專利名稱：一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，屬于免疫分析化學(xué)技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
3-甲基-喹啉-2-羧酸，英文名稱3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA)，是喹啉類飼料添加劑在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，以喹諾酮和喹乙醇為 主要代表。當(dāng)雞、豬、魚等食用此類飼料添加劑后，會在體內(nèi)，主要是肌肉， 腸道，腎臟中代謝生成3-甲基-喹啉-2-羧酸，這種代謝物對人體毒性極大。由于 國內(nèi)對喹啉類添加劑的大量濫用，造成了添加劑在動物體內(nèi)的含量嚴(yán)重超標(biāo)， 國內(nèi)的檢測技術(shù)尚停留在對原藥的檢測，隨著國際標(biāo)準(zhǔn)的提高，我國貿(mào)易的國 際化，這種檢測技術(shù)已經(jīng)不能滿足要求。近年來，國外開始逐漸加大了對代謝 物3-甲基-喹啉-2-羧酸的研究和檢測。為了與國際接軌，減少我國的肉類制品在 出口時(shí)不必要的損失，我國有必要加大對代謝物的研究力度，由于對其研究較 少，檢測限仍然較高，為了彌補(bǔ)這一空白，有必要研究一種靈敏度高，檢測限 低，操作簡單的，針對3-甲基-喹啉-2-羧酸的檢測方法。
HPLC和LC-MS/MS的方法雖然靈敏，但是所需儀器價(jià)格昂貴，對操作人 員的要求較高，較難推廣。免疫分析化學(xué)方法具有快速，靈敏度高，操作簡單， 專一性好等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，本發(fā)明利用納米磁性粒子作為固 相載體，在流動注射系統(tǒng)中進(jìn)行免疫反應(yīng)，用DNA修飾的金納米粒子作為探針， 免疫反應(yīng)后，收集DNA，并將其固定于金納米粒子表面，加入異硫氰酸熒光素， 檢測熒光信號從而達(dá)到檢測3-甲基-喹啉-2-羧酸的目的，本發(fā)明方法大大提高了 檢測的靈敏度，且操作更加簡便，達(dá)到了高通量的目的，而且以磁性粒子作為 固相載體，具有清洗和分離方便，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，用DNA修飾的金納米粒子 作為探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的HRP進(jìn)行免疫反應(yīng)，簡化了反應(yīng)的條件，提高了檢測的靈 敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，靈 敏度高，操作方便，線性范圍寬。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，包 括免疫源、包被原、和抗體的制備，包被原的固定，磁性納米粒子的修飾，磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)，金納米粒子的制備，金納米探針的制備，流動注 射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)，熒光酶標(biāo)板的包被和流動注射熒光猝滅的檢測；工藝步 驟為
(1) 包被原的制備將3-甲基-喹啉-2-羧酸與間氨基苯甲酸相連，再與卵清 蛋白相偶聯(lián)得到包被原；
(2) 免疫原的制備將3-甲基-喹啉-2-羧酸與牛血清蛋白相偶聯(lián)得到免疫原；
(3) 抗體的制備用所得免疫原免疫兔子得到特異性多克隆抗體；
(4) 包被原的固定用所得包被原與磁性微粒偶聯(lián)，并固定于玻璃微通道內(nèi)；
(5) 磁性納米粒子的修飾;將制備的Fe304種子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾;
(6) 磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)；
(7) 兩種粒徑的金納米粒子的制備；
(8) 兩種金納米探針的制備；
(9) 流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)；
(10) 熒光酶標(biāo)板的包被；
(11) 流動注射熒光猝滅的檢測利用間接競爭免疫檢測將3-甲基-喹啉-2-羧 酸和多克隆抗體通過玻璃微通道內(nèi)，競爭結(jié)合后的多克隆抗體與經(jīng)羊抗兔抗體
及雙鏈DNA共同修飾的金納米探針反應(yīng)，變性得到單鏈DNA并將其收集，收集 得到的單鏈DNA—端與互補(bǔ)DNA修飾的金納米探針反應(yīng)，另一端與生物素修飾 的互補(bǔ)DNA反應(yīng)，并用親和素固定于酶標(biāo)板上，加入異硫氰酸熒光素，用熒光 酶標(biāo)儀檢測熒光信號從而檢測3-甲基-喹啉-2-羧酸含量。
