專利名稱：相互作用檢測方法、生物測定裝置以及用于生物測定的基板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測相互作用的方法、生物測定裝置以及用于生物測定的基板，尤其是適用于生物信息學(xué)(生命信息科學(xué))領(lǐng)域的那些。
本申請要求以于2002年10月4日在日本申請的日本專利申請2002-292861為優(yōu)先權(quán)，其作為參考應(yīng)用于本申請。
背景技術(shù)：
用于生物測定的、被稱作DNA芯片或DNA微陣列(下文統(tǒng)稱DNA芯片)的集成電路基板，通過微陣列技術(shù)精密排布指定的DNA，這種基板現(xiàn)在用于基因突變和SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析、基因表達(dá)頻率分析等。集成電路基板已經(jīng)在包括藥物開發(fā)、臨床診斷、藥物基因?qū)W、法醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多種領(lǐng)域以及其它領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
在DNA芯片中，玻璃基板或硅基板上集成了多種眾多DNA寡核苷酸鏈、cDNA(互補(bǔ)DNA)等，因此，DNA芯片的特征在于有可能全面分析(inclusive analysis)分子間相互作用如雜交作用。
下面簡述一例DNA芯片分析方法。向玻璃基板或硅基板上的固相DNA探針中摻入熒光探針dNTP，從細(xì)胞、組織等提取的mRNA(信使RNA)可以用該熒光探針dNTP經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng))等進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在所述基板上進(jìn)行雜交，用指定的檢測器進(jìn)行熒光測定。
這里所述DNA芯片可以分為兩類。第一類通過光蝕刻技術(shù)在指定基板上直接合成寡核苷酸，所述光蝕刻技術(shù)利用了半導(dǎo)體曝光技術(shù)。AffymetrixCo.，Ltd.生產(chǎn)的DNA芯片為這一類的代表。第一類DNA芯片在，例如，特表平4-505763中記載。
第二類也稱“Stanford方式”，它用開口銷(split pin)將預(yù)制的DNA分注到基板上并使其固相化，由此形成芯片。第二類DNA芯片的集成度比第一類DNA芯片的低，第二類DNA芯片有利于約1kb DNA片斷的固相化。第二類DNA芯片在，例如，特表平10-503841中記載。
在國際公開第01/33226號中，根據(jù)與上述常規(guī)DNA芯片技術(shù)不同的技術(shù)觀點提出了懸臂傳感器技術(shù)(cantilever sensor technique)，其中，采用了由MEMS(Micro Electro Mechanical Systemmicro-machine)制成的懸臂。
下面簡述了一例用國際公開第01/33226號中所述懸臂傳感器進(jìn)行分析的方法。將上表面具有固相DNA探針的懸臂用激光光束照射。雜交反應(yīng)使懸臂彎曲，由此可以測定受光部指定位置的反射光強(qiáng)度變化，從而檢測是否發(fā)生雜交反應(yīng)。
然而，上述常規(guī)DNA芯片技術(shù)，是在二維基板的狹窄檢測部分使DNA探針等的測試核苷酸鏈或蛋白質(zhì)等固相化(被固定)，以便加速雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)等物質(zhì)間相互作用的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物的空間自由度因此受到限制，并且有可能在反應(yīng)中發(fā)生空間位阻。因此，常規(guī)DNA芯片技術(shù)等存在相互作用效率極低和反應(yīng)時間加長的問題。
而且，在常規(guī)DNA芯片技術(shù)中，樣品溶液只滴在基板上的指定斑點部位(spot part)(檢測部位)，無法確定樣品溶液中所含的目標(biāo)物質(zhì)相對于固定在斑點部位的檢出物質(zhì)而言的相對位置。
