專利名稱：：鑒定pi3k相互作用分子和純化pi3k的方法鑒定PI3K相互作用分子和純化PI3K的方法1本發(fā)明涉及使用苯基噻唑配體1作為PI3K的配體來鑒定PI3K相互作用分子和純化PI3K的方法。此外，本發(fā)明還涉及包含所述相互作用分子例如用于治療癌癥、代謝疾病或自身免疫/炎癥病變的藥物組合物。2激酶催化蛋白質(zhì)、脂類、糖、核苷和其它細胞代謝物的磷酸化，在真核細胞生理的所有方面都起關(guān)鍵作用。特別地，蛋白激酶和脂類激酶參與應(yīng)答于細胞外介體或刺激(例如生長因子、細胞因子或趨化因子)的控制細胞激活、生長、分化和存活的信號傳導(dǎo)事件。通常，蛋白激酶分為兩類，一類優(yōu)選磷酸化酪氨酸殘基，一類優(yōu)選磷酸化絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。3不適當?shù)母叩鞍准っ富钚陨婕霸S多疾病，包括癌癥、代謝疾病和自身免疫/炎癥病變。這可直接或間接地由酶的突變、過表達或不適當?shù)募せ顚?dǎo)致的控制機制失效引起。在所有這些情況下，期望激酶的選擇性抑制具有有益的效果。4已成為藥物發(fā)現(xiàn)近期焦點的一組脂類激酶是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族。PI3K家族的成員為催化Y-磷酸鹽從ATP轉(zhuǎn)移至磷脂酰肌醇及其衍生物(總稱為磷酸肌醇)的3，-羥基的脂類激酶。迄今為止從哺乳動物細胞中已經(jīng)分離出PI3K家族的八個成員(同工型(isoforms)),并且根據(jù)它們的一級結(jié)構(gòu)和底物特異性分為三類(IA類PI3Koc、P和5;IB類PI3Ky;II類PI3KC2oc、P和Y;III類Vps34酵母同源物)(Fruman等，1998.PhosphoinosUidekinases.AnnualReviewBiochemistry67，481-507;Cantley，LC,,2002，Science296，1655-1657)。5已知哺乳動物細胞表達PI3KIA類催化亞基的三種同工型(pllOoc，p110P和p1105，異名"PI3K5")。IB類僅包含一個成員(催化亞基)，其已命名為p110y或PI3Ky。除了其脂類激酶活性之外，PI3Ky還顯示出如由自身磷酸化所證明的，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。6關(guān)于這些激酶的生物學(xué)功能和它們作為藥物靶點的潛在應(yīng)用，其中缺失編碼PI3Ky或5的基因的基因操作小鼠的研究給出重要的信息。缺少PI3Ky或5的小鼠能存活，并且顯示獨特的暗示幾種潛在的治療性適應(yīng)癥(therapeuticindication)的表型。PI3Ky似乎是先天免疫系統(tǒng)的主要介體。例如，PI3Ky缺乏的巨噬細胞和中性粒細胞對于滲透發(fā)炎的腹膜顯示受損的能力。肥大細胞(mastcell)表示另一種在PI3Ky缺乏的小鼠中受影響的細胞類型。缺乏PI3K5的小鼠的表型的特征在于淋巴細胞功能的損傷和在控制適應(yīng)性免疫應(yīng)答中針對顯'性功倉fe(Wetzker和Rommel,CurrentPharmaceuticalDesign,2004，10，1915-1922)。7與廣泛表達的PI3Koc和P同工型相反，造血特異性同工型PI3Ky和5暗示重要的治療性適應(yīng)癥。這兩種同工型表現(xiàn)為用于治療由過度激活(hyperactive)的吞噬細胞、肥大細胞、B-和T-淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫/炎癥疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或過敏反應(yīng))的理想靶點。為了避免不想要的副作用，需要高度同工型選擇性抑制劑(0hasi和Woodgett2005，NatureMedicine11,924-925)。8鑒定和表征PI3K抑制劑的一個先決條件是提供適當?shù)臏y定(assays),優(yōu)選蛋白質(zhì)耙點的生理形式。在本領(lǐng)域，已經(jīng)提出幾種策略來處理這個問題。9傳統(tǒng)上，PI3K脂類激酶活性可以通過在具有磷脂囊泡的基于溶液的測定中使用純化或重組的酶來測定。該反應(yīng)通過添加酸化的有機溶劑來終止，隨后的相分離通過萃取或薄層色鐠分析進行(Carpenter等，1990,J.Biol.Chem.265，19704-19711)。10本領(lǐng)域描述的另一測定基于將磷酸鹽從放射性標記的ATP轉(zhuǎn)移至固定在板(plate)上的磷脂酰肌醇。該測定類型還使用重組PI3KY酶，但是可以以高通量模式進行(Fuchikami等，2002，J.Biomol.Screening7，441-450)。11另一生化篩選測定基于使用熒光團標記的磷酸肌醇的竟爭性熒光偏振(FP)格式(Prees等，2003，Comb.Chem,HighThroughputScreening6，321-330)。12最后，報道了基于焚光顯微成像和自動圖像分析的基于細胞的Akt-EGFP再分布測定。為此，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞用人類胰島素受體和Aktl-增強的綠色熒光蛋白(EGFP)融合構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。用類胰島素生長因子-l(IGF-l)刺激之后，PI3K被激活，Aktl-EGFP蛋白被招募至細胞膜。用PI3K同工型選擇性抑制劑的再分布測定的確認表明在IGF-1刺激后PI3Kot是在CH0宿主細胞中被激活的主要同工型(Wolff等，Comb.Chem.HighThroughputScreen.9，339-350)。13考慮到以上，需要提供鑒定PI3K相互作用化合物和分析其選擇性圖^普(selectivityprofiling)的有效方法以及純4匕PI3K的方法。14為了滿足該需求，在第一方面本發(fā)明提供了鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)使苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定所述化合物是否能夠從固定的苯基噻唑配體1中分離PI3K。15在第二方面，本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸，和c)檢測在步驟b)中形成的苯基塞唑配體l-PI3K復(fù)合物。16在第三方面，本發(fā)明提供鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的兩份等分試樣(aliquot),b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基塞唑配體l接觸，c)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使另一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1以及給定的化合物接觸，d)確定在步驟b)和c)中形成的苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的量。17在第四方面，本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供各自包含至少一種含有PI3K的細胞的兩份等分試樣，b)使一份等分試樣與給定的化合物一起溫育，c)收獲各等分試樣的細胞，d)裂解所述細胞以獲得蛋白質(zhì)制劑，e)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸，和f)確定在步驟e)中在各等分試樣中形成的苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的量。18在本發(fā)明的背景下，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)苯基噻唑配體1為PI3K配體。這使得能夠?qū)⒈交邕蚺潴w1用于篩選測定(例如用于竟爭性篩選測定)以及用于純化PI3K的方法。19苯基噻唑配體1的結(jié)構(gòu)在圖1中給出。該化合物為取代的噻唑(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺，其根據(jù)圖1具有鹽酸作為水溶液中的陰離子。然而，在本發(fā)明的背景中還考慮另外的抗衡離子。苯基噻唑配體1可以通過伯胺基共價地偶聯(lián)到適當?shù)墓腆w支持物材料上并用于分離結(jié)合蛋白。苯基噻唑配體1的合成在實施例1中描述。根據(jù)本發(fā)明，表述"苯基瘞唑配體1"還包括包含相同核心但具有用于連接至固體支持物的另一連接子(1inker)的化合物，所述連接子優(yōu)選偶聯(lián)到氮上而不是成為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分。典型的連接子具有8、9或10個原子的主鏈。連接子可以包含羧基-、羥基或氨基-活性基團。20因此，在優(yōu)選的實施方案中，表述"苯基瘞唑配體1"還包括具有相同N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心但在N原子處包含另一連接子的化合物，所述連接子例如其中任一個都任選地被卣素、幾基、氨基取代的Cl-C8烷羰基或CI-C8烷氨羰基(alkylaminocarbonyl)、Cl-C8烷氨基、Cl-C8烷氧羰基、任選地被羥基取代的CI-C8烷氧基或任選地被羥基或卣素取代的C1-C8烷基。此外，該表述還包括如上所述但具有另一閨素例如溴而不是4-氯殘基或在苯環(huán)上被例如卣素進一步取代的化合物。此外，還可以存在另一基團來代替甲磺?；缌u基、羧基或任選地被卣素取代的C1-C8烷基。21在特別優(yōu)選的實施方案中，落入表述"苯基噻唑配體1"內(nèi)的化合物選自3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-曱磺酰基-苯基)-4-曱基-噻唑一2基]-丙酰胺鹽酸鹽、3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)一乙氧基]-乙氧基}—乙氧基)—N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺，和具有相同的N-[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心的僅在N原子處被以下進一步取代的的化合物其中任一個都任選地被卣素、羥基、氨基取代的Cl-C8烷羰基或C1-C8烷氨羰基、C1-C8烷氨基、CI-C8炕氧羰基、任選地被羥基取代的Cl-C8烷氧基或任選地被羥基或卣素取代的Cl-C8烷基。22根據(jù)本發(fā)明，"PI3K，，包括PI3K家族的所有成員，所述PI3K家族包括IA類(例如PI3Koc、P和5)，IB類(例如PI3Ky)、II類(例如PI3KC2oc、P和Y)和III類(例如Vps34酵母同源物)。23人類PI3Ky(至今為止唯一已知的IB類成員)序列在圖4中給出。24人類PI3K5(IA類成員)序列在圖5中給出。25根據(jù)本發(fā)明，表述"PI3K"涉及人類和該家族的其它蛋白。該表述特別包括其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同源物、優(yōu)選地，這些低嚴緊條件包括在40。C下在包含35。/。甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP，0.02%BSA、100ug/ml變性的鮭魚精子DNA和10%(wt/vo1)硫酸葡聚糖的緩沖液中雜交18-20個小時，在55°C下在由2XSSC、25mMTris-HC1(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS組成的緩沖液中洗涂1-5小時，和在60。C下在由2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)5mMEDTA和0.1%SDS組成的緩沖液中洗滌1.5小時。26苯基噻唑配體1為P13K所有同工型(參見上文)的配體。然而，遍及本發(fā)明，優(yōu)選PI3K為PI3Ky或PI3K5，特別是其人類同工型。27在本發(fā)明的某些方面，首先提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑。本發(fā)明方法可以用任何蛋白質(zhì)制劑作為起始材料來進行，只要PI3K在該制劑中溶解。實例包括幾種蛋白的液體混合物，細胞裂解物、不包含的組合。術(shù)語"蛋白質(zhì)制劑"還包括溶解的純化蛋白。28在目的蛋白質(zhì)制劑中的PI3K蛋白種類的存在可以基于用特異性針對PI3K的抗體探測的蛋白質(zhì)印跡來檢測。在PI3K為特異同工型(例如PI3Ky和/或PI3K5)的情況下，所述同工型的存在可以通過同工型-特異性抗體來確定。此類抗體在本領(lǐng)域是已知的(Sasaki等.，2000，Nature406，897-902;Deoraetal.，1998，J.Biol.Chem.273，29923-29928)?？蛇x擇地，還可以使用質(zhì)i脊法(MS)(參見下文)。29細胞裂解物或部分細胞裂解物可以通過以下獲得首先分離細胞器(例如細胞核、線粒體、核糖體、高爾基體等)，然后制備源自這些細胞器的蛋白質(zhì)制劑。