包被原的制備取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mL N,N-二羥基甲 酰胺中，加入12(^L三正丁胺，反應(yīng)0.5小時(shí)；再加入75pL氯甲酸異丁酯，反 應(yīng)1小時(shí)；再與含有100mg間氨基苯甲酸、6mLpH9.6的碳酸鈉緩沖溶液混合， 在4'C下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；過程中有沉淀產(chǎn)生，離心，取沉淀物，干燥，得到 3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原；取3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原9.9mg， N-羥基琥珀酰 亞胺11.5mg, N，N-二環(huán)己基二亞胺20.63mg，加入到3mLN,N-二羥基甲酰胺中， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含60mg卵清蛋白的溶液在4 。C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 免疫原的制備取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg， N-羥基琥珀酰亞胺11.5mg， N，N-二環(huán)已基二亞胺20.63mg，加入到3mLN，N-二羥基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺?應(yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含130mg卵清蛋白的溶液在4。C下攪拌反 應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-20°0保存?zhèn)溆谩?br> 磁性納米粒子的修飾用二次蒸餾水分別配制FeS04，7H20和FeCl3，6H20 的溶液及NaOH溶液，將所配兩種鐵鹽溶液混合，在鐵鹽的混合溶液中F^+離 子的濃度為0.12 mol/L, Fe"離子的濃度為0.2 mol/L; NaOH溶液的濃度為2.5mol/L;在劇烈攪拌下將一定體積的NaOH溶液緩慢滴加到混合鐵鹽溶液中，將 所得的沉淀在6(TC陳化2小時(shí)，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在 60'C干燥24小時(shí)，在瑪瑙研缽中研磨后所得產(chǎn)物為Fe304種子；將Fe304種子 0.125g用lOOmL乙醇和lmL 二次蒸餾水分散，超聲30min,滴加0.4mL 3-氨丙 基三乙氧基硅烷APTES,室溫?cái)嚢?小時(shí)，以8000r/min離心30min，將APTES 修飾的Fe304納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用乙醇溶液對其清洗5次，過濾后 再在60'C干燥24小時(shí)，備用。
磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)取所得的APTES修飾的Fe3O4納米顆粒10mg， N-羥基琥珀酰亞胺11.5mg， N，N-二環(huán)己基二亞胺20.63mg，加入到3mLN，N陽 二羥基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含60mg卵 清蛋白的溶液在4"C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，對透析 袋中溶液進(jìn)行磁性分離，棄上清，加入含2。/。明膠的pH9.6碳酸鈉緩沖溶液封閉， 再加入PBST洗滌液，洗滌后磁分離，去上清，最后向磁性分離過的離心管中加 入lmL0.02mol/LpH7.6的Tris緩沖液，4。C保存?zhèn)溆谩?br> 兩種粒徑的金納米粒子的制備所用的玻璃儀器都強(qiáng)酸浸泡，雙蒸水清洗， 晾干備用；制備時(shí)，向潔凈的三角燒瓶中加入100mL質(zhì)量濃度為0.0P/。的氯金酸， 加熱，煮沸，緊接著加入l。/。的檸檬酸三鈉溶液3.5mL或lmL，邊加熱邊攪拌，溶 液顏色從淡黃色變成紅色，反應(yīng)持續(xù)6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降，最后， 溶液分別冷卻至室溫，稀釋到100mL， 4'C保藏；加入3.5mL檸檬酸三鈉溶液制 得的金納米粒子平均粒徑為13nm，加入lmL檸檬酸三鈉溶液制得的金納米粒子 平均粒徑為30nm。
兩種金納米探針的制備
30nm金納米探針的制備首先，30nm金納米粒子與1.5pg的羊抗兔在pH9.1 堿性水溶液中攪拌反應(yīng)，緊接著，向溶液中加入巰基修飾的寡核苷酸 5' -TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGt (10)-SH-3，，室溫反應(yīng)20小時(shí)，再用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié) pH值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于-4'C下2000r.p.m離心30分鐘，棄上清；紅色沉淀物 用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液溶解，加入1.5nM的寡核苷酸5' -CGCATTCAGGATTGCATGAATGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3' 37。C雜交4小時(shí)，再次離心去上清，雜交過程重復(fù)4次，沉淀最后溶解于含 0.3MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，得到羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾的 30nm金納米探針，作為儲備液4"C保藏；