另一方面，在上述懸臂傳感器技術(shù)中，樣品溶液中所含的目標(biāo)物質(zhì)不需要事先用熒光標(biāo)記。然而，在懸臂被高度集成的情況中，當(dāng)懸臂表面用激光光束照射時，存在對反射光的接收很難進(jìn)行機(jī)械控制的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在常見情況的基礎(chǔ)上提出的，本發(fā)明的一個目的在于提供相互作用檢測方法、生物測定裝置和用于生物測定的基板，它們無需對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，就可以高效定量檢測雜交作用和物質(zhì)間的其它相互作用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的相互作用檢測方法和生物測定裝置可以測定檢測部位的物質(zhì)間相互作用。檢測部位包括至少一個懸臂，其至少一個部位經(jīng)表面處理可以固定測試物質(zhì)，檢測部位還包括為固定在表面處理部位的測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用提供場所的反應(yīng)區(qū)，用于振動并激發(fā)所述懸臂的驅(qū)動源，以及用于檢測懸臂振動幅度的振動檢測部件。在相互作用檢測方法和生物測定裝置中，通過測定懸臂固有振動頻率基于該相互作用而發(fā)生的變化來檢測該相互作用。
這里所述懸臂配有振動器，它在對向電極(counter electrode)之間設(shè)置壓電材料，所述驅(qū)動源通過在對向電極之間施加交流電壓而振動和激發(fā)懸臂。
而且，所述測試物質(zhì)和所述目標(biāo)物質(zhì)是，例如，核苷酸鏈，所述相互作用是雜交作用。
在相互作用檢測方法和生物測定裝置中，測試物質(zhì)被固定到懸臂上，所述懸臂有至少一部分經(jīng)表面處理可以固定所述測試物質(zhì)。通過測定所述測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)的相互作用所引起的懸臂固有振動頻率的變化來檢測所述相互作用。
例如，在所述測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)為核苷酸鏈的情況中，當(dāng)固定到懸臂端面的測試核苷酸鏈與目標(biāo)核苷酸鏈雜交時，懸臂的質(zhì)量增加，導(dǎo)致懸臂的固有振動頻率降低。相應(yīng)地，在本發(fā)明的相互作用檢測方法和生物測定裝置中，可以通過測定固有振動頻率的變化來檢測雜交作用。
此外，為實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的用于生物測定的基板設(shè)有檢測部位，其包括至少一個懸臂，該懸臂的至少一部分經(jīng)表面處理可以固定所述測試物質(zhì)，本發(fā)明的基板還包括反應(yīng)區(qū)，它為固定在表面處理部位的測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用提供場所。
這里所述檢測部位可以被制成池檢測部位(cell detecting part)，其中的懸臂從壁表面伸出，而所述基板上可以設(shè)置多個池檢測部位。在根據(jù)本發(fā)明的用于生物測定的基板中，基板可以為盤狀基板。在這種情況中，從上方觀察，池檢測部位呈放射狀。
當(dāng)用于生物測定的基板形成盤狀基板時，可以將所述反應(yīng)區(qū)設(shè)置在基板上放射狀延伸的條狀溝槽(line groove)中。在這種情況中，所述懸臂從條狀溝槽一側(cè)突出。
此外，所述池檢測部位或條狀溝槽的單位，或者成組的多個池檢測部位或條狀溝槽的單位，可以分別固定不同的測試物質(zhì)。
而且，所述反應(yīng)區(qū)可以填充能在室溫和適宜反應(yīng)溫度之間產(chǎn)生凝膠和溶膠的可逆相變的物質(zhì)。
在用于生物測定的基板中，通過測定所述懸臂的固有振動頻率基于所述相互作用而發(fā)生的變化來檢測該相互作用。
本發(fā)明的其它目的和具體優(yōu)勢可以參見下述實施例。


圖1是一實施例中生物測定裝置所用的用于生物測定的基板的外觀斜視圖。
圖2是用于生物測定的基板上多個池檢測部位中一個的放大斜視圖。
圖3是從池檢測部位反應(yīng)區(qū)一側(cè)突出的懸臂的放大斜視圖。
圖4A-4D說明一例懸臂制作過程。
圖5是檢測懸臂固有振動頻率變化的方法。
圖6是交流電源的頻率改變時所測的電壓波形。
圖7是另一種結(jié)構(gòu)的懸臂的斜視圖。
圖8是懸臂在含有壓電元件的位置的垂直橫截面。