用于分離細胞器的方法在本領(lǐng)域是已知的(第4.2章PurificationofOrganellesfromMammalianCelIsin，，CurrentProtocolsinProteinScience"，編輯John.E.Coligan，BenM.D醒，HiddeLPloegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。30此外，蛋白質(zhì)制劑還可以通過以下來制備分級分離細胞提取物從而富集特定種類的蛋白質(zhì)例如細胞質(zhì)蛋白或膜蛋白(第4.3章SubcellularFractionationofTissueCultureCelIsin，，CurrentProtocolsinProteinScience"，編輯John.、E.Coligan，BenM.D廳，HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。31此外，還可使用來自體液(例如血液、腦脊液、腹腔液和尿)的蛋白質(zhì)制劑。32例如，可以使用源自模式生物例如線蟲(C.elegans)的確定發(fā)育階段或成體階段的全胚胎裂解物(wholeembryolysate)。此外，完整器官例如解剖自小鼠的心臟可以為蛋白質(zhì)制劑的來源。還可以在體外灌注這些器官以獲得蛋白質(zhì)制劑。33此外，蛋白質(zhì)制劑可以為包含重組產(chǎn)生的PI3K的制劑。在原核和真核細胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法已廣泛建立(第5章ProductionofRecombinantProteins，，CurrentProtocolsinProteinScience"，編輯John.E.Coligan,BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh,DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,1995，ISBN:0-471-14098-8)。34在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)制劑的提供包括收獲至少一種包含PI3K的細胞和裂解所述細胞的步驟。35用于此目的的合適細胞為例如表達PI3K家族的成員的那些細胞或組織。PI3K家族的成員在大多數(shù)細胞和組織中表達。PI3Ky優(yōu)先在造血系統(tǒng)的細胞(例如粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞和血小板)中以及在心肌細胞、血管平滑肌和血管上皮細胞中表達。PI3K5隨著在淋巴細胞、粒細胞和肥大細胞中顯著表達而普遍表達。36因此，在優(yōu)選的實施方案中，從外周血分離的細胞代表合適的生物材料。從外周血獲得的人類淋巴細胞和淋巴細胞亞群(PBLs)的制備和培養(yǎng)方法是普遍已知的(W.EBiddison，第2.2章"Preparationandcultureofhumanlymphocytes"inCurrentProtocolsinCellBiology,1998，JohnWiley&Sons,Inc.)。例如，密度梯度離心為從其它血細胞群(例如紅細胞和粒細胞)中分離淋巴細胞的方法。人類淋巴細胞亞群可以通過其特異性細胞表面受體來分離，所述特異性細胞表面受體可以被單克隆抗體識別。物理分離方法包括將這些抗體試劑偶聯(lián)至磁珠，所述磁珠允許富集與這些抗體結(jié)合的細胞(陽性選擇)。這些分離的淋巴細胞可以被進一步培養(yǎng)并通過添加針對T-細胞受體或共受體(例如CD-3)的抗體來刺激，以誘發(fā)T-細胞受體信號傳導(dǎo)和隨后PI3K的磷酸化(Houtman等，2005，TheJournalofImmunology175(4)，2449-2458)。37作為原代人類細胞的另一選擇，可以使用培養(yǎng)的細胞系(例如M0LT-4細胞或大鼠嗜堿性白血病(RBL-2H3)細胞)。RBL-2H3細胞可以通過用多價抗原交聯(lián)IgE的高親和力受體(FcepsilonRI)進行刺激以誘導(dǎo)PI3K的激活(Kato等，2006，J.Immunol.177(1):147-154)。38在優(yōu)選的實施方案中，細胞為細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的部分，并且用于從細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中收獲細胞的方法在本領(lǐng)域是已知的(如上述文獻)。39細胞的選擇將主要依賴于PI3K的表達，這是因為必須確保該蛋白質(zhì)主要地存在于所選擇的細胞中。為了確定對于本發(fā)明方法而言給定的細胞是否為合適的起始系統(tǒng)，例如蛋白質(zhì)印跡、基于PCR的核酸檢測方法、RNA印跡和DNA微陣列方法("DM芯片")等方法可能是合適的，以確定給定的目的蛋白是否存在于所述細胞中。40所述細胞的選擇還可受研究的目的影響。如果需要分析給定的藥物的體內(nèi)功效，則可以選擇出現(xiàn)期望療效的細胞或組織(例如粒細胞或肥大細胞)。相反，為了闡明(elucidation)介導(dǎo)不期望的副反應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點，可以分析觀察到所述副反應(yīng)的細胞或組織(例如心肌細胞、血管平滑肌或上皮細胞)。41此外，在本發(fā)明中設(shè)想包含PI3K的細胞可以例如通過活組織檢查從生物體獲得。相應(yīng)的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，活組織檢查為用于獲得少量組織的診斷方法，所述少量組織隨后可以顯微或用生化方法檢查?；罱M織檢查對于診斷疾病、將疾病分類和將疾病分階段，以及評價和監(jiān)控藥物治療都是重要的。42通過收獲至少一種細胞，同時進行裂解，這包含在本發(fā)明內(nèi)。然而，首先收獲所述細胞然后單獨地裂解也同樣地優(yōu)選。43裂解細胞的方法在本領(lǐng)域是已知的(Karwa和Mitra:Samplepreparationfortheextraction,isolation,andpurificationofNucleiAcids;chapter8in，，SamplePreparationTechniquesinAnalyticalChemistry"，Wiley2003，編輯SomenathMitra，印刷ISBN:0471328456;在線ISBN:0471457817)。不同細胞類型和組織的裂解可以通過以下來實現(xiàn)勻漿器(例如Potter勻漿器)、超聲粉碎機、酶裂解、洗滌劑(例如NP-40，TritonX-IOO，CHAPS,SDS)、滲透壓休克、反復(fù)凍融，或這些方法的組合。44根據(jù)本發(fā)明方法，在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸。45在本發(fā)明中，術(shù)語"苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物，，表示其中苯基瘞唑配體1與PI3K通過例如共價或最優(yōu)選通過非共價結(jié)合相互作用的復(fù)合物。46本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以使用什么條件以使得能夠形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物。47在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"在允許形成復(fù)合物的條件下"包括在其下此類形成、優(yōu)選此類結(jié)合是可行的所有條件。這包括使固體支持物在固定的相上和將裂解物倒在其上的可能性。在另一優(yōu)選實施方案中，還包括所述固體支持物為顆粒形式并且與所述細胞裂解物混合。48在非共價結(jié)合的背景下，苯基噻唑配體1和PI3K之間的結(jié)合通過例如鹽橋、氫鍵、疏水性相互作用，或其組合。49在優(yōu)選的實施方案中，苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的形成步驟在基本上生理條件(essentiallyphysiologicalconditions)下進行。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)描述于Petty,1998(HowardR.Petty1,Chapter1，Unit1.5in:JuanS.Bonifacino，MaryDasso，JoeB.Harford,JenniferLippincott-Schwartz，和KennethM.Yamada(eds.)Cwrre/t^ProtocoJs/力Ce//Copyright2003JohnWiley&Sons,Inc.版權(quán)所有.里:10.1002/0471143030.cb0101s00在線發(fā)布日期2001年5月，印刷公布日期1998年10月)。50在基本上生理條件下的接觸具有以下優(yōu)點配體、細胞制劑(即待表征的激酶)和任選地化合物之間的相互作用最大可能地反映天然條件。"基本上生理條件"尤其為存在于原始的、未處理的樣品材料中的那些條件。它們包括生理蛋白質(zhì)濃度、pH、鹽濃度、緩沖能力和涉及的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。術(shù)語"基本上生理條件，，不需要與從中得到樣品的最初活生物體中的條件相同的條件，但是需要基本上類似細胞的條件或與細胞條件接近的條件。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到由于將最終導(dǎo)致較少類似細胞的條件的實驗結(jié)構(gòu)，可能產(chǎn)生某些限制。例如，當從活生物體中取出和處理樣品時，細胞壁或細胞膜的最終所需的破壞可能需要與在生物體中發(fā)現(xiàn)的生理條件不同的條件。為了實施本發(fā)明方法，生理條件的適當?shù)淖兓瘜Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，并且包含于本文所用的術(shù)語"基本上生理條件"中?？傊?，應(yīng)理解術(shù)語"基本上生理條件"涉及與例如在天然細胞中發(fā)現(xiàn)的生理條件接近的條件，但不必然地需要這些條件相同。51例如，"基本上生理條件"可以包含50-200mMNaCl或KC1、pH6.5-8.5、20-37。C和0.001-10mM二價陽離子(例如Mg++，Ca++，)；更優(yōu)選約150mNaCl或KC1、pH7.2至7.6、5mM二價陽離子，并且經(jīng)常包括O.01-1.0百分比的非特異性蛋白(例如BSA)。非離子洗滌劑(Tween，NP-40，Triton-XlOO)經(jīng)?？梢砸酝ǔ＜s0.001至2%，典型地0.05-0.2%(體積/體積)存在。對于一般指導(dǎo)，可應(yīng)用以下水性緩沖條件10-250mMNaCl、5-50mMTrisHC1、pH5-8，具有任選添加的二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子洗滌劑。52優(yōu)選地，"基本上生理條件"指6.5至7.5,優(yōu)選7.0至7.5的pH，和/或10至50mM，優(yōu)選25至50mM的緩沖液濃度，和/或120至170mM，優(yōu)選150niM的單價鹽(例如Na或K)濃度?？梢赃M一步以1至5mM，優(yōu)選1至2mM的濃度存在二價鹽(例如Mg或Ca)，其中更優(yōu)選所述緩沖液選自Tris-HC1或HEPES。53在本發(fā)明的背景中，苯基噻唑配體1固定在固體支持物上。遍及本發(fā)明，術(shù)語"固體支持物"涉及能夠在其表面上固定小分子配體的每一不溶性支持物。54根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，固體支持物選自瓊脂糖、改性的瓊脂糖、瓊脂糖凝膠珠(例如NHS-活化的瓊脂糖凝膠)、膠乳、纖維素、亞鐵-或鐵磁性顆粒。55苯基噻唑配體1可以共價地或非共價地偶聯(lián)到固體支持物上。非共價結(jié)合包括通過結(jié)合到鏈霉抗生物素基質(zhì)(steptavidinmatrices)的生物素親和配體來結(jié)合。56優(yōu)選地，苯基瘞唑配體1共價地偶聯(lián)到固體支持物上。57偶聯(lián)前，基質(zhì)可以包含活性基團例如NHS、Carbodimide等以使得能夠與苯基噻唑配體1偶聯(lián)反應(yīng)。苯基噻唑配體1可以通過直接偶聯(lián)(例如使用官能團例如氨基-、巰基-、羧基-、羥基-、醛基-和酮基)和通過間接偶聯(lián)(例如通過生物素、共價地連接至苯基噻唑配體1的生物素和使生物素非共價地結(jié)合至直接結(jié)合到固體支持物的鏈霉抗生物素)偶聯(lián)至固體支持物上。58與固體支持物材料的連接可以包括可裂解和不可裂解連接子。該裂解可以通過酶裂解或用適當?shù)幕瘜W(xué)方法處理來實現(xiàn)。59對于使苯基噻唑配體1結(jié)合至固體支持物材料上，優(yōu)選的結(jié)合界面為具有C原子主鏈的連接子。典型的連接子具有8、9或10個原子的主鏈。該連接子包含羧基或氨基活性基團。60本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到在本發(fā)明方法的各步驟之間，可能需要洗滌步驟。