13nm金納米探針的制備直接向13nm金納米溶液中加入巰基寡核苷酸 5， -GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3，，室溫反應(yīng)20小時(shí)，再用 含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于-4'C下2000r.p.m離心30分鐘，棄上清；紅色沉淀物用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖 液溶解，4'C保藏。
流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)先用pH7.0、含0.1MNaCl的0.01M磷酸鹽緩 沖液作洗液清洗微管和免疫反應(yīng)池，然后將40pL 0.5mg/mL抗原修飾的超順磁納 米粒子溶液吸入螺線管中，再以5pL/s的速率注入免疫反應(yīng)池內(nèi)，電磁鐵通電， 吸附磁珠，將其固定在反應(yīng)池內(nèi)；將預(yù)孵育的50^^抗體和50^^3-甲基-喹啉-2-羧酸混合溶液吸入螺線管中，其中，3-甲基-喹啉-2-羧酸溶解于pH7.4、含0.05% Tween-20的0.01MPBST中，濃度從lpg/mL 100pg/mL;然后，將混合溶液注入 免疫反應(yīng)池中室溫反應(yīng)10分鐘，再以2(^L/s的速度注入400pLpH7.0、 O.lMNaCl 的0.01MPBS洗液；之后，將100iiL的羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾的30nm金 納米探針的溶液以lpL/s的速度注入反應(yīng)池，反應(yīng)6分鐘，沖洗；以2jiL/s的速度 注入100hL的雙蒸水，60'C反應(yīng)6分鐘，最后再注入100iiL的雙蒸水，收集所需單 鏈DNA，撤去磁場，洗滌柱子以備再用。
熒光酶標(biāo)板的包被用親和素包被熒光酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板每孔中加入100pL 親和素的pH9.6碳酸鈉緩沖溶液，4'C孵育過夜，用PBS清洗后，備用。
熒光猝滅檢測將收集的單鏈DNA與10HL的生物素標(biāo)記的捕獲探針 25|iM， 5，-生物素-3(10)丁八00八07丁0八0八(:00丁丁^0八€0八-3，混合，再加 入20pL的含0.3MNaCl、 0.02%SDS的pH7.4 0.01MPBS溶液，37。C孵育10分 鐘后，再加入20nM 13nm金納米探針進(jìn)一步雜交10分鐘后，將雜交液轉(zhuǎn)移到親 和素包被的熒光酶標(biāo)板上，室溫孵育30分鐘，最后，用100nLPBS緩沖液洗滌， 加入100pL異硫氰酸熒光素(FITC)，震蕩，熒光檢測，熒光強(qiáng)度通過Wallacl420 工作站在線觀測。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明大大提高了 3-甲基-喹啉-2-羧酸檢測的靈敏度， 且操作更加簡便，達(dá)到了高通量的目的，而且以磁性粒子作為固相載體，具有 清洗和分離方便，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，用DNA修飾的金納米粒子作為探針代替?zhèn)?統(tǒng)的HRP進(jìn)行免疫反應(yīng)，簡化了反應(yīng)的條件，提高了檢測的靈敏度，達(dá)到國際 領(lǐng)先水平。


圖l 3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1)包被原的制備
取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mLN,N-二羥基甲酰胺(DMF)中，加 入120nL三正丁胺，反應(yīng)0.5小時(shí)，再加入75iiL氯甲酸異丁酯，反應(yīng)1小時(shí)，再與 含有100mg間氨基苯甲酸的碳酸鈉緩沖溶液(pH9.6)的溶液混合，在4"C下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，過程中有沉淀產(chǎn)生，離心，取沉淀物，干燥，得到半抗原；
取半抗原9.9mg， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 11.5mg， N,N-二環(huán)已基二亞胺 (DCC) 20.63mg，加入到3mLN，N-二羥基甲酰胺(DMF)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜， 離心去沉淀，上清液再與3mL卵清蛋白(OVA) (60mg)溶液在4'C下攪拌反應(yīng) 過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-20^保存?zhèn)溆茫?br> (2) 免疫源的制備-
