯(lián)分子)地與待測樣品連接，并且，其在與底物相互作用時，能夠催化電 流反應(yīng)的產(chǎn)生。例如，所述的可特異性催化電流反應(yīng)的酶可以是常用于酶聯(lián)免 疫反應(yīng)中一些酶。
可特異性催化電流反應(yīng)的酶或偶聯(lián)分子標(biāo)記或連接到待測樣品上的方法 是本領(lǐng)域己知的技術(shù)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的可特異性催化電流反應(yīng)的酶選自辣根過氧
化物酶(HRP)，堿性磷酸(酯)酶(AP)，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶，或葡萄糖脫 氫酶等。它們均是商品化的試劑。所述的辣根過氧化物酶的底物選自鄰苯二胺 (OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或2,2，-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS); 所述堿性磷酸酶的底物選自對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate， p-NPP) 或5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/硝基四氮唑藍(lán)(BCIP/NBT)。
所述酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子及其偶聯(lián)物是為了將可特異性催化電流反應(yīng)的 酶連接到待測分子上而設(shè)置的，本發(fā)明沒有特別的限制，只要它們之間能夠發(fā) 生偶聯(lián)、且可分別與所述的酶和待測分子良好地結(jié)合，且不產(chǎn)生其它反作用。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子選自生物素，地高辛，熒光素。所述酶聯(lián)免疫可偶聯(lián)分子的偶聯(lián)物選自親和素，地高辛抗體，抗熒光 素抗體。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用辣根過氧化物酶催化雙氧水的還原反應(yīng)，通 過TMB(鄰二甲基對二氨基聯(lián)苯)與電極之間進行電子傳遞，從而方便地檢測此 催化反應(yīng)產(chǎn)生的催化電流，作為檢測信號。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在待測樣品與分子捕獲界面充分接觸后，電極表 面用較低鹽濃度的洗液沖洗。更佳的，所述的低鹽濃度洗液可以為含有100± 50mMNaCl， 0.1 ±0.02% (v/v) tween(吐溫)，0.01 ±0.005 M PB， pH7,0 7.4的 PBS溶液。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在與可特異性催化電流反應(yīng)的酶連接后，再次用 所述的較低鹽濃度的洗液沖洗去未連接的酶。
檢測電流信號的方法可以釆用本領(lǐng)域已知的方法，如電流-時間曲線法或循 環(huán)伏安法等，本發(fā)明優(yōu)選電流-時間曲線法，因其可定量檢測過氧化物酶催化底 物所產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)電流值。
在本發(fā)明一較佳實施例中，本發(fā)明的制備方法包括下列步驟
① 在潔凈的金表面上滴加5±1 ^M巰基修飾的寡核苷酸捕獲探針組裝液， 室溫組裝1 4小時。
② 使用2±0.5 mM濃度的H"^—烷基乙氧基硫醇室溫封閉電極10-15小時， 取出后用水沖洗干凈，氮氣吹干。
③ 將待測DNA樣品與100± 10 nM生物素修飾信號探針DNA在雜交緩沖 液中預(yù)雜交5分鐘后滴加到制備好的金電極表面；室溫雜交1土0.5小時后電極 表面用較低鹽濃度的洗液沖洗，氮氣吹干，滴加3±0.5 ^L親合素修飾的辣根 過氧化物酶；室溫連接10-30分鐘后，再次用較低鹽濃度的洗液沖洗去未連接 的酶；最后，在TMB和雙氧水底物溶液中，辣根過氧化物酶可以催化TMB和 雙氧水的電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號，使用現(xiàn)有的電化學(xué)分析儀進行電化學(xué)檢 測或分析。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1、首次發(fā)現(xiàn)在制備電化學(xué)傳感器的過程中，在將檢測分子組裝于金屬基 面后，利用通式(I)的化合物來進行封閉組裝，所獲得的傳感界面具有極其優(yōu)異 的特異性和穩(wěn)定性，抗非特異性吸附的能力很強，特別適用于復(fù)雜生物體系中的檢測。
2、 本發(fā)明的電化學(xué)傳感界面具有很好的電化學(xué)惰性與化學(xué)穩(wěn)定性，可以 廣泛用于基因檢測或更加廣泛的生物分析領(lǐng)域。
3、 本發(fā)明的基于分子共組裝技術(shù)的生物電化學(xué)傳感界面制備方法操作簡 便，試劑便宜，易得。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則 百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語 與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的 方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
實施例1傳感界面的組裝