該洗滌為本領(lǐng)域技術(shù)人員的部分知識。該洗滌用于從固體支持物中除去細胞裂解物的未結(jié)合組分。非特異性(例如簡單的離洗滌緩沖液中的鹽濃度來最小化。61根據(jù)本發(fā)明的鑒定方法，讀出系統(tǒng)(read-outsystem)為檢測或確定PI3K(本發(fā)明的第一方面)、檢測苯基嚷唑配體l-PI3K復(fù)合物(本發(fā)明的第二方面)或確定苯基噻唑配體1-P13K復(fù)合物的量(本發(fā)明的第二、三和四方面)。62在根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法中，檢測或確定分離的PI3K優(yōu)選表示以下事實該化合物能夠從固定的苯基噢唑配體1中分離PI3K。該能力表明各化合物與PI3K相互作用，優(yōu)選結(jié)合到PI3K，這表明其治療潛力。63在根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法的一個實施方案中，檢測在本發(fā)明方法期間形成的苯基噻唑配體1-P13K復(fù)合物。形成此類復(fù)合物的事實優(yōu)選地表明該化合物不完全抑制復(fù)合物的形成。另一方面，如果不形成復(fù)合物，則推測該化合物為PI3K的強相互作用子，這表明其治療潛力。64根據(jù)本發(fā)明第二、三和四方面的方法，確定在本方法期間形成的苯基瘞唑配體l-PI3K復(fù)合物的量。通常，在各化合物的存在下形成的復(fù)合物越少，各化合物與PI3K相互作用越強，這表明其治療潛力。65根據(jù)本發(fā)明第二方面，苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的檢測可以通過使用標記的針對PI3K的抗體和合適的讀出系統(tǒng)來進行。66根據(jù)本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實施方案，苯基噢唑配體l-PI3K復(fù)合物通過確定其量來檢測。67在本發(fā)明第二、三和四方面的過程中，優(yōu)選PI3K從固定的苯基瘞唑配體1中分離以確定苯基蓉唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。68根據(jù)本發(fā)明，分離指破壞苯基噻唑配體1和PI3K之間相互作用的每一行為。在優(yōu)選的實施方案中這包括從固定的苯基瘞唑配體1中洗脫PI3K。69洗脫可以通過使用如下詳細描述(離子強度、pH值、洗滌劑)的非特異性試劑來實現(xiàn)。此外，能夠測試目的化合物是否能夠從苯基噻唑配體1中特異性地洗脫PI3K。此類PI3K相互作用化合物在以下部分進一步描述。70用于破壞相互作用的此類非特異性方法在本領(lǐng)域中大體上已知，并且依賴于配體酶相互作用的性質(zhì)。大體上，離子強度、pH值、溫度的變化或與洗滌劑一起溫育為從固定的配體中解離乾酶的適當方法。洗脫緩沖液的使用能夠通過以下解離結(jié)合的配對物(bindingpartners):pH值的極端值(extreme)(高或低pH，例如通過使用0.1MpH2-3的檸檬酸鹽降低pH)、離子強度的改變(例如使用Nal、KI、MgC12或KC1的高鹽濃度)、破壞疏水性相互作用的極性還原劑(例如二噍烷或乙二醇)、或變性劑(離液鹽或洗滌劑例如十二烷基硫酸鈉、SDS;綜述SubramanianA.，2002，Immunoaffintychromatography),71在某些情況下，優(yōu)選必須將固體支持物與釋放的物質(zhì)分離。用于此的各方法依賴于固體支持物的性質(zhì)，并且在本領(lǐng)域中是已知的。如果支持物材料包含于柱內(nèi)，可以收集釋放的物質(zhì)為柱流出物。在支持物材料與裂解物組分混合的情況下(所謂的分批方法)，可能需要額外的分離步驟例如溫和的離心，并且收集釋放的物質(zhì)為上清液?？蛇x擇地，磁珠可以用作固體支持物以便通過使用磁性裝置從樣品中除去所述珠。72在根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法的步驟d)中，確定PI3K是否已經(jīng)從固定的苯基噻唑配體1中分離。這可以包括檢測PI3K或確定PI3K的量。73因此，至少在本發(fā)明所有鑒定方法的優(yōu)選實施方案中，使用檢測分離的PI3K或確定其量的方法。此類方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括物理-化學(xué)方法例如蛋白質(zhì)測序(例如Edmann降解)、通過質(zhì)譜法或使用針對PI3K的抗體的免疫檢測方法的分析。74遍及本發(fā)明，如果使用抗體以檢測PI3K或以確定其量(例如通過ELISA)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如果檢測特定的PI3K的同工型或如果確定特定的PI3K的同工型的量，可以使用同工型-特異性抗體。如上所述，此類抗體在本領(lǐng)域中是已知的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其生產(chǎn)方法。75優(yōu)選地，通過質(zhì)鐠或免疫檢測方法檢測PI3K或確定PI3K的76用質(zhì)譜分析(質(zhì)鐠)鑒定蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中是已知的(Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858，；Mann等2001，Analysisofproteinsandproteomesbymassspectrometry,AnnualReviewofBiochemistry70，437-473)，并且在實施例部分進一步描述。77優(yōu)選地，質(zhì)謙分析以定量方式進行，例如通過使用iTRAQ技術(shù)(同位素標簽相對和絕對定量)或cICAT(可裂解同位素編碼親和標簽(cleavableisotope-codedaffinitytags))(Wu等，2006.J.ProteomeRes.5，651-658等)。78根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案，通過鑒定PI3K的蛋白典型肽(proteotypicpeptide)來進行質(zhì)i普(MS)的表征。該想法為PI3K用蛋白酶進行消化，所得的肽通過MS確定。結(jié)果，對于相同來源蛋白質(zhì)的肽而言肽頻率在很大程度上不同，"典型地"有助于鑒定該蛋白的最經(jīng)常觀察到的肽被命名為"蛋白典型肽"。因此，用于本發(fā)明的"蛋白典型肽"為實驗上良好可觀察的肽，其獨特地鑒定特異蛋白或蛋白同工型。"根據(jù)優(yōu)選的實施方案，通過比較在實施本發(fā)明方法的過程中獲得的蛋白典型肽與已知的蛋白典型肽來進行表征。當使用通過蛋白酶消化制備的片段在MS中鑒定蛋白質(zhì)時，通常對于給定的酶觀察到相同的蛋白典型肽，因此，可以將對于給定樣品獲得的蛋白典型肽與對于給定種類的酶的酶而言已知的蛋白典型肽比較，從而鑒定存在于樣品中的酶。80作為質(zhì)鐠分析的另一選擇，可以通過使用針對PI3K(或針對PI3K的同工型，參見上文)的特異性抗體檢測洗脫的PI3K(包括共洗脫的結(jié)合的配對物或支架蛋白(scaffoldprotein))或確定其量。81此外，在另一優(yōu)選的實施方案中，一旦已經(jīng)通過質(zhì)譜分析鑒定出共洗脫的結(jié)合的配對物，各結(jié)合的配對物可以用針對該蛋白質(zhì)的特異性抗體來檢測。82適當?shù)幕诳贵w的測定包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、ELISA測定、夾心ELISA測定和抗體測定或其組合。此類測定的建立在本領(lǐng)域是已知的(第11章，Immunology,pages11-1to11-30in:ShortProtocolsinMolecularBiology.第四版，由F.M，A謂bel等編輯，Wiley,NewYork,1999)。83這些測定不僅能夠以檢測和定量目的PI3K相互作用蛋白(例如PI3K復(fù)合物的催化性或調(diào)控性亞基)的方式，還能夠以分析翻譯后修飾模式例如磷酸化或泛素化修飾的方式配置。84此外，本發(fā)明的鑒定方法包括使用就其為PI3K相互作用化合物的能力對其進行測試的化合物。85大體上，根據(jù)本發(fā)明，此類化合物可以為能夠與PI3K相互作用(例如通過抑制其結(jié)合至苯基噻唑配體1)的每一分子。優(yōu)選地，該化合物對PI3K起作用，例如刺激性或抑制性作用。86優(yōu)選地，所述化合物選自合成或天然存在的化學(xué)化合物或有機合成藥物，更優(yōu)選小分子、有機藥物或天然小分子化合物。優(yōu)選地，從包含此類化合物的文庫開始鑒定所述化合物。然后，在本發(fā)明的過程中，篩選此類文庫。87此類小分子優(yōu)選不是蛋白質(zhì)或核酸。優(yōu)選地，小分子顯示低于1000Da、更優(yōu)選低于750Da、最優(yōu)選低于500Da的分子量。88根據(jù)本發(fā)明的"文庫"涉及(許多)不同化學(xué)實體的(通常巨大的)集合，所述化學(xué)實體以分類的方式提供，其使得能夠快速官能化分析(篩選)不同的單獨的實體，并且同時提供快速鑒定形成文庫的單獨的實體。實例為在表面上包含化學(xué)化合物的管或孔或點的集合，所述化學(xué)化合物可以與一種或多種確定的潛在相互作用配對物(interactingpartner)—起以高通量的方式加入反應(yīng)。鑒定所需要的配對物的"陽性"相互作用之后，由于文庫構(gòu)造，可以快速地鑒定各化合物。合成和天然起源的文庫可以購買或由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計。89文庫構(gòu)造的實例提供于例如BreinbauerR，MangerM，ScheckM，WaldmannH.Naturalproductguidedcompoundlibrarydevelopment.CurrMedChem.2002Dec;9(23):2129-45,其中對對于設(shè)計組合文庫而言為生物學(xué)有效起始點的天然產(chǎn)物進行描述，因為它們具有生物相關(guān)性的已證明記錄。在藥物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)中天然產(chǎn)物的該特殊作用可以根據(jù)通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)獲得的關(guān)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)架(domainarchitecture)的新觀點進行解釋。為了滿足結(jié)構(gòu)域家族內(nèi)單獨的結(jié)合口袋的特殊需求，可能必須通過化學(xué)變化最優(yōu)化天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。據(jù)說固相化學(xué)成為用于這一最優(yōu)化過程的有效工具，并且該領(lǐng)域的最新進展在該綜述論文中被突出強調(diào)。其它相關(guān)文獻包括EdwardsPJ，MorrellAI.Solid-phasecompoundlibrarysynthesisindrugdesignanddevelopment.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002Jul;5(4):594-605.;MerlotC，DomineD，ChurchDJ.Fragmentanalysisinsmallmoleculediscovery.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002May;5(3):391-9.Review;Good歸RAJr.Currentpracticesingenerationofsmallmoleculenewleads.JCellBiochemSuppl.2001;Suppl37:13-21;其描述在許多藥物公司中目前藥物發(fā)現(xiàn)方法需要巨大的和不斷增長的高質(zhì)量的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)(leadstructures)的集合以用于高通量篩選測定。過去具有各種結(jié)構(gòu)和"類藥物"性質(zhì)的小分子的集合通過以下幾種方法獲得通過之前內(nèi)部先導(dǎo)最優(yōu)化成果的存檔，通過從化合物供應(yīng)商購買，和通過公司兼并后分開的集合的合并。雖然高通量/組合化學(xué)被描述為新的先導(dǎo)產(chǎn)生方法中的重要組成，但用于合成的文庫設(shè)計和隨后文庫成員的設(shè)計的選擇已經(jīng)發(fā)展到新水平的挑戰(zhàn)性和重要性。針對多個生物學(xué)靶點的多個小分子化合物文庫設(shè)計的篩選的潛在利益為發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)提供了實質(zhì)上的機會。90在本發(fā)明第二和第三方面的優(yōu)選實施方案中，將包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑首先與化合物然后與固定的苯基噻唑配體1一起溫育。