取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 11.5mg， N,N-二 環(huán)已基二亞胺(DCC) 20.63mg，加入到3mLN，N-二羥基甲酰胺(DMF)中，室溫 攪拌反應(yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL卵清蛋白(OVA) (130mg)溶液 在4'C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-20卩保存?zhèn)溆茫?br> (3) 多克隆抗體制備
采用新西蘭大白兔作為被免疫的動物，首次免疫時(shí)將免疫源與等量的弗氏 完全佐劑混合制成乳化劑，在大白兔背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為lmg/只， 間隔2-4周后，用相同劑量免疫源加等量弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，加強(qiáng) 免疫，免疫期間監(jiān)測抗體效價(jià)及特異性，最后一次免疫不加佐劑。最后一次免 疫7天后，心臟放血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的MQCA多克隆抗體。
(4) 抗體效價(jià)的測定
采用間接ELISA方法對免疫后不同時(shí)期的抗體進(jìn)行效價(jià)的監(jiān)測，以O(shè)D值達(dá) 到1.0左右時(shí)判斷為陽性，結(jié)果最后抗體的效價(jià)為3.2><105。
(5) 磁性納米粒子的修飾
用二次蒸餾水分別配制FeS047H20和FeCl3'6H20的溶液及NaOH溶液， 將所配兩種鐵鹽溶液混合。在鐵鹽的混合溶液中F^+離子的濃度為0.12 mol/L, F^+離子的濃度為0.2mol/L; NaOH溶液的濃度為2.5mol/L。在劇烈攪拌下將 一定體積的NaOH溶液緩慢滴加到混合鐵鹽溶液中，將所得的沉淀在60°C陳化 2小時(shí)，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在6(TC干燥24小時(shí)，在瑪 瑙研缽中研磨后所得產(chǎn)物為Fe304種子。
將上步產(chǎn)物Fe3O4種子0.125g用100mL乙醇和lmL水溶解，超聲30min,滴加 0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),室溫?cái)嚢?小時(shí)，以8000r/min離心30min， 將APTES修飾的Fe304納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用乙醇溶液對其清洗5次， 過濾后再在6(TC干燥24小時(shí)，備用。
(6) 磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)
取步驟(5)所得最終產(chǎn)物10mg， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 11.5mg， N,N-二 環(huán)已基二亞胺(DCC) 20.63mg，加入至lj3mLN，N-二羥基甲酰胺(DMF)中，室溫 攪拌反應(yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL卵清蛋白(OVA) (60mg)溶液在 4'C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，對透析袋中溶液進(jìn)行磁性分離，棄上清，加入含2%明膠的封閉液封閉，再加入PBST洗滌液，洗滌后磁 分離，去上清，最后向磁性分離過的離心管中加入lmL0.02mol/LpH7.6的Tris緩 沖液，4'C保存?zhèn)溆谩?br> (7) 金納米粒子的制備
所有的玻璃儀器都用強(qiáng)酸浸泡，雙蒸水清洗，晾干備用。制備時(shí)，向潔凈 的三角燒瓶中加入100mL質(zhì)量濃度為0.0P/。的氯金酸，加熱，煮沸，緊接著加入 "/o的檸檬酸三鈉溶液(13nm粒子需3.5mL; 30nm粒子需lmL)，邊加熱邊攪拌， 溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應(yīng)持續(xù)6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降。最后， 溶液分別冷卻至室溫，稀釋至lJlOOmL， 4'C保藏。
(8) 金納米探針的制備
首先，30nm金納米粒子與1.5pg的羊抗兔在堿性水溶液中攪拌反應(yīng)(pH9.1)， 緊接著，向溶液中加入巰基修飾的寡核苷酸
5， -tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3，，室》顯反應(yīng)20d、 時(shí)，再用10mM的磷酸鹽緩沖溶液(0.1MNaCl)調(diào)節(jié)pH值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于 -4°。下2000^.111離心30分鐘，棄上清。紅色沉淀物用10mM的磷酸鹽緩沖溶液 (O.lMNaCl)溶解，加入1.5pM的目標(biāo)探針
5 ， -cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3 ， 37°C雜交4,j、日寸，再 欠離A、 去上清，雜交過程重復(fù)4次，沉淀最后溶解于10mM的磷酸鹽緩沖溶液 (0.3MNaCl)，作為儲備液4'C保藏；