準(zhǔn)備一金盤電極，其表面為金屬基面1，在金屬基面1上組裝巰基修飾的檢 測分子2，檢測分子2 —端巰基上的硫與金屬基面1形成化學(xué)鍵，從而檢測分子2 連接到金屬基面1上，獲得組裝了檢測分子2的金屬基面l(如圖1A);使用具有通 式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子3處理所述組裝了檢測分子2的金屬基面1，化學(xué)分子3 — 端巰基上的硫與金屬基面1形成化學(xué)鍵，從而化學(xué)分子3連接到金屬基面1上檢 測分子2周圍的區(qū)域，封閉空余的基面位點，同時通過取代反應(yīng)，優(yōu)化了檢測分子 2的組裝構(gòu)象，從而獲得所述的分子捕獲傳感界面(如圖1B)。
實施例2封閉試劑的選擇
(1) 選取直徑2毫米多晶純金的金盤電極，清洗后分別浸入2 mM巰基己醇 (溶劑是乙醇溶液)與2 mM十一垸基乙氧基硫醇(SH-(CH2)u-(C2HsO)2-OH)(溶 劑是乙醇溶液)中室溫組裝4小時，取出后用Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干。
(2) 在巰基己醇與烷基乙氧基硫醇修飾電極表面分別滴加3 ^L親合素修飾 的辣根過氧化物酶，室溫反應(yīng)10分鐘；用100mMNaCl， 0.1% (v/v) tween(吐 溫)，0.01 MPB， pH 7.0的PBS洗液沖洗去未連接的酶；然后在TMB和雙氧 水底物溶液中，使用電流-時間曲線法檢測電流信號，結(jié)果見圖2。
在對巰基己醇與垸基乙氧基硫醇修飾電極表面的對比實驗中發(fā)現(xiàn)巰基己醇表面產(chǎn)生的催化電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于垸基乙氧基硫醇修飾電極表面，用大量水沖洗 后并未降低。
上述結(jié)果表明，巰基己醇表面吸附了大量親合素修飾的辣根過氧化物酶， 而且這種非特異吸附較為牢固；相對地，烷基乙氧基硫醇修飾電極表面的電流 值在10nA左右，表現(xiàn)出較佳的抗蛋白吸附能力，而且極低的本底信號有利于
獲得更大的信噪比，非常適用于電化學(xué)生物傳感檢測應(yīng)用。
實施例3同類化合物封閉效果比較試驗
(1) 選取直徑2毫米多晶純金的金盤電極，清洗后分別浸入2 mM濃度的 相似巰基乙氧基化合物SH-(CH2) -(OC2H5)3-OCH3乙醇溶液與 SH-(CH2)n-(OC2H5)2-OH的乙醇溶液中室溫組裝4小時，取出后用大量Milli-Q 水沖洗干凈，氮氣吹干。
(2) 在兩種封閉劑修飾電極表面分別滴加3 nL 137mMPBS， 0.5% (w/v)酪 蛋白(casein)稀釋的500mU/mL親合素修飾的辣根過氧化物酶，室溫反應(yīng)10分 鐘；用100 mMNaCl， 0.1% (v/v) tween(吐溫)，0.01 M PB， pH 7.0的PBS洗液 沖洗電極表面；然后在TMB和雙氧水底物溶液中，使用電流-時間曲線法檢測 電流信號，結(jié)果分別為7.2和6.4納安。
實驗結(jié)果表明，無論是 SH-(CH2)u-(OC2Hs)3-OCH3還是 SH-(CH2)u-(OC2Hs)2-OH，封閉后的電極表面都表現(xiàn)出非常理想的抗酶吸附能 力，表現(xiàn)為極低的催化電流，說明此類化合物非常適合作為復(fù)雜生物體系的表 面封閉試劑。
實施例4特異性試驗
(1) 在潔凈的金表面上滴加1 nM巰基修飾的寡核苷酸捕獲探針組裝液 [pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中NaCl濃度為1 M，室溫組裝2小時。
(2) 使用2mM濃度的H^—垸基乙氧基硫醇室溫封閉電極12小時，取出后 用Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干。
(3) 將10 nM的靶向DNA(即可與捕獲探針雜交的DNA)與10 nM非靶向 DNA分別與100 nM生物素修飾信號探針DNA在0.5 M PBS (pH 7.0)雜交緩 沖液中80'C預(yù)雜交5分鐘后滴加到制備好的金電極表面；室溫反應(yīng)30分鐘， 電極清洗，聯(lián)酶條件同實施例2，然后在TMB和雙氧水底物溶液中，使用循環(huán)伏安法檢測電流信號，結(jié)果見圖3。
其中，所使用的捕獲探針序列為
5, TTtgctgAGATCGCGTTTTTTTTTT(SEQ ID NO: l)-C6-SH-3，，
信號探針序列為
5'-biotin-GCTTACGACAAGAAAA(SE(5 ID NO: 2)陽3'， 靶向DNA序列為
5，-CGCGATCTCAGCAAATATATTTTCTTGTCGTAAGC(SEQID NO:
3) -3，，
非耙向DNA序列為
5，-GTACTTTCAGCGAGGAAGTTGAGTAAAGTTAATGA(SEQ ID NO:
4) -3，。
在傳感界面上，捕獲探針可以特異識別靶序列，形成夾心式結(jié)構(gòu)并且特異 性地連接上HRP酶，所以催化了 TMB與雙氧水的反應(yīng)，導(dǎo)致TMB的還原峰 增大。而同樣的實驗過程，將目標(biāo)DNA換成任意非互補DNA卻沒有發(fā)現(xiàn)還原 電流變大的現(xiàn)象，說明此傳感界面具有高特異識別能力。
實施例5對于簡單樣品體系和復(fù)雜樣品體系的特異性比較
一. 簡單樣品體系的試驗
(1) 在潔凈的金表面上滴加5 )LiM巰基修飾的寡核苷酸捕獲探針組裝液 [pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中NaCl濃度為1 M，室溫組裝4小時。
(2) 使用2mM濃度的H"^—烷基乙氧基硫醇室溫封閉電極IO小時，取出后 用Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干。
(3) 將100pM的一段40個堿基的乙肝病毒基因片斷與對應(yīng)的100nM生物 素修飾信號探針DNA在0.8 M PBS (pH 7.2)雜交緩沖液中80'C預(yù)雜交5分鐘 后滴加到制備好的金電極表面；室溫雜交45分鐘，電極清洗，聯(lián)酶反應(yīng)，檢 測方法同實施例2，結(jié)果見圖4。