然而，將化合物和固定的苯基噻唑配體1與包含P13K的蛋白質(zhì)制劑一起同時溫育(共溫育)是同等優(yōu)選的(竟爭性結(jié)合測定)。91在首先與化合物溫育的情況下，PI3K優(yōu)選與該化合物在4。C至37。C，更優(yōu)選4。C至25°C，最優(yōu)選4°C的溫度下一起溫育10至60分鐘，更優(yōu)選3G至45分鐘。優(yōu)選以1iiM至lmM，更優(yōu)選10至IOOjaM范圍的濃度使用化合物。第二步，與固定的配體接觸，優(yōu)選在4°C下進行10至60分鐘。92在同時溫育的情況下，PI3K優(yōu)選與化合物和苯基瘞哇配體1一起在4。C至37。C，更優(yōu)選4。C至25。C，最優(yōu)選4°C的溫度下同時溫育30至120分鐘，更優(yōu)選60至120分鐘。優(yōu)選以1iuM至1mM，更優(yōu)選IO至IOOjuM范圍的濃度使用化合物。93此外，本發(fā)明第二方面的步驟a)至c)可以用幾種蛋白質(zhì)制劑來進行以測試不同的化合物。該實施方案在中或高通量篩選的背景下特別有利(參見下文)。"根據(jù)第三或第四方面的本發(fā)明方法的優(yōu)逸實施方案中，比較在步驟c)中形成的苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的量與在步驟b)中形成的量。95根據(jù)第三或第四方面的本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，在步驟c)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物與步驟b)相比減少的量表明PI3K為該化合物的靶點。這源自以下事實在本發(fā)明此方法的步驟c)中，該化合物與配體竟爭結(jié)合PI3K。如果較少的PI3K存在于與該化合物一起溫育的等分試樣中，那么這意味著該化合物優(yōu)選與抑制劑竟爭與酶相互作用，因此，其為該蛋白質(zhì)的直接靶點，反之亦然。96優(yōu)選地，本發(fā)明的鑒定方法以中或高通量篩選方式來進行。97根據(jù)本發(fā)明鑒定的相互作用化合物可以通過確定其對PI3K，例如對其激酶活性是否起作用來進一步表征(Carpenter等，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。此類測定在本領(lǐng)域是已知的，也以允許中至高通量篩選的形式(Fuchikami等，2002，J.Biomol.Screening7,441-450)。98簡要地說，PI3K脂類激酶活性可以使用具有磷脂嚢泡的基于溶液的測定來測量。該反應(yīng)通過添加酸化的有機溶劑來終止，隨后的相分離通過萃取或薄層色譜分析來進行(Carpenter等，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。99可選擇地，可以使用熒光偏振測定形式。簡要地說，PI3K與適當?shù)牧姿峒〈嫉孜镆黄饻赜?。反?yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)物與特異性磷酸肌醇檢測蛋白和熒光磷酸肌醇探針混合。隨著結(jié)合到磷酸肌醇檢測蛋白上的探針被反應(yīng)產(chǎn)物代替，偏振(mp)值降低。熒光探針偏振的程度與PI3K反應(yīng)產(chǎn)物的量成反比例(Drees等，2003，Comb.Chem.HighThroughputScreening6,32卜330)。100為了確定PI3K蛋白激酶活性，可以使用具有適當肽底物的熒光偏振測定。簡要地it，熒光素標記的肽底物可以與PI3K(例如PI3K5)、ATP和抗磷酸絲氨酸抗體一起溫育。隨著反應(yīng)進行，磷酸化的肽結(jié)合到抗磷酸絲氨酸抗體，導(dǎo)致偏振信號增加。抑制激酶的化合物導(dǎo)致低的偏振信號。101根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物可以被進一步最優(yōu)化(先導(dǎo)優(yōu)化)。由于在這些先導(dǎo)產(chǎn)生文庫(leadgeneration1ibraries)中編碼的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)信息，通常促進此類化合物的隨后的最優(yōu)化。由于用于后續(xù)合成的高通量化學(xué)(HTC)方法的易適應(yīng)性，通常促進先導(dǎo)最優(yōu)化。102針對pi3ky，描述此類文庫和先導(dǎo)最優(yōu)化的一個實例(Pomel等，2006，J.med.Chem.49,3857—3871)。103本發(fā)明進一步涉及制備藥物組合物的方法，其包括以下步驟a)如上所述鑒定PI3K相互作用化合物，和b)將所述相互作用化合物配制成藥物組合物。104因此，本發(fā)明提供制備藥物組合物的方法，其可以以有效量施用給受試者。在優(yōu)選方面，治療劑(therapeutic)被充分純化。待治療的受試者優(yōu)選動物，其包括但不限于例如牛、豬、馬、雞、貓、狗等動物，并且優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類。在特定實施方案中，非人類哺乳動物為受試者。105將根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物用于預(yù)防或治療其中PI3K起作用的疾病，例如癌癥(例如乳腺、結(jié)腸或卵巢癌)、代謝疾病(例如糖尿病或肥胖)或自身免疫/炎癥病變(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘或過敏反應(yīng))。106因此，本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法鑒定的化合物在制備治療一種或多種上述疾病的藥物中的用途。此外，本發(fā)明涉及包含所述化合物的藥物組合物。107通常，本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的治療劑、藥學(xué)上可接受的載體。在特定實施方案中，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"指被聯(lián)邦或國家政府的管理機構(gòu)批準的或列于美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其它普遍認可的藥典用于動物，特別是人類的。術(shù)語"栽體"指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介(vehicle)。此類藥物載體可以為無菌液體，例如水或油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，包括但不限于花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當口服施用藥物組合物時，水為優(yōu)選的載體。當藥物組合物靜脈內(nèi)施用時，鹽水或水性葡萄糖為優(yōu)選的載體。優(yōu)選將鹽水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液用作可注射溶液的液體載體。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物也可以包含少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以釆取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑等形式。該組合物可以與傳統(tǒng)的粘合劑和載體例如甘油三酸酯一起配制成栓劑。口服制劑可以包括標準載體例如藥物級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的實例描述于由E.W.Martin編寫的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中。此類組合物將包含治療有效量的治療劑，優(yōu)選以純的形式，以及適當量的載體，以提供恰當?shù)氖┯媒o患者的形式。制劑應(yīng)該適合施用的模式。108在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制為適于靜脈內(nèi)施用給人類的藥物組合物。典型地，用于靜脈內(nèi)施用的組合物為在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。當必要時，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因以減輕注射部位的疼痛。通常，成分單獨或在單位劑型中混合在一起供給，例如作為在密封容器例如標明活性試劑量的安瓿或sachette中的干燥凍干粉末或無水濃縮物。當該組合物通過灌輸施用時，其可以用包含無菌藥物級別的水或鹽水的輸液瓶配藥。當該組合物通過注射施用時，可以提供含注射用無菌水或鹽水的安瓿以便成分可以在施用之前混合。109本發(fā)明的治療劑可以配制為中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離羧基形成的那些鹽，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些鹽，與游離氨基形成的那些鹽，例如衍生自異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些鹽，和衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鐵氫氧化物等的那些鹽。110在治療特定疾病或病況中有效的本發(fā)明治療劑的量將依賴于疾病或病況的性質(zhì)，并且能夠由標準臨床技術(shù)確定。此外，可以任選使用體外測定以幫助鑒定最佳劑量范圍。用于制劑的精確劑量也將依賴于給藥途徑，和疾病或病癥的嚴重性，并且應(yīng)該根據(jù)從業(yè)者的判斷和各病人的情況決定。然而，用于靜脈內(nèi)施用的合適劑量范圍通常為約20-500毫克活性化合物每千克體重。用于鼻內(nèi)給藥的合適劑量范圍通常為約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重?？梢詮牡米泽w外或動物模式測試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線推斷有效劑量。通常，栓劑可以以0.5%至10%重量的范圍包含活性成分，口服制劑優(yōu)選包含10%至95°/活性成分。111各種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可以用于施用本發(fā)明治療劑，例如，包裝在脂質(zhì)體、微粒和微膠嚢中使用能夠表達治療劑的重組細胞，使用受體-介導(dǎo)的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem，262:4429-4432);構(gòu)建治療核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的部分等。導(dǎo)入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。所述化合物可以通過任意常規(guī)途徑施用，例如通過灌輸、通過團注、通過經(jīng)由上皮或皮膚粘膜的內(nèi)襯(linings)(例如，口腔、直腸和腸粘膜等)的吸收，可以與其它生物活性劑一起施用。給藥可以是全身或局部的。此外，可能需要通過任何適當?shù)耐緩?，包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射，將本發(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腦室內(nèi)注射可以通過腦室內(nèi)導(dǎo)管促進，例如，連接至貯器(reservoir)，例如奧馬耶jj^器(0mmayareservoir)。也可以^吏用肺部給藥，例如，通過使用吸入器或噴霧器，以及用氣霧化劑配制。112在特定實施方案中，可能需要將本發(fā)明的藥物組合物局部施用至需要治療的區(qū)域。這可以通過例如(不以限制方式)以下方式來實現(xiàn)手術(shù)期間的局部灌輸，例如手術(shù)后與創(chuàng)傷敷料一起的局部應(yīng)用，通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑、或通過植入物，所述植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，例如硅橡膠(sialastic)膜，或纖維。在一個實施方案中，可以通過在惡性腫瘤或瘤或前瘤組織的位置(或前體位置)直接注射給藥。113在另一實施方案中，治療劑可以在嚢泡，特別是脂質(zhì)體中遞送(Langer，1990，Science249:1527-1533)。114在另一實施方案中，治療劑可以通過控釋系統(tǒng)遞送。在一實施方案中，可以使用泵(Langer，如上所述)。在還一實施方案中，控釋系統(tǒng)可以置于治療目標(即腦)的附近，從而僅需要全身劑量的部分。115本發(fā)明進一步涉及純化PI3K的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸，和c)從固定的苯基噻唑配體1中分離PI3K。