13nm金納米探針的制備直接向金納米溶液中加入巰基寡核苷酸 5， -GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3，，室溫反應(yīng)20小時(shí)，再用 10mM的磷酸鹽緩沖溶液(0.1MNaCl)調(diào)節(jié)pH值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于-4。C下 2000r.p.m離心30分鐘，棄上清。紅色沉淀物用10mM的磷酸鹽緩沖溶液(0.1M NaCl)溶解，4'C保藏。
(9) 流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)
先用0.01MPBS(pH7.0， O.lMNaCl)的洗液清洗微管和免疫反應(yīng)池，然后將 40pL抗原修飾的超順磁納米粒子溶液(0.5mg/ml)吸入螺線管中，再以5iaL/s的速 率注入免疫反應(yīng)池內(nèi)，電磁鐵通電，吸附磁珠，將其固定在反應(yīng)池內(nèi)。將預(yù)孵 育的混合溶液(50ML抗體；50WLMQCA)吸入螺線管中，其中，MQCA溶解于0.01M PBST(pH7.4， 0.05。/。Tween-20)中，濃度從從lpg/mL 100pg/mL。然后，將混合 溶液注入免疫反應(yīng)池中室溫反應(yīng)1 O分鐘，再以20jxL/s的速度注入400pL 0.01M PBS(pH7.0， O.lMNaCl)的洗液。之后，將100nL的30nm金探針(含有二抗和DNA) 的溶液以l^L/s的速度注入反應(yīng)池，反應(yīng)6分鐘，沖洗。以2pL/s的速度注入10(^L 的雙蒸水，60。C反應(yīng)6分鐘，最后再注入100)iL的雙蒸水，收集所需單鏈DNA， 撤去磁場，洗滌柱子以備再用。(10) 熒光酶標(biāo)板的包被
用親和素包被熒光酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板每孔中加入100nL親和素的碳酸鈉緩沖 溶液(pH9.6)， 4"C孵育過夜，用PBS清洗后，備用。
(11) 熒光猝滅檢測
步驟(9)收集的單鏈DNA與10nL的生物素標(biāo)記的捕獲探針(25)iM， 5，-生物 素畫a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA畫3，)混合，再加入20nL(0.3M NaCl， 0.02%SDS， O.OIMPBS， pH7.4)， 37。C孵育10分鐘后，再加入13nm金納 米探針(20nM)進(jìn)一步雜交10分鐘后，將雜交液轉(zhuǎn)移到親和素包被的熒光酶標(biāo)板 上，室溫孵育30分鐘。最后，用100pLPBS緩沖液洗滌，加入10(HiLFITC，震蕩， 熒光檢測，熒光強(qiáng)度可以通過Wallacl420工作站在線觀測。
權(quán)利要求
1、一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其特征是包括免疫源、包被原、和抗體的制備，包被原的固定，磁性納米粒子的修飾，磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)，金納米粒子的制備，金納米探針的制備，流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)，熒光酶標(biāo)板的包被和流動注射熒光猝滅的檢測；工藝步驟為(1)包被原的制備將3-甲基-喹啉-2-羧酸與間氨基苯甲酸相連，再與卵清蛋白相偶聯(lián)得到包被原；(2)免疫原的制備將3-甲基-喹啉-2-羧酸與牛血清蛋白相偶聯(lián)得到免疫原；(3)抗體的制備用所得免疫原免疫兔子得到特異性多克隆抗體；(4)包被原的固定用所得包被原與磁性微粒偶聯(lián)，并固定于玻璃微通道內(nèi)；(5)磁性納米粒子的修飾將制備的Fe3O4種子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾；(6)磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)；(7)兩種粒徑的金納米粒子的制備；(8)兩種金納米探針的制備；(9)流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)；(10)熒光酶標(biāo)板的包被；(11)流動注射熒光猝滅的檢測利用間接競爭免疫檢測將3-甲基-喹啉-2-羧酸和多克隆抗體通過玻璃微通道內(nèi)，競爭結(jié)合后的多克隆抗體與經(jīng)羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾的金納米探針反應(yīng)，變性得到單鏈DNA并將其收集，收集得到的單鏈DNA一端與互補(bǔ)DNA修飾的金納米探針反應(yīng)，另一端與生物素修飾的互補(bǔ)DNA反應(yīng)，并用親和素固定于酶標(biāo)板上，加入異硫氰酸熒光素，用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光信號從而檢測3-甲基-喹啉-2-羧酸含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法， 其特征是包被原的制備取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg，溶解在6mL N，N-二羥 基甲酰胺中，加入120nL三正丁胺，反應(yīng)0.5小時(shí)；再加入75pL氯甲酸異丁酯， 