二. 復(fù)雜樣品體系的試驗
(1) 在潔凈的金表面上滴加5 nM巰基修飾的寡核苷酸捕獲探針組裝液 [pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中NaCl濃度為1 M，室溫組裝4小時。
(2) 使用2 mM濃度的十一烷基乙氧基硫醇室溫封閉電極IO小時，取出后用Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干。
(3)將100pM的一段40個堿基的乙肝病毒基因片斷與100nM生物素修飾 信號探針DNA在含有50%血清的0.8 M PBS (pH 7.2)雜交緩沖液中80。C預(yù)雜 交5分鐘后滴加到制備好的金電極表面；室溫雜交45分鐘，電極清洗，聯(lián)酶 條件，檢測方法同實施例2，檢測結(jié)果與簡單樣品體系的比較見圖4。
在對100 pM靶序列在雜交緩沖液體系與含有50%血清體系的雜交檢測中 發(fā)現(xiàn)，雜交信號強度基本相同，血清體系的復(fù)雜成分并未影響靶序列的雜交檢 測信號，證明此傳感界面具有優(yōu)異的檢測特異性及防污特性，可適用于復(fù)雜生 物體系中的特異序列DNA檢測。
上述試驗中，所使用的捕獲探針序列為
5，-SH-C6-TTTTTTTTTTCAAGCTGTGCCTTGGGTG(SEQ ID NO: 5)-3，，
信號探針序列為
5， -TTTGGGGCATGGACATTGAC(SEQ ID NO: 6)-biotin-3，， 耙向DNA為一段乙肝病毒基因(HBV)序列片斷，序列為 5' -GTCAATGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTG(SEQ ID NO: 7)-3，。
實施例6對于乙型肝炎表面抗原的檢測
(1) 在潔凈的金表面上滴加20 mM的半胱胺水溶液，4'C下組裝10h;用 Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干后浸入l。/。戊二醛溶液中于室溫下放置lh后水洗， 置于含200ng/mL的乙型肝炎表面抗體(HBsAb)組裝液[pH7.4的磷酸鹽緩沖液 (PBS)，其中NaCl濃度為1M，室溫組裝4小時。
(2) 使用2 mM濃度的(SH-(CH2)u-(C2HsO)2-OH)(溶劑是乙醇溶液)室溫封 閉電極4小時，取出后用Milli-Q水沖洗干凈，氮氣吹干。
(3) 將組裝好的HBsAb修飾電極浸入100 ng/mL乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)溶液中，同時以相同量的牛血清白蛋白(BSA)作為對照組，室溫下孵 育20min，取出用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗；再與200 ng/mL辣根過氧化物 酶標(biāo)記的HBsAb [pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中NaCl濃度為1 M溶液室 溫下反應(yīng)10min，電極清洗，檢測方法同實施例2，結(jié)果見圖5。本發(fā)明上述各實施例中的所用試劑親和素修飾的辣根過氧化物酶 (Avidin-POD)購自Roche公司，使用前用137mM PBS稀釋成500mU/mL，并添 加0.5% (w/v)酪蛋白(casein)封閉非特異性位點；TMB底物(TMB substrate Low activity),購自NEOGEN公司，其中含有TMB和雙氧水。上述實施例中所用 的各種DNA序列都是人工合成的，合成自上海生工生物工程有限公司。其它 未特殊說明的試劑或原料都是常規(guī)市售產(chǎn)品。電化學(xué)工作站及配件為上海辰華 公司產(chǎn)品(型號CHI 630)。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<120>
蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司 一種電化學(xué)傳感界面及其制備方法
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DNA
人工序列
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DNA
人工序列
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DNA
人工序列
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寡核^酸
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cgcgatctca gcaaatatat tttcttgtcg taagc
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tttttttttt caagctgtgc cttgggtg 28
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<212> DNA
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<221> misc—feature <223>寡核^酸
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<212> DNA <213>人工序列
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<221> misc_feature <223>寡核去酸