116如上所述，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)苯基噻唑配體1為識別PI3K的配體。其使得能夠進行有效的PI3K純化方法。117關(guān)于PI3K、包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑、用于與苯基噻唑配體l接觸的條件、固定的苯基瘞唑配體l、苯基瘞唑配體l-PI3K復(fù)合物、從固定的苯基噢唑配體1中分離PI3K和檢測PI3K或確定其量，將用于本發(fā)明鑒定方法的如上所述的實施方案也用于本發(fā)明的純化方法。118在優(yōu)選的實施方案中，純化方法進一步包括純化PI3K的特定同工型的步驟，優(yōu)選純化PI3Ky和/或PI3K5的步驟。119優(yōu)選地，所述純化使用如上所述的同工型特異性抗體，更優(yōu)選PI3Ky特異性抗體和/或PI3K5特異性抗體來進行。120在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的純化方法進一步包括在步驟c)之后鑒定能夠結(jié)合至PI3K的蛋白質(zhì)。當復(fù)合物的形成在基本上生理條件下進行時，這特別引起關(guān)注，這是因為其后能夠保持酶的天然條件，包括結(jié)合的配對物、酶亞基或翻譯后修飾的存在，其然后在質(zhì)i普(MS)的幫助下能夠進行鑒定。121因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的純化方法進一步包括在步驟c)之后確定PI3K是否進一步被翻譯后修飾，例如被泛素化修飾o122本發(fā)明進一步涉及苯基噻唑配體1在鑒定PI3K相互作用化合物和在純化PI3K中的用途。如上所述的實施方案也可用于本發(fā)明的用途。123通過以下附圖和實施例進一步闡述本發(fā)明，不認為其限制由本申請的權(quán)利要求確定的保護范圍。附圖簡述124圖1:苯基瘞唑配體1的合成和結(jié)構(gòu)苯基噻唑配體1按照實施例1中所述合成。125圖2:使用固定的苯基噻唑配體l的藥物下拉實驗(pulldownexperiment)和PI3K蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡檢測。將從M0LT-4細胞制備的細胞裂解物用作生物材料。按照實施例2中所述用包含50mg蛋白質(zhì)的裂解物樣品進行藥物下拉實驗。捕獲的蛋白質(zhì)用包含DMSO的緩沖液(泳道1)、10GjaM游離苯基噻唑配體l或SDS樣品緩沖液(泳道3)洗脫。洗脫的樣品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到膜上。首先用針對pi3ky(圖2a)和pi3k5(圖2B)的特異性抗體溫育印跡。用Odyssey紅外成像系統(tǒng)使用檢測用熒光染料標記的第二檢測抗體。泳道l:DMSO洗脫對照；泳道2:用1Q0jaM游離苯基噻唑配體1的洗脫；泳道3:SDS洗脫。126圖3:用于蛋白質(zhì)質(zhì)語分析的使用固定的苯基噻唑配體1的藥物下拉實驗。示出用考馬斯亮藍染色后的蛋白質(zhì)凝膠。將標記的凝膠區(qū)域切下作為凝膠切片，蛋白質(zhì)通過質(zhì)鐠進行分析。按照實施例2中所述使用包含50mg蛋白質(zhì)的M0LT-4細胞裂解物樣品進行藥物下拉實驗。結(jié)合到固定的苯基噻唑配體1的蛋白質(zhì)用SDS樣品緩沖液洗脫，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。127圖4:PI3Ky的鑒定的肽將通過質(zhì)譜分析人類PI3K5序列鑒定出的肽以黑體的形式顯示并加下劃線。128圖5:pi3k5的鑒定的肽。將通過質(zhì)譜分析人類PI3Kv序列鑒定出的肽以黑體的形式顯示并加下劃線。129圖6:用于鑒定PI3Ky相互作用化合物的洗脫測定該實驗按照實施例3中所述進行。通過固定的苯基噻唑配體1從M0LT-4細胞裂解物中捕獲PI3KY蛋白質(zhì)，并通過標示的化合物將其洗脫。將洗脫物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，并用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測PI3Ky。一抗抗PI3Ky(JenaBioscienceABD-026S;小鼠抗體)。二抗抗小鼠IRDye800(Rockland,610-732-124)。示出積分強度(積分千像素/mm2)。用于洗脫物的化合物化合物1(LY29004);IC5。>100jaM;化合物2(AS-605240):IC5。-26nM;化合物3(AS-604850);IC5。-1.7pM。130圖7:用于鑒定PI3Ky相互作用化合物的竟爭結(jié)合測定該實驗按照實施例4中所述進行。將在標示濃度下的測試化合物和親和基質(zhì)加至M0LT-4細胞裂解物，不與測試化合物相互作用的PI3KY蛋白質(zhì)通過在親和基質(zhì)上的固定的苯基噻唑配體1捕獲。將親和基質(zhì)從裂解物中分離，結(jié)合的蛋白質(zhì)用SDS樣品緩沖液洗脫，將洗脫物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。PI3Ky的量用Odyssey紅外成像系統(tǒng)確定。7A:用抗體探測的斑點印跡和用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測的信號。一抗抗-PI3Ky(JenaBioscienceABD-026S;小鼠抗體)。二抗抗小鼠IRDye800(Rockland,610-732-124)。7B:竟爭結(jié)合曲線。將相對Odyssey單位(積分強度；積分千像素/mm2)相對于化合物濃度繪圖，并且計算出半最大結(jié)合竟爭(halfmaximalbindingcompetition)(IC)值。化合物1(LY294002):IC50>30nM;化合物2(AS-605240):IC5。=4.6jaM;化合物3(AS-604850):IC5。=176nM。131圖8:通過添加化合物至細胞裂解物(裂解物測定)或通過將化合物與活RAW264.7細胞一起溫育(細胞測定)分析化合物圖譜(Compoundprofiling)。該實驗按照實施例5中所述進行。在兩個測定中以10yM的濃度使用化合物，PI3K5的量用Odyssey紅外成^f象系統(tǒng)定量。實施例1親和基質(zhì)的制備132該實施例舉例說明用于從細胞裂解物中親和捕獲PI3K激酶的親和基質(zhì)的制備。捕獲性配體通過使用氨基官能團的共價鍵共價地固定在固體支持物上。將該親和基質(zhì)用于實施例2、實施例3和實施例4。133苯基噻唑配體1(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽)的合成134步驟1-3:按照W02003/072557中描迷的方法制備1-溴-1-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-丙烷-2-酮。135步驟4:5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-曱基-噻唑-2-基胺136使1-溴-1-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-丙烷-2-酮(480mg1.5mmol)和硫脲(114mg1.5mmo1)在乙醇(12ml)中化合，并且加熱至70。C，持續(xù)2個小時。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫，通過過濾和真空干燥收集固體產(chǎn)物以產(chǎn)生灰白色固體5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-漆唑-2-基胺(375mg)。力腿(400MHzDMS0-《)S9.4(brs，2H)，8.0(d，1H)，7.9(d,1H)，7.8(dd，1H)，3.4(s，3H)，2.3(s，3H)。137步驟5:(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基一噻唑一2一基氨基曱?；鵠一乙氧基}_乙氧基)一乙氧基]一乙氧基}-乙基)-氨基曱酸叔丁酯138使3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基)-丙酸(690mg1.9mmol)、EDAC(403mg2.lmmol)、H0BT(284mg2.lmmol)、匪(420uL3.8mmol)和5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(520邁g1.7mmol)在二甲基甲酰胺(16ml)中化合，并在室溫下攪拌過夜。減壓除去溶劑，將殘留物溶于二氯甲烷(150ml)，用1MHC1水溶液(50ml)和飽和碳酸氫鈉水溶液(50ml)洗滌，千燥(硫酸鎂)，過濾和蒸發(fā)。通過快速層析(使用50gIST二氧化硅flashcartridge,用0-2°/曱醇/二氯曱烷洗脫)來純化殘留物以產(chǎn)生油(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺?；?苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲?；鵠-乙氧基}—乙氧基)—乙氧基]一乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(l.lg存在的殘留溶劑)^NMR(400MHzCDC13)10.3(brs，1H)，8.2(s，1H),7.6(m，2H)，7.2(brs，1H)，3.9(t，2H)3.8-3,5(brm，14H)，3.3(brm，5H)，2.8(t,2H)，2.4(s，3H)，1.4(s，9H)。139步驟6:3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽。140將(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-曱磺?；?苯基)-4-曱基-噻唑-2-基氨基甲酰基]—乙氧基}一乙氧基)—乙氧基]一乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(l.0g1.5mmo1)溶于二氯甲烷(10ml)，并用HC1(4ml在二噁烷中的4M溶液)。反應(yīng)物在室溫下攪拌3小時。蒸發(fā)溶劑，真空干燥殘留物以產(chǎn)生黃色粘性油3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺鹽酸鹽(830mg存在殘留溶劑)^NMR(400MHzCDC13)8.4(brs，3H)，8.2(s，1H)，7.7(brd，1H)，7.6(brd，1H)3.9(brm，4H)，3.8-3.6(brm，12H)，3.3(s，3H)，3.3(brm，2H)，3.1(brm，2H)，2.6(s，3H).NMR質(zhì)鐠在Brukerdpx4Q0上獲得。141表l:使用的縮略語<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>苯基噻唑配體1在珠(親和基質(zhì))上的固定142用無水DMS0(二甲亞砜，F(xiàn)luka，41648，H20<=0.005%)平衡NHS-活化的Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,17-0906-01)。將1ml沉淀的珠置于15mlFalcon管，添加化合物原液(stocksolution)(通常在DMF或DMSO中100mM)(終濃度0.2-2jumol/ml珠)以及15pi三乙胺(Sigma,T-0886,99%純度)。將珠在室溫下在黑暗中在立式圓筒形振動篩(end-over-endshaker)(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上溫育16-20小時。通過HPLC確定偶聯(lián)效率。通過在室溫下在立式圓筒形振動篩上與氨基乙醇一起溫育過夜來封閉未反應(yīng)的NHS-基團。用10mlDMSO洗滌珠，并將其貯存在-20°C下的異丙醇中。將這些珠用作實施例2、3和4中的親和基質(zhì)。如上所述通過與氨基乙醇一起溫育封閉NHS-基團來產(chǎn)生對照珠(沒有固定的配體)。實施例2:使用固定的苯基噻唑配體1的PI3K的藥物下拉143該實施例示范固定的苯基噻唑配體1用于鑒定來自人類T細胞系(M0LT-4細胞；ATCC編號CRL-1582)的細胞裂解物的PI3K蛋白質(zhì)的用途。為此，使M0LT-4細胞的裂解物與實施例1中所述的親和基質(zhì)接觸。通過蛋白質(zhì)印跡和質(zhì)鐠(MS)分析鑒定結(jié)合至苯基瘞唑配體1的蛋白質(zhì)。144對于蛋白質(zhì)印跡分析，將結(jié)合蛋白從親和基質(zhì)中洗脫，隨后通過sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。用特異性抗體檢測PI3Ky和PI3K5(圖2)。蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果顯示固定的苯基漆唑配體1從細胞裂解物中捕獲(下拉)PI3Ky和PI3K5。145為了通過質(zhì)鐠分析鑒定蛋白質(zhì)，將親和基質(zhì)捕獲的蛋白質(zhì)洗脫，隨后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離(圖3)。