反應(yīng)1小時(shí)；再與含有100mg間氨基苯甲酸、6mL pH9.6的碳酸鈉緩沖溶液混 合，在4'C下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；過程中有沉淀產(chǎn)生，離心，取沉淀物，干燥，得 到3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原；取3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原9.9mg, N-羥基琥珀 酰亞胺11.5mg， N,N-二環(huán)已基二亞胺20.63mg，加入到3mLN,N-二羥基甲酰胺 中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含60mg卵清蛋白的溶 液在4'C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-2(TC保存
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是免疫原的制備取3-甲基-喹啉-2-羧酸102mg， N-羥基琥珀酰亞胺11.5mg，N，N-二環(huán)已基二亞胺20.63mg，加入至U3mLN,N-二羥基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺?應(yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含130mg卵清蛋白的溶液在4。C下攪拌反 應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，凍干，-20匸保存?zhèn)溆谩?br> 4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法， 其特征是磁性納米粒子的修飾用二次蒸餾水分別配制FeS(V7H20和 FeCl3，6H20的溶液及NaOH溶液，將所配兩種鐵鹽溶液混合，在鐵鹽的混合溶 液中Fe"離子的濃度為0.12 mol/L, Fe"離子的濃度為0.2 mol/L; NaOH溶液的濃 度為2.5mol/L;在劇烈攪拌下將一定體積的NaOH溶液緩慢滴加到混合鐵鹽溶 液中，將所得的沉淀在60"C陳化2小時(shí)，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過 濾后再在60'C干燥24小時(shí)，在瑪瑙研缽中研磨后所得產(chǎn)物為Fe304種子；將 Fe3O4種子0.125g用100mL乙醇和lmL二次蒸餾水分散，超聲30min,滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅垸APTES,室溫?cái)嚢?小時(shí)，以8000r/min離心30min，將 APTES修飾的Fe304納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用乙醇溶液對其清洗5次， 過濾后再在60"C干燥24小時(shí)，備用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)取所得的APTES修飾的Fe304納米顆粒 10mg，N-羥基琥珀酰亞胺11.5mg， N，N-二環(huán)己基二亞胺20.63mg，加入到3mL N，N-二羥基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含60mg 卵清蛋白的溶液在4'C下攪拌反應(yīng)過夜，離心，上清液用超純水透析3天，對透 析袋中溶液進(jìn)行磁性分離，棄上清，加入含2。/。明膠的pH9.6碳酸鈉緩沖溶液封 閉，再加入PBST洗滌液，洗滌后磁分離，去上清，最后向磁性分離過的離心管 中加入lmL0.02mol/LpH7.6的Tris緩沖液，4"C保存?zhèn)溆谩?br> 6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是金納米粒子的制備所用的玻璃儀器都強(qiáng)酸浸泡，雙蒸水清洗，晾干備 用；制備時(shí)，向潔凈的三角燒瓶中加入100mL質(zhì)量濃度為0.01。/。的氯金酸，加熱， 煮沸，緊接著加入l。/。的檸檬酸三鈉溶液3.5mL或lmL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色 從淡黃色變成紅色，反應(yīng)持續(xù)6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降，最后，溶液分 別冷卻至室溫，稀釋到100mL， 4"C保藏；加入3.5mL檸檬酸三鈉溶液制得的金 納米粒子平均粒徑為13nm，加入lmL檸檬酸三鈉溶液制得的金納米粒子平均粒 徑為30nm。