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gtcaatgtcc atgccccaaa gccacccaag gcacagcttg 40
權(quán)利要求
1.一種分子捕獲傳感界面，其特征在于，其包括金屬基面(1)；固定于金屬基面(1)上的檢測分子(2)，其用于捕獲與其相互作用的分子；和固定于金屬基面(1)上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)，且化學(xué)分子(3)包圍在檢測分子(2)的周圍；HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R(I)；其中，R選自O(shè)H，H，OCH3，CH3，OC2H5，C2H5，OCH2COOH，NH2；m為選自1-12的正整數(shù)；n為選自3-15的正整數(shù)。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面，其特征在于，所述的檢測分子 (2)選自核酸，抗體或配體。
3. 如權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面，其特征在于，所述的金屬選自 金，鉑，鈀，銀。
4. 如權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面，其特征在于，所述的檢測分子(2) 是一端經(jīng)巰基修飾的分子。
5. —種制備權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面的方法，其特征在于，所 述方法包括(a) 在金屬基面(1)上固定檢測分子(2),獲得固定了檢測分子(2)的金屬基面(1);(b) 使用具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)處理所述固定了檢測分子(2)的金屬 基面(l)，從而獲得權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面；HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R選自O(shè)H， H， OCH3, CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述的檢測分子(2)是 核酸；且步驟(a)包括將濃度0.1 10pM所述檢測分子的溶液加樣到金屬基面(1) ，使之鋪展覆蓋金屬基面(l)，固定0.5-10小時，去除多余溶液，獲得固定了 檢測分子(2)的金屬基面(1);或者步驟(b)中，將含有1 10mM化學(xué)分子(3)的溶液加樣到所述固定了檢測分子(2) 的金屬基面(1)，使之鋪展覆蓋金屬基面(l),固定1-16小時，去除多余溶液， 從而獲得權(quán)利要求1所述的分子捕獲傳感界面。
7. —種具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)的用途，其特征在于，用于制備權(quán) 利要求1所述的分子捕獲傳感界面；HS-(CH2)n-(OC2Hs)m-R (I); 其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。
8. —種檢測待測樣品中與檢測分子(2)相互作用的分子的電極，其特征在 于，所述的電極的表面具有金屬基面(l);固定于金屬基面(1)上的檢測分子(2)，其用于捕獲與其相互作用的分子；和 固定于金屬基面(1)上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子(3)，且化學(xué)分子(3)包圍在 檢測分子(2)的周圍；HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I);其中，R選自O(shè)H， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m為選自1-12的正整數(shù)； n為選自3-15的正整數(shù)。
9. 一種檢測待測樣品中與檢測分子(2)相互作用的分子的方法，其特征在 于，所述方法包括(A)用經(jīng)可特異性催化電流反應(yīng)的酶標(biāo)記的待測樣品處理權(quán)利要求8所述的 電極，獲得具有"分子捕獲傳感界面-與檢測分子(2)相互作用的分子-可特異性催化電流反應(yīng)的酶"復(fù)合物的電極；(B)將(A)的電極置于含有所述可特異性催化電流反應(yīng)的酶的底物，和/或電子 傳遞媒介的溶液中；檢測電流信號，從而確定待測樣品中檢測分子(2)的存在與 否或存在的量。
10. —種檢測試劑盒，其特征在于，其中含有權(quán)利要求8所述的電極。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子捕獲傳感界面，其包括金屬基面，組裝于金屬基面上的檢測分子和組裝于金屬基面上的具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化學(xué)分子。本發(fā)明還公開了所述分子捕獲傳感界面的制備方法。本發(fā)明還公開了一種具有所述分子捕獲傳感界面的電極，以及利用所述電極進行檢測的方法。本發(fā)明的化學(xué)傳感界面具有高度穩(wěn)定性和特異性，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中傳感器特異性差、易于出現(xiàn)假陽性的技術(shù)難題。
文檔編號G01N27/327GK101576526SQ20081003685
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日
發(fā)明者勞若珺, 炯 張, 樊春海, 陳俊輝, 高新義 申請人:蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司