將合適的凝膠帶切下，用胰蛋白酶進行凝膠內(nèi)蛋白水解消化，并通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析。146PI3K家族成員的鑒定在表3中證明。PI3KY的肽序列覆蓋(coverage)示于圖4，PI3K5的肽序列覆蓋示于圖5。1.細胞培養(yǎng)147使M0LT-4細胞(ATCC編號1582)在1升轉(zhuǎn)瓶(Spinnerflasks)(IntegraBiosciences,#182101)中懸浮于補充有10%胎牛血清(Invitrogen)的國I1640培養(yǎng)基(Invitrogen，#21875-034)中以0.15x106至1.2x10e6個細胞/ml的密度生長。通過離心收獲細胞，用1xPBS緩沖液(Invitrogen，#14190-094)洗滌一次，細胞團在液氮中冷凍，隨后在-80。C下貯存。2.細胞裂解物的制備148使M0LT-4細胞在PotterS勻漿器中在下述裂解緩沖液中勻漿50mMTris-HCl、0.8%NP40、5%甘油、150mMNaCl、1.5mMMgC12、25mMNaF、1mM釩酸鈉、1mMDTT、pH7.5。每25ml緩沖液加入一片完整的無EDTA片劑(蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)。使用機械化POTTERS將材料勻漿(dounced)lQ次，轉(zhuǎn)移至50mlFalcon管中，在水上溫育30分鐘，在4。C下以20，000g離心10分鐘(在SorvallSLA600中10，000rpm，預(yù)冷)。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心機(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)，并且在4°C下以100.000g離心1小時(在Ti50.2中33.500rpm，預(yù)冷)。再次將上清液轉(zhuǎn)移至新的50mlFalcon管中，通過Bradford測定(BioRad)確定蛋白質(zhì)濃度，并且制備每等分試樣包含50mg蛋白質(zhì)的樣品o立即將樣品用于實驗或在液氮中冷凍并在-80°C下貯存。3.化合物下拉實驗149將具有固定的化合物的瓊脂糖凝膠-珠(lOOjal珠每下拉實驗)在裂解緩沖液中平衡，并用包含50mg蛋白質(zhì)的細胞裂解物樣品在立式圓筒形振動篩(RotoShakeGenie,ScientificIndustriesInc.)上在4。C下溫育2小時。收集珠，將其轉(zhuǎn)移至Mobicol柱(MoBiTech10055)，并用10ml包含O.5%NP40洗滌劑的裂解緩沖液洗滌，隨后用5ml具有0.25%洗滌劑的裂解緩沖液洗滌。為了洗脫結(jié)合蛋白，加入60pi2xSDS樣品緩沖液，將柱在50°C下加熱30分鐘，將洗脫物通過離心轉(zhuǎn)移至微量離心管(microfugetube)。然后通過SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。4.通過蛋白質(zhì)印跡分析的蛋白質(zhì)檢測150根據(jù)標準方法進行蛋白質(zhì)印跡，通過使用特異性抗PI3K抗體(一抗)、熒光標記的二抗和來自LI-CORBiosciences(Lincoln,Nebraska,USA)的Odyssey紅外成像系統(tǒng)，根據(jù)由制造商提供的說明書檢測和定量PI3K蛋白質(zhì)(Schutz-Geschwendener等.，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.由LI-CORBiosciences于2004年5月公布，www.1icor.com)。151以1:200的稀釋比使用小鼠抗PI3Ky抗體(JenaBioscience,產(chǎn)品目錄號ABD-026S),并與印跡一起在4。C下溫育過夜。以1:15000的稀釋比使用第二抗-小鼠IRDye800抗體(Rockland,產(chǎn)品目錄號610-732-124)。將兔抗PI3K5(SantaCruz，產(chǎn)品目錄號sc-7176)稀釋1:600，并在4°C下溫育過夜。將抗兔IRDyeTM800抗體稀釋l:20000作為第二檢測抗體(LICOR，產(chǎn)品目錄號926-32211)。5.通過質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定5.1質(zhì)譜分析前的蛋白質(zhì)消化152基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68:850-858描述的方法將凝膠-分離的蛋白還原、烷基化并在凝膠中消化。簡要地說，使用干凈的手術(shù)刀將凝膠分離的蛋白從凝膠中切下，使用10mMDTT(在5mM碳酸氳銨中，54。C，45min)進行還原，隨后用55mM碘乙酰胺(在5mM碳酸氬銨中)在室溫下在黑暗中進行烷基化(30分鐘)。經(jīng)還原和烷基化的蛋白質(zhì)用豬胰蛋白酶(Promega)以12.5ng/pl的蛋白酶濃度(在5fflM碳酸氫銨中)在凝膠中消化。使消化在37°C下進行4小時，隨后使用5]Lil5%的甲酸終止反應(yīng)。5.2質(zhì)鐠分析之前的樣品制備153凝膠小塊樣本(Gelplugs)用20jtl1%TFA提取兩次，并與酸化的消化上清液混合。將樣品在真空離心機中干燥，并在10pl0.1%甲酸中重懸。5.3質(zhì)鐠數(shù)據(jù)的獲得154將肽樣品注入訓(xùn)oLC系統(tǒng)(CapLC，WatersorUltimate,Dionex)，所述nanoLC系統(tǒng)直接偶聯(lián)至四極桿TOF(QT0F2，QTOFUltima,QTOFMicro,Micromass)或離子阱(LCQDecaXP)質(zhì)諳。使用梯度水性和有機溶劑(參見下文)在LC系統(tǒng)上分離肽。溶劑A為在0.5%甲酸中的5%乙腈，溶劑B為在0.5%甲酸中的70%乙腈。155表2:在質(zhì)鐠中對LC系統(tǒng)洗脫出的肽部分地測序時間(分鐘)%溶劑A%溶劑B5.33旦21115.4蛋白質(zhì)鑒定156將在LC-MS/MS實驗中產(chǎn)生的肽質(zhì)量和片段數(shù)據(jù)用于查詢fasta格式的蛋白質(zhì)和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫在NCBI(對于NCBInr,dbEST以及人類和小鼠基因組)和EuropeanBioinformaticsInstitute(EBI，對于人類，小鼠，果錄(D.melanogaster)和線蟲(C.elegans)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫)進行維護并定期升級。使用軟件工具Mascot通過將測量的肽質(zhì)量和片段數(shù)據(jù)與從數(shù)據(jù)庫的實體中計算出的相同數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)來鑒定蛋白質(zhì)(MatrixScience;Perkins等，1999.Probability—basedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydata.Electrophoresis203551-3567)。檢索標準依賴于將哪一種質(zhì)鐠儀用于分析而變化。157表3:通過質(zhì)鐠鑒定的PI3K蛋白(M0LT-4細胞；實驗P15234B;MS樣品指從聚丙烯酰胺凝膠中切下的凝膠切片(圖3))<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例3用于鑒定PI3Ky相互作用化合物的洗脫測定158按照實施例1中所述制備苯基噻唑配體1親和基質(zhì)。為了最大限度地篩選在96孔板上的80種化合物，如下所述進行洗脫實驗。洗脫測定159用30mllxDP-緩沖液洗滌親和基質(zhì)(1200p1珠)2次。每一洗滌步驟之后，通過在Heraeus離心機中在4°C下以1200rpm離心2分鐘來收集珠。棄去上清液。最后，在15ml結(jié)合緩沖液(lxDP緩沖液/0.4。/。NP40)中平衡珠。此溫育時間之后，收獲珠，將其與M0LT-4細胞裂解物在50mlFalcon管中混合，所述M0LT-4細胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml，蛋白質(zhì)總量為75mg。如實施例2所述制備裂解物。在4°C下溫育珠和裂解物2小時。與裂解物一起溫育之后，如上所述通過離心收集珠，將其轉(zhuǎn)移至2ml柱(MoBiTec，IS10129)并用10mllxDP緩沖液/O.4%NP40和5mllxDP緩沖液/0.2°/。NP40洗滌。一旦洗滌緩沖液完全地流過柱，計算柱中剩下的珠的體積(大約1000jul)。將珠重懸于4倍過量的lxDP-緩沖液/0.2。/。NP40(4ml)中以產(chǎn)生20%漿料。對于化合物洗脫測試，將50m1此懸浮液加至96孔板(MilliporeMultiScreenHTS，MSBVN1210,具有蓋和1.2um親水性低蛋白結(jié)合Durapore膜)的每個孔中。為了除去殘留的緩沖液，將96孔板與Assemble過濾器和收集板組裝在一起，并將該三明治組件在離心才幾中以800rpm離心10秒。然后，將40ji1補充有測試化合物的洗脫緩沖液(1xDP-緩沖液/0.2%NP40)加至珠。測試化合物通過將它們稀釋于稀釋緩沖液中來制備，所述稀釋開始于40倍濃縮的在DMSO中的原液。將板組裝在收集板上，在Eppendorf孵化器上固定，在4。C下以650rpm的振動溫育30分鐘。為了收獲洗脫物，將組裝在96孔收集板上的96孔過濾板在4。C下在臺式離心機(Heraeus)中以800rpm離心1分鐘。通過使用斑點印跡方法就PI3KY和PI3K5的存在檢查洗脫物。洗脫的PI3Ky的檢測160寸吏用4十對PI3Kv的抗體(JenaBioscience,#ABD—026S)、熒光標記的第二抗小鼠IRDye800(Rockland,#610-732-124)和來自LI-CORBiosciences(Lincoln,Nebraska,USA)的Odyssey紅夕卜成像系統(tǒng)，根據(jù)由制造商提供的說明書，通過斑點印跡方法檢測和定量洗脫的PI3KY蛋白質(zhì)(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.由LI-C0RBiosciences于2004年5月公布，w而.1icor,com)。161用20%乙醇處理硝酸纖維素膜，隨后用1xPBS緩沖液洗滌。使洗脫物(如上所述)與12m14xSDS上樣緩沖液(200mMTris-HClpH6.8，8%SDS，40%甘油，0.04%溴酚藍)結(jié)合，并用BioRad斑點印跡設(shè)備(BioRad，#170-6545)將其施用至硝酸纖維素膜上。162為了檢測PI3Ky，首先通過與Odyssey封閉緩沖液溫育1小時來封閉膜。使封閉的膜與一抗(來自JenaBioscience,ABD-026S的小鼠抗PI3Ky)在4。C溫育16小時，所述一抗在補充有0.2。/。Tween20的Odyssey封閉緩沖液中稀釋1:100。用包含0.1%Tween20的1xPBS緩沖液洗滌膜4次(每次5分鐘)之后，將膜與檢測抗體(來自Rockland的抗小鼠IRDye800，610-732-124)溫育40分鐘，所述檢測抗體在補充有0.2%Tween20的Odyssey封閉緩沖液中稀釋1:10000。然后，用1xPBS緩沖液/0.1%Tween20洗滌膜4次(每次5分鐘)并用lxPBS緩沖液洗滌l次，進行5分鐘。然后，用Odyssey閱讀器掃描該膜，并分析數(shù)據(jù)。163表5:5x-DP緩沖液的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>164將5x-DP緩沖液通過0.22pm過濾器過濾并以40ml等分試樣貯存-80。C下。這些溶液獲自以下供應(yīng)商1.0MTris/HClpH7.5(Sigma,T-2663)，87%甘油(Merck，產(chǎn)品目錄號04091.2500);1.0MMgCl2(Sigma，M-1028);5，0MNaCl(Sigma，S-5150)。用于洗脫的測試化合物165如下所述稀釋之后，將下文列出的測試化合物用于洗脫實驗。典型地，將所有化合物以100mM或50mM的濃度溶于100%DMSO(Fluka產(chǎn)品目錄號41647)。將化合物貯存在-20°C下。用于洗脫實驗的測試化合物的稀釋通過用100%DMSO將100mM原液按1:1稀釋來制備50mM原液。為了洗脫實驗，進一步用洗脫緩沖液(lxDP-緩沖液/0.2。/。NP40)稀釋該化合物。用于洗脫的化合物化合物1:PI3K抑制劑LY29004(Tocris1130;Vlahos等，1994，J.Biol.Chem.269，5241-5248)?；衔?:PI3KY抑制劑(Calbiochem528106;AS-605240;Camps等，2005，NatureMedicine11，936-943)。化合物3:PI3KY抑制劑II(Calbiochem528108;AS-604850;Camps等，2005，NatureMedicine11，936-943)。實施例4:用于鑒定PI3KY相互作用化合物的竟爭結(jié)合測定166該實施例示范其中將測試化合物直接加入細胞裂解物的竟爭結(jié)合測定。將測試化合物(以不同的濃度)和具有固定的苯基噻唑配體1的親和基質(zhì)加至裂解物等分試樣，并允許其結(jié)合至包含于裂解物樣品中的蛋白質(zhì)。