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是金納米探針的制備30nm金納米探針的制備首先，30nm金納米粒子與1.5pg的羊抗兔在pH9.1 堿性水溶液中攪拌反應(yīng)，緊接著，向溶液中加入巰基修飾的寡核苷酸5')-SH-3，，室溫反應(yīng)20小時(shí)，再用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于-4i:下2000r.p.m離心30分鐘，棄上清；紅色沉淀物用 含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液溶解，加入1.5pM的寡核苷酸 5隱CGCATTCAGGATTGCATGAATGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA畫3' 37'C雜交4小時(shí)，再次離心去上清，雜交過程重復(fù)4次，沉淀最后溶解于含 0.3MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液中，得到羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾的 30nm金納米探針，作為儲備液4'C保藏；13nm金納米探針的制備直接向13nm金納米溶液中加入巰基寡核苷酸 5， -GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3，，室溫反應(yīng)20小時(shí)，再用 含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，鹽陳40小時(shí)后于-4'C下 2000r.p.m離心30分鐘，棄上清；紅色沉淀物用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖 液溶解，4'C保藏。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)先用pH7.0、含0.1MNaCl的0.01M磷酸鹽 緩沖液作洗液清洗微管和免疫反應(yīng)池，然后將40^L 0.5mg/mL抗原修飾的超順磁 納米粒子溶液吸入螺線管中，再以5pL/s的速率注入免疫反應(yīng)池內(nèi)，電磁鐵通電， 吸附磁珠，將其固定在反應(yīng)池內(nèi)；將預(yù)孵育的50^^抗體和50^^3-甲基-喹啉-2-羧酸混合溶液吸入螺線管中，其中，3-甲基-喹啉-2-羧酸溶解于pH7.4、含0.05% Tween-20的0.01MPBST中，濃度從lpg/mL 100pg/mL;然后，將混合溶液注入 免疫反應(yīng)池中室溫反應(yīng)10分鐘，再以20pL/s的速度注入40(VLpH7.0、 O.lMNaCl 的0.01MPBS洗液；之后，將100)iL的羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾的30nm金 納米探針的溶液以lpL/s的速度注入反應(yīng)池，反應(yīng)6分鐘，沖洗；以2pL/s的速度 注入100pL的雙蒸水，60'C反應(yīng)6分鐘，最后再注入100nL的雙蒸水，收集所需單 鏈DNA，撤去磁場，洗滌柱子以備再用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，其 特征是熒光酶標(biāo)板的包被用親和素包被熒光酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板每孔中加入 100nL親和素的pH9.6碳酸鈉緩沖溶液，4'C孵育過夜，用PBS清洗后，備用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法， 其特征是熒光猝滅檢測將收集的單鏈DNA與10pL的生物素標(biāo)記的捕獲探針 25pM， 5，-生物素-3(10)丁八€0八0丁丁0八0八(:00丁丁八八0八€0八-3，混合，再加 入20pL的含0.3MNaCl、 0.02%SDS的pH7.4 0.01MPBS溶液，37。C孵育10分 鐘后，再加入20nM13nm金納米探針進(jìn)一步雜交10分鐘后，將雜交液轉(zhuǎn)移到親 和素包被的熒光酶標(biāo)板上，室溫孵育30分鐘，最后，用10(^LPBS緩沖液洗滌， 加入10(^L異硫氰酸熒光素，震蕩，熒光檢測，熒光強(qiáng)度通過Wallacl420工作 站在線觀測。
全文摘要
一種3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫熒光猝滅檢測方法，屬于免疫分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括免疫源、包被原、和抗體的制備，包被原的固定，磁性納米粒子的修飾，磁性納米粒子與包被原的偶聯(lián)，金納米粒子的制備，金納米探針的制備，流動注射系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)，熒光酶標(biāo)板的包被和流動注射熒光猝滅的檢測。本發(fā)明大大提高了3-甲基-喹啉-2-羧酸檢測的靈敏度，且操作更加簡便，達(dá)到了高通量的目的，而且以磁性粒子作為固相載體，具有清洗和分離方便，操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，用DNA修飾的金納米粒子作為探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的HRP進(jìn)行免疫反應(yīng)，簡化了反應(yīng)的條件，提高了檢測的靈敏度，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。
文檔編號G01N33/543GK101315371SQ20081002203
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者冀寶慶, 李雅麗, 胥傳來, 愛 邊, 偉 陳 申請人:江南大學(xué)