圖9A和9B說明生物測定裝置中使用的另一例基板。圖9A是從上方觀察到的基板的平面圖。圖9B是圖9A中X部分的放大的平面圖。
實施本發(fā)明的最佳模式下文參照附圖詳細(xì)描述應(yīng)用本發(fā)明的具體實施例。在該實施例描述的生物測定裝置及其相互作用檢測方法中，測試核苷酸鏈(測試物質(zhì))的末端部位事先被固定到懸臂的端面上，所述懸臂具有振動器，該振動器由設(shè)置在對向電極之間的壓電材料組成。測試核苷酸鏈和目標(biāo)核苷酸鏈(目標(biāo)物質(zhì))的雜交反應(yīng)引起質(zhì)量變化，這導(dǎo)致懸臂的固有振動頻率變化，該變化可以用于定量檢測雜交反應(yīng)。
本文中“核苷酸鏈”是指核苷酸磷酸酯的聚合物，其中，嘌呤堿基或嘧啶堿基與糖合通過糖苷鍵相連。核苷酸鏈廣義上包括含有DNA探針的寡核苷酸、多核苷酸、具有與嘧啶核苷酸聚合的嘌呤核苷酸的DNA(全長或其片斷)、反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA(cDNA探針)、RNA等。
首先，圖1顯示本實施例的生物測定裝置中所用的生物測定基板1(下文簡稱基板)的外觀斜視圖。圖1所示的基板1由光學(xué)信息記錄介質(zhì)中所用的盤狀基板所采用的基板材料形成，所述光學(xué)信息記錄介質(zhì)諸如CD(ComPact Disk)、DVD(Digital Versatile Disk)、MD(Mini Disk)(注冊商標(biāo))。
基板材料是由石英玻璃、硅或者可模壓為盤狀的合成樹脂如聚碳酸酯、聚苯乙烯等制成盤狀，優(yōu)選由可注模(injection-modable)的合成樹脂制成。本實施例使用了一種廉價的合成樹脂基板，以便可以以低于常規(guī)玻璃基板的成本來獲得基板。在基板1的中央可以形成孔(圖中未示出)，用于固定旋轉(zhuǎn)基板所用的軸(spindle)。
基板1的一個表面上設(shè)置多個池檢測部位2，它們具有與基板周邊區(qū)域分隔的小室狀反應(yīng)區(qū)，導(dǎo)致從上方觀察，是從基板1中心的周邊區(qū)域呈放射狀延伸。
池檢測部位2可以設(shè)置在基板1上的適當(dāng)位置。然而，如上所述，從上方觀察，池檢測部位2設(shè)置為放射狀。因此，基板1上具有可以有效用于提高信息集成密度的空間。
此外，池檢測部位2被分開而不會相互污染。因此，可以在池檢測部位單位或成組的池檢測部位單位中固定不同的測試核苷酸鏈，并將這些鏈隔開，還可以為每一測試核苷酸鏈設(shè)定獨立的條件以加速雜交反應(yīng)。
例如，可以將表示疾病出現(xiàn)的標(biāo)記基因分組并固定在基板1上。相應(yīng)地，使用一種基板以便可以同時識別多種出現(xiàn)病變的狀況。
而且，可以將需要固定的測試核苷酸鏈根據(jù)Tm(解鏈溫度)或GC含有率的不同而分組。因此，可以根據(jù)測試核苷酸鏈的性質(zhì)而精細(xì)選擇可獲得活躍雜交反應(yīng)的緩沖液的組成、濃度等反應(yīng)條件、清洗條件、所滴加的樣品溶液的濃度等。因此，分析過程中假陽性或假陰性的風(fēng)險降低了。
圖2顯示了一個放大的池檢測部位2的外觀斜視圖。如圖2所示，池檢測部位2包括反應(yīng)區(qū)10，陰極(cathode)11和陽極(anode)12，以及懸臂(cantilever)13，反應(yīng)區(qū)10可以作為測試核苷酸鏈D和目標(biāo)核苷酸鏈T之間雜交反應(yīng)的場所，陰極11和陽極12用于在反應(yīng)區(qū)10的兩端形成電場，懸臂13從池檢測部位2的陽極12一側(cè)伸出。
反應(yīng)區(qū)10形成基本上為正方形的上方開口的池，例如，深度為1μm并且長度和寬度為100μm的池。然而，反應(yīng)區(qū)并非局限于所述形狀和尺寸。
反應(yīng)區(qū)10側(cè)面的上述懸臂13的一個端面13a經(jīng)過表面處理，可以使測試核苷酸鏈D的末端部位通過耦合反應(yīng)等化學(xué)結(jié)合而被固定。即，可以優(yōu)選對端面13a進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋砻嫣幚?，以便固定DNA探針等測試核苷酸鏈D的事先處理過的末端部位。例如，當(dāng)懸臂13的端面13a用鏈親和素進(jìn)行表面處理時，經(jīng)表面處理過的端面13a適于固定生物素化的核苷酸鏈的末端部位。這里是對端面13a進(jìn)行表面處理，但端面并非局限于此，并且可以對懸臂13的至少一個部分進(jìn)行表面處理。