溫育時間之后，將具有捕獲的蛋白質(zhì)的珠從裂解物中分離。然后洗脫結(jié)合蛋白，通過在斑點印跡法中使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統(tǒng)檢測和定量PI3Ky的存在(圖7A)。產(chǎn)生三種化合物的劑量反應(yīng)曲線(圖7B)。親和基質(zhì)的洗滌167用15ml包含0.4%NP40的lxDP緩沖液將如實施例1中所述的親和基質(zhì)(干體積1.1ml)洗滌兩次，然后將其重懸于5.5ml包含0.4%NP40的lxDP緩沖液(20%珠漿料)。測試化合物的制備168按照與最終所需測試濃度相比100倍更高濃度，在DMSO中制備測試化合物的原液(例如對于4jLiM的最終測試濃度，制備4mM原液)。該稀釋方案導(dǎo)致1°/。的最終DMS0濃度。對于對照實驗(無測試化合物)，使用包含1%DMS0的緩沖液以便所有的測試樣品包含1%DMS0?；衔?:PI3K抑制劑LY29004(Tocris1130;Vlahos等，1994，J.Biol.Chem.269，5241-5248)。化合物3:PI3Ky抑制劑II(Calbiochem528108;AS-604850;Camps等，2005，NatureMedicine11，936-943)。化合物4(CZC00015387)。細胞裂解物的稀釋169如實施例2所述制備細胞裂解物。對于典型的實驗，使包含50mg蛋白質(zhì)的1裂解物等分試樣在37°C水浴中解凍，然后保持在4。C下。向裂解物加入l體積的lxDP緩沖液以便達到0.4。/。的最終NP40濃度。然后，加入1/50最終體積的50倍濃縮的蛋白酶抑制劑溶液(1片蛋白酶抑制劑溶于0.5ml包含0.4%NP40的lxDP援沖液；無EDTA片劑蛋白酶抑制劑混合物來自RocheDiagnostics,產(chǎn)品目錄號41647)。通過添加包含O.4%NP40的lxDP緩沖液進一步稀釋裂解物以便達到5mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。用測試化合物和親和基質(zhì)溫育裂解物170將100pl體積的稀釋的裂解物分配到96孔過濾板的各孔中。然后加入l.5nl在DMSO中稀釋的測試化合物。對于對照反應(yīng)，使用1.5|u1無測試化合物的DMSO。然后，每孔加入50ja1親和基質(zhì)(20%漿料)。將板在振蕩器上(在Therraomixer，Eppendorf上750rpm)在4。C下溫育2小時。171使用真空歧管儀(Millipore，MAVM096OR)洗滌板。各孔用400|il包含0.4%NP-40的lxDP緩沖液洗滌4次和用400ja1包含0.2%NP-40的lxDP緩沖液洗滌2次。為了洗脫，將過濾板置于收集板上，向各孔加入40pl具有DTT(50mM終濃度)的2x樣品緩沖液(100mMTrisHCl，pH6.8;4%SDS;20%甘油；0.02。/。溴酚藍)。將板在振蕩器上(在Thermomixer，Eppendorf上750rpm)在室溫下溫育30分鐘。隨后，以1100rpm(Heraeus離心機)將板離心2分鐘，在收集板的孔中收集洗脫物。洗脫的PI3Ky的檢測和定量172使用針對PI3Ky的一抗(來自JenaBioscience的抗PI3KY，ABD-026S)和熒光標記的二抗(抗-小鼠IRDye800，來自Rockland,610-732-124)，通過斑點印跡法檢測和定量在洗脫物中的PI3KY蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商提供的說明書運行來自LI-C0RBiosciences的Odyssey紅夕卜成像系統(tǒng)(Lincoln,Nebraska,USA)(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.由LI-CORBiosciences于2004年5月公布，www.1icor.com)。173根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用斑點印跡設(shè)備(Bio-Dotmicrofiltrationapparatus,BioRad170-65)。硝酸纖維素膜(BioTraceNTNitrocellulose,PALLBTNT30R)用20%乙醇進行處理，隨后用PBS緩沖液洗滌。每斑點施用30ju1洗脫物樣品，并在使用真空泵之前靜置30分鐘。174為了檢測pi3ky,首先通過與Odyssey封閉緩沖液(lic0r，927-40000)—起在室溫下溫育1小時來封閉膜。然后使封閉的膜與一抗(來自JenaBioscience的抗PI3Ky，ABD-026S)—起在4。C下溫育16小時，所述一抗在包含0.2%Tween-20的Odyssey封閉緩沖液中進行稀釋。在用包含0.1%Tween20的PBS緩沖液洗滌該膜4次(每次5分鐘)之后，將膜與檢測抗體(來自Rockland的抗-小鼠IRDye800，610-732-124)—起溫育40分鐘，所述檢測抗體在包含0.2%Tween-20的0dyssey封閉緩沖液中進行稀釋。其后，將膜每次用1xPBS緩沖液/0.1%Tween20洗滌4次(每次5分鐘)，并用1xPBS緩沖液洗滌1次(5分鐘)。將膜保持在4。C下PBS緩沖液中，然后用Odyssey儀掃描，根據(jù)制造商的說明書記錄和分析信號。實施例5:通過將化合物加至細胞裂解物或活細胞分析pi3k5相互作用化合物的化合物圖鐠175該實施例示范其中將測試化合物直接加入細胞裂解物或與活細胞(RAW264.7巨噬細胞)一起溫育的結(jié)合測定。176對于細胞裂解物竟爭結(jié)合測定，將化合物加至裂解物樣品，允許其結(jié)合至包含于裂解物樣品中的蛋白質(zhì)。然后，加入包含固定的苯基瘞唑配體的親和基質(zhì)以捕獲未結(jié)合至測試化合物的蛋白質(zhì)。溫育時間之后，通過離心從裂解物中分離具有捕獲的蛋白質(zhì)的珠。然后洗脫珠-結(jié)合蛋白，使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統(tǒng)檢測和定量PI3K5蛋白質(zhì)的存在。177對于細胞內(nèi)圖鐠分析實驗，將活RAW264.7巨噬細胞的等分試樣首先與化合物一起在細胞培養(yǎng)基中溫育30分鐘。此溫育時間期間，化合物能夠進入細胞并結(jié)合至細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)靶點。然后，收獲細胞，制備細胞裂解物，加入親和基質(zhì)以捕獲未結(jié)合至測試化合物的蛋白質(zhì)。細胞裂解物與親和基質(zhì)一起溫育90分鐘后，通過離心從裂解物中分離具有捕獲的蛋白質(zhì)的珠。然后洗脫結(jié)合蛋白，使用特異性抗體和Odyssey紅外檢測系統(tǒng)檢測和定量PI3K5的存在。178對于細胞-通透的參照化合物PI-103，兩種方法產(chǎn)生類似的結(jié)果(圖8)。在裂解物測定中兩種其它化合物(化合物5和6)與PI3K5相互作用，但在細胞測定中不顯著。對于此差異可能的原因是后兩種化合物不是充分細胞通透的。細胞培養(yǎng)179在存在5%C02的加濕的大氣中在37。C下，在補充有10%熱滅活胎牛血清(Gibco#10270)和1.5g/L碳酸氬鈉(Gibco#25080，7.5%溶液)的Dulbecco'smodifiedEagle's培養(yǎng)基(醒M，4mML-谷氨酰胺，4.5g/L葡萄糖；Gibco#41965)中，培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD)。通過使用細胞刮(cellscraper)在DMEM培養(yǎng)基中從培養(yǎng)皿中刮取細胞，并將其再涂布(replating)在新鮮培養(yǎng)基中來亞培養(yǎng)巨噬細胞。傳代數(shù)達到3之后，將RAW264.7巨噬細胞用于實驗。用磷酸鹽緩沖的鹽水(D-PBS，Gibco#14040)洗滌細胞一次，在DMEM培養(yǎng)基中將其從培養(yǎng)皿中除下，并在室溫下以1，000rpm離心3分鐘。將細胞團重懸于DMEM培養(yǎng)基中，確定細胞數(shù)。將25x106個細胞涂布至一個10cm培養(yǎng)皿上，在新鮮DMEM培養(yǎng)基中溫育48小時，直到它們達到大約90%匯合(confluence)。A)活細胞中的化合物圖i普分析用測試化合物處理細胞180用D-PBS緩沖液洗滌巨噬細胞，并添加新鮮DMEM培養(yǎng)基。用包含O.2%DMS0的DMEM培養(yǎng)基(媒介對照(vehiclecontrol))或具有10pMPI-103(Calbiochem，產(chǎn)品目錄號528100;Knight等，2006，Cell125，733-747)、10juM化合物5或10juM化合物6的DMEM培養(yǎng)基處理細胞30分鐘。將測試化合物制備成DMSO中的20mM原液，并進一步稀釋以達到在細胞培養(yǎng)基中10pM化合物和0.2%DMSO的終濃度。細胞裂解物的制備181除去培養(yǎng)基，用D-PBS緩沖液洗滌細胞一次，添加4ml水冷的D-PBS緩沖液。通過輕輕地刮取細胞將巨噬細胞除下，并將其重懸于D-PBS緩沖液中。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移入15mlFalcon管并保持在冰上。在HeraeusMultifuge中在4°C下以1500rpm離心巨嗜細胞懸浮液3分鐘。棄去上清液，用冷D-PBS緩沖液洗涂細胞團。另外的離心步驟之后，在液氮中快速地冷凍細胞團。將細胞在水上解凍，并通過添加120nillx裂解緩沖液(lxDP緩沖液，0.8。/。NP40)進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移入1.5mlEppendorf管，在4。C下旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘，然后在4。C下以13,200rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移入超速離心管，在4°C下以53，000rpm(lOO，000xg)在TLA-120.2轉(zhuǎn)子中離心1小時。通過進行Bradford測定將澄清上清液的等分試樣用于蛋白質(zhì)定量(Biorad蛋白質(zhì)測定染料濃縮物，產(chǎn)品目錄號500-0006)。剩余的樣品在液氮中迅速地冷凍并貯存于-80°C下直到用于結(jié)合測定。細胞裂解物的稀釋182如下所述從RAW264.7巨噬細胞制備細胞裂解物。將一份裂解物等分試樣在37。C水浴中解凍，然后保持在4。C下。向裂解物加入1體積包含蛋白酶抑制劑的lxDP緩沖液(l片劑的蛋白酶抑制劑溶于25mllxDP緩沖液或25ml包含0.8%NP40的lxDP緩沖液；無EDTA片劑蛋白酶抑制劑混合物，來自RocheDiagnostics,產(chǎn)品目錄號41647)，以便達到0.8%的最終NP4Q濃度。通過添加包含0.8%NP40和蛋白酶抑制劑的lxDP緩沖液進一步稀釋裂解物，以便達到10mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。親和基質(zhì)的洗滌183將如實施例1中所述的親和基質(zhì)(O.25ml干珠體積)用10ml包含0.2%NP40的lxDP緩沖液洗滌兩次，并最后重懸于5.0ml包含0.2%NP40的lxDP緩沖液中(5%珠漿料)。細胞裂解物與親和基質(zhì)一起溫育184將50ju1體積的稀釋的裂解物(IOmg/ml蛋白質(zhì))分配到96孔過濾板的各孔。然后，每孔添加IOO|i1親和基質(zhì)(5%漿料)。將板在振蕩器(750rpm，在The函mixer,Eppendorf上)上在4°C下溫育2小時。使用真空歧管儀(Millipore，MAVM0960R)洗滌板。各孔用220p1包含0.4%NP-40的lxDP緩沖液洗滌兩次。對于蛋白質(zhì)的洗脫，將過濾板置于收集板上，向各孔添加20ju1具有DTT(50mM終濃度)的2x樣品緩沖液(IOOmMTrisHCl，pH7.4;4%SDS;20%甘油；0.0002°/。溴酚藍)。將板在振蕩器(750rpm,在Thermomixer，Eppendorf上)上在室溫下溫育30分鐘。隨后，以1100rpm(Heraeus離心機)將板離心4分鐘，在收集板的孔中收集洗脫物。PI3K5的檢測和定量185通過在硝酸纖維素膜上點樣(spotting)等分試樣和用針對PI3K5的一抗以及熒光標記的二抗來檢測和定量洗脫物中的PI3K5蛋白質(zhì)。將硝酸纖維素膜(BioTraceNTNitrocellulose,PALLBTNT30R)用20°/。乙醇預(yù)處理，隨后用PBS緩沖液洗滌。186為了檢測PI3K5，首先通過與Odyssey封閉緩沖液(LICOR,927-40000)—起在室溫下溫育1小時來封閉膜。然后將封閉的膜與一抗(抗PI3K5，兔多克隆抗體，來自SantaCruz，產(chǎn)品目錄號sc-7176)一起在4。C下溫育16小時，所述一抗在包含0.2%Tween-20的Odyssey封閉緩沖液中稀釋1:800。將膜用包含0.1%Tween20的PBS緩沖液洗滌4次(每次7分鐘)之后，使膜與檢測抗體(山羊抗-兔IRDye800CW,來自LICOR，產(chǎn)品目錄號926-32211)—起溫育60分鐘，所迷檢測抗體在包含0.2%Tween-20和0.02%SDS的Odyssey封閉緩沖液中稀釋1:2500。其后，將膜用lxPBS緩沖液/0.1%Tween20洗滌4次(每次5分鐘)，并用1xPBS緩沖液洗滌1次(5分鐘)。將膜保持在4。C下PBS緩沖液中，然后用Odyssey儀掃描，根據(jù)制造商的說明書記錄和分析信號。根據(jù)制造商提供的說明書運行來自U-CORBiosciences(Lincoln,Nebraska,USA)的Odyssey紅夕卜成像系統(tǒng)(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative,two-colorWesternblotdetectionwithinfraredfluorescence.LI-CORBiosciences于2004年5月公布，www.1icor.com)。B)細胞裂解物中的化合物圖鐠分析(Compoundprofiling)細胞裂解物的制備187除去培養(yǎng)基，用D-PBS緩沖液洗滌細胞1次，添加4ml冰冷的D-PBS緩沖液。通過輕輕地的刮取細胞將巨噬細胞除下，并重懸于D-PBS緩沖液中。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移入15mlFalcon管并保持在冰上。在HeraeusMultifuge中在4。C下以1500rpm離心巨嗟細胞懸浮液3分鐘。除去上清液，用冷D-PBS緩沖液洗滌細胞團。另一離心步驟之后，將細胞團快速地在液氮中冷凍。將細胞在水上解凍，并通過添加120n1lx裂解緩沖液(1xDP緩沖液，0.8%NP40)進行裂解。將裂解物轉(zhuǎn)移入1.5mlEppendorf管，在4。C下旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘，然后在4。C下以13，200rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移入超速離心管，并在4°C下以53,000rpm(100，000xg)在TLA-120.2轉(zhuǎn)子中離心1小時。通過進行Bradford測定將澄清上清液的等分試樣用于蛋白質(zhì)定量(Biorad蛋白質(zhì)測定染料濃縮物，產(chǎn)品目錄號500-0006)。剩余的樣品快速地在液氮中冷凍，并貯存在-80。C下直到用于結(jié)合測定。細胞裂解物的稀釋188如下所迷從RAW264.7巨噬細胞制備細胞裂解物。將一份裂解物等分試樣在37。C水浴中解凍，然后保持在4。C下。向裂解物加入1體積包含蛋白酶抑制劑的lxDP緩沖液(l片劑的蛋白酶抑制劑溶于25mllxDP緩沖液或25ml包含0.8%NP40的lxDP緩沖液；無EDTA片劑蛋白酶抑制劑混合物，來自RocheDiagnostics,產(chǎn)品目錄號41647)，以便達到0.8°/。的最終NP40濃度。通過添加包含0.8%NP40和蛋白酶抑制劑的lxDP緩沖液進一步稀釋裂解物，以便達到10mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。親和基質(zhì)的洗滌189將如實施例l中所述的親和基質(zhì)(O.25ml干珠體積)用10ml包含0.2%NP40的lxDP緩沖液洗滌兩次，并最后重懸于5.0ml包含0.2%NP40的lxDP緩沖液中(5%珠漿料)。測試化合物的制備190對于裂解物竟爭實驗，按照與測定中的終濃度相比50倍更高濃度，在DMSO中制備測試化合物的原液(例如對于10pM的最終測試濃度，制備50QpM原液)。該稀釋方案導(dǎo)致測定中2。/。的最終DMS0濃度。對于對照實驗(無測試化合物)，使用包含2%DMSO的緩沖液以便所有的測試樣品包含2%DMSO。用測試化合物和親和基質(zhì)溫育細胞裂解物191將50jal體積的稀釋的裂解物(lOmg/ml蛋白質(zhì))分配到96孔過濾板的各孔。然后，添加3.0ji1在DMSO中稀釋的測試化合物。對于對照反應(yīng)，使用3.0p1無測試化合物的DMSO。然后，每孔添加100p1親和基質(zhì)(5°/。漿料)。將板在振蕩器(750rpm,在ThermomixerEppendorf上)上在4。C下溫育2小時。使用真空歧管儀(Mi11ipore，MAVM0960R)洗滌板。各孔用220y1包含0.4%NP-40的lxDP緩沖液洗滌兩次。對于蛋白質(zhì)的洗脫，將過濾板置于收集板上，向各孔添加20jil具有DTT(50mM終濃度)的2x樣品緩沖液(100mMTrisHClpH7.4;4%SDS;20%甘油;0.0002%溴酚藍)。將板在振蕩器(750rpm，在Thermomixer,Eppendorf上)上在室溫下溫育30分鐘。隨后，以1100rpm(Heraeus離心機)將板離心4分鐘，在收集板的孔中收集洗脫物。192如上所述進行PI3K5的檢測和定量。權(quán)利要求1.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)使苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定所述化合物是否能夠從固定的苯基噻唑配體1中分離PI3K。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟d)包括檢測分離的PI3K或確定分離的PI3K的量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中通過質(zhì)譜或免疫檢測方法，優(yōu)選用針對PI3K的抗體來檢測分離的PI3K或確定分離的PI3K的量。4.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，和c)檢測在步驟b)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在步驟c)中所述的檢測通過確定苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的量來進行。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項所述的方法，其中用幾種蛋白質(zhì)制劑進行步驟a)至c)以測試不同的化合物。7.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的兩份等分試樣，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使另一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1以及給定的化合物d)確定在步驟b)和c)中形成的苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的量。8.用于鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供各自包含至少一種含有PI3K的細胞的兩份等分試樣，b)使一份等分試樣與給定的化合物一起溫育，c)收獲各等分試樣的細胞，d)裂解所述細胞以獲得蛋白質(zhì)制劑，e)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸，和f)確定在步驟e)中在各等分試樣中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中任一項所述的方法，其中與未與所述化合物一起溫育的等分試樣相比，與所述化合物一起溫育的等分試樣中形成的苯基瘞唑配體l-PI3K復(fù)合物的減少的量表明PI3K為所述化合物的靶點。10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項所述的方法，其中苯基蓉唑配體1-PI3K復(fù)合物的量通過以下步驟確定從固定的苯基嚷唑配體1中分離PI3K，隨后檢測分離的PI3K或隨后確定分離的PI3K的量。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中通過質(zhì)語或免疫檢測方法，優(yōu)選用針對PI3K的抗體檢測PI3K或確定PI3K的量。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，以中或高通量篩選的方式進行。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述的化合物選自合成化合物，或有機合成藥物，更優(yōu)選小分子有機藥物，和天然小分子化合物。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中PI3K相互作用化合物為PI3K抑制劑。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述固體支持物選自瓊脂糖、改性的瓊脂糖、瓊脂糖凝膠珠(例如NHS-活化的瓊脂糖凝膠)、膠乳、纖維素和亞鐵-或鐵磁性顆粒。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述苯基噻唑配體1共價地偶聯(lián)到所述固體支持物。17.用于制備藥物組合物的方法，其包括以下步驟a)根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項鑒定PI3K相互作用化合物，和b)將所述相互作用化合物配制成藥物組合物。18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述PI3K為PI3Ky和/或PI3K5。19.用于純化PI3K的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體l接觸，和c)從固定的苯基噻唑配體1中分離PI3K。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其進一步包括純化PI3Kv和/或PI3K5的步驟。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中使用PI3KY特異性抗體和/或PI3K5特異性抗體來進行所述純化。22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項所述的方法，其進一步包括在步驟c)之后鑒定能夠結(jié)合PI3K的蛋白質(zhì)。23.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項所述的方法，其進一步包括在步驟c)之后確定PI3K的翻譯后修飾。24.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項所述的方法，其中在步驟c)之后通過質(zhì)i普或免疫檢測方法表征PI3K和/或能夠結(jié)合PI3K的蛋白質(zhì)。25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法，其中提供蛋白質(zhì)制劑包括以下步驟收獲至少一種包含PI3K的細胞和裂解所述細胞。26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中形成苯基噻唑配體l-PI3K復(fù)合物的步驟在基本上生理條件下進行。27.苯基噻唑配體1在鑒定PI3K相互作用化合物中的用途。28.苯基噻唑配體1在純化PI3K中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)使苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物與給定的化合物一起溫育，和d)確定所述化合物是否能夠從固定的苯基噻唑配體1中分離PI3K。此外，本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑，b)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，和c)檢測在步驟b)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物。此外，本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供包含PI3K的蛋白質(zhì)制劑的兩份等分試樣，b)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，c)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使另一份等分試樣與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1以及給定的化合物接觸，d)確定在步驟b)和c)中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。此外，本發(fā)明涉及鑒定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步驟a)提供各自包含至少一種含有PI3K的細胞的兩份等分試樣，b)使一份等分試樣與給定的化合物一起溫育，c)收獲各等分試樣的細胞，d)裂解所述細胞以獲得蛋白質(zhì)制劑，e)在允許形成苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的條件下，使所述蛋白質(zhì)制劑與固定在固體支持物上的苯基噻唑配體1接觸，和f)確定在步驟e)中在各等分試樣中形成的苯基噻唑配體1-PI3K復(fù)合物的量。文檔編號G01N33/573GK101563612SQ200780034446公開日2009年10月21日申請日期2007年8月3日優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日發(fā)明者A·坎斯菲爾德,G·博加米尼摩爾,G·紐鮑爾,N·拉姆斯登申請人:塞爾卓姆股份公司