這里，在核苷酸鏈中，離子云被認(rèn)為由形成核苷酸鏈骨架的磷酸根離子(負(fù)電荷)和由其周圍存在的離子化的水產(chǎn)生的氫離子(正電荷)形成。通過施加高頻高電壓，由這些負(fù)電荷和正電荷產(chǎn)生的偏振量完全指向一個方向。結(jié)果使核苷酸鏈伸長。而且，當(dāng)將部分集中電力線的不均勻電場施加到核苷酸鏈時，核苷酸鏈向電力線集中的部分移動(參見Seiichi Suzuki，TakeshiYamanashi，Shin-ichi Tazawa，Osamu Kurosawa and Masao Washizu“Quantitatie analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary ACelectric field using fluorescence anisotropy”，IEEE Transaction on IndustrialApplication，Vol.34，No.1，p.75-83(1998))。
因此，當(dāng)能將電力線集中到每個懸臂13的端面13a的高頻高電壓電場通過陰極11和陽極12施加到核苷酸鏈上時，由于應(yīng)用高頻高電壓而伸長的核苷酸鏈向端面13a移動。致使末端部位與端面13a接觸，以此確保測試核苷酸鏈D的末端部位被固定到懸臂13的端面。特別是，當(dāng)采用下述具有PZT(鋯酸鈦酸鉛，lead zirconate titanate)或SBT(鉭酸鍶鉍，strontium bismuthtantalite)等壓電材料的強(qiáng)誘電體(ferrodielectic member)時，這些強(qiáng)誘電體使電力線優(yōu)選集中在懸臂13的端面13a。
具有圖2所示末端部位的噴嘴3用于滴加樣品溶液S(S`)。根據(jù)上述基板1提供的位置信息和旋轉(zhuǎn)同步信息，沿反應(yīng)區(qū)10精確滴加含有測試核苷酸鏈D的樣品溶液S和含有目標(biāo)核苷酸鏈T的樣品溶液S`。
滴加方法優(yōu)選采用噴墨打印法，它可以將非常小的液滴精確地滴在指定的反應(yīng)區(qū)10。
“噴墨打印法”是采用噴墨打印機(jī)中使用的噴嘴的方法。樣品溶液S(S`)使用電源從類似于噴墨打印機(jī)的噴頭噴射到基板1上。這種方法包括壓電噴墨法、泡沫噴射法(bubble ject，注冊商標(biāo))以及超聲噴射法。
壓電噴墨法是在向壓電元件施加脈沖而產(chǎn)生位移的壓力下噴灑液滴的方法。泡沫噴射法(注冊商標(biāo))是在對噴嘴中加熱器加熱而產(chǎn)生泡沫的壓力下噴灑液滴的熱方法。作為加熱器使用的硅基板被嵌入噴嘴內(nèi)并被控制在約300℃/s，以便形成均勻的氣泡并將其推出。但這使樣品溶液S(S`)暴露于高溫下。因此使用生物材料樣品時需要引起注意。超聲噴射法是將超聲波束施加在樣品溶液S(S`)的自由表面，以便局部應(yīng)用高壓，并且從該部位噴射小液滴的方法。故這種方法并不一定需要噴嘴，而且這種方法可以高速形成直徑約1μm的小液滴。
在本實施例中，優(yōu)選采用的噴墨打印法為壓電噴墨法。由于所施加的脈沖的形狀改變，使得可以控制液滴(非常小的液滴)的尺寸。因此，這種方法優(yōu)選用于提高分析精度。也即，當(dāng)液滴表面的曲率半徑較小時，可以減小液滴的尺寸。當(dāng)液滴的曲率半徑較大時，可以增大液滴的尺寸。而且，脈沖可以突然變?yōu)樨?fù)方向以將液滴表面向內(nèi)推使曲率半徑減小。
在這里，滴至反應(yīng)區(qū)10的大多數(shù)測試核苷酸鏈D被固定到懸臂13的端面13a，同時在其上覆蓋基板，導(dǎo)致后續(xù)滴加的目標(biāo)核苷酸鏈T與測試核苷酸鏈D發(fā)生雜交反應(yīng)時，出現(xiàn)空間位阻問題。
因此，在本實施例中，設(shè)置在池檢測部位2的陰極11和陽極12之間產(chǎn)生電位差(potentiall differentce)，致使貯留在反應(yīng)區(qū)10的液層(鹽溶液)形成電場。然后，測試核苷酸鏈D沿著電場方向呈直鏈狀伸長。優(yōu)選上述高頻高電壓位于1×106V/m附近并且大約為1MHz(參照Masao Washizu andOsamu Kurosawa“Electrostatic Manipulation of DNA in MicrofabricatedStructure”，IEEE Transaction on Industrial application，Vol.26，No.26，p.1165-1172(1990))。
當(dāng)池檢測部位2在基板1上排列成行時，可以為每個池檢測部位2設(shè)置陰極11和陽極12。而且，陰極11和陽極12可以分別在常見的電極內(nèi)形成。
如上所述，將高頻高電壓施加到上述池檢測部位2，測試核苷酸鏈D和目標(biāo)核苷酸鏈T呈直鏈狀伸長。因此，很少出現(xiàn)空間位阻，并且有效地加速了雜交反應(yīng)。結(jié)果，雜交的反應(yīng)時間縮短，并且顯示假陽性或假陰性的可能性也降低。
圖3放大了伸出到池檢測部位2的反應(yīng)區(qū)10一側(cè)的懸臂13。圖3示意了測試核苷酸鏈D與目標(biāo)核苷酸鏈T雜交形成雙鏈的情況，其中測試核苷酸鏈D的末端部位被固定到懸臂13的端面13a，而目標(biāo)核苷酸鏈T具有與測試核苷酸鏈D的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。為了簡明，圖3顯示了一個測試核苷酸鏈D固定到端面13a的情況。然而，實際上，可以根據(jù)懸臂13的寬度將足夠數(shù)目的測試核苷酸鏈D固定到端面。
反應(yīng)區(qū)10可以填充瓊脂糖凝膠等相變物質(zhì)(圖中未示出)，它們在室溫和適宜反應(yīng)溫度之間出現(xiàn)凝膠和溶膠(sol)的可逆相變。在這種情況下，可以有利地進(jìn)行以下過程在高溫使相變物質(zhì)變?yōu)槿苣z，在這種狀態(tài)下將電壓施加到單鏈DNA等核苷酸鏈的序列后，降低溫度使相變物質(zhì)變?yōu)槟z，再使相變物質(zhì)在適于雜交反應(yīng)的溫度變?yōu)槿苣z。而且，優(yōu)選當(dāng)相變物質(zhì)保持在凝膠狀態(tài)、并且DNA等核苷酸鏈為伸長狀態(tài)時進(jìn)行雜交。
在相變物質(zhì)變?yōu)槟z的狀態(tài)下，當(dāng)含有目標(biāo)核苷酸鏈T的樣品溶液S`滴加到池檢測部位2時，有可能阻止雜交作用的進(jìn)行。因此，可以事先在滴加位置形成與常規(guī)電泳同樣的垂直方向的溝槽，并將樣品溶液S`滴到所述述溝槽內(nèi)。
上述懸臂13具有由設(shè)置在對向電極之間的壓電材料組成的振動器。將交流電壓施加至振動器，可以使振動器在相應(yīng)的頻率振動。此時，懸臂13可以整體成為壓電振動器。而且，可以在懸臂13上形成壓電元件。
懸臂13可以采用，例如，特開2001-347499號中公報記載的技術(shù)來制造。圖4A-4D簡單描述了上述制造方法的原理。
首先，如圖4A所示，用聚硅層21作為犧牲層，在硅基板20底部一個部位形成最終的空腔部位作為池檢測部位2。整個底部具有統(tǒng)一的高度。然后，在底部表面涂布光刻膠(photoresist)，形成抗蝕圖(resist patterm)，用來掩模(mask)除了利用光蝕刻法等方法形成懸臂13的部位以外的部位。之后，采用例如SiH4-N2O體系，經(jīng)CVD(Chemical Vapor Deposition，化學(xué)氣相成長)法，形成圖4B所示由SiO2(二氧化硅)構(gòu)成的絕緣層22。不僅可以使用SiO2，還可以使用例如SiH4-NH3，經(jīng)CVD法，形成由SiNX(氮化硅)構(gòu)成的絕緣層22。
然后，如圖4C所示，逐層層疊(sequentially laminated)由Pt(鉑)或In(銦)等構(gòu)成的下部電極層23、由PZT(Pb(Ti，Zr)O3鋯酸鈦酸鉛)或SBT(SrBi2Ta2O9鉭酸鍶鉍)等構(gòu)成的壓電材料層24、以及由Pt或In等構(gòu)成的上部電極層25，并成圖(patterned)。
最后，如圖4D所示，將XeF2(二氟化氙)或BrF3(三氟化溴)在真空室中升華(sublime)并導(dǎo)入，通過選擇性蝕刻操作徹底去除聚硅層21。
在本實施例中，測定如上所述制造的懸臂13的固有振動頻率的變化，從而檢測是否有雜交反應(yīng)。
具體地，如圖5所示，形成將下部電極層23與上部電極層25連接的交流回路。當(dāng)交流電源30作為懸臂13驅(qū)動源使頻率改變時，懸臂13振動并激發(fā)。然后，電阻31將與共振振幅相關(guān)的電流轉(zhuǎn)換為電壓，用電壓表32作為振動檢測部件來測定電壓。電壓表32所測定的電壓波形例如由圖6中的實線顯示。由于當(dāng)交流電源30的頻率與懸臂13的固有振動頻率一致時，懸臂13的共振振幅變?yōu)樽畲?，交流電?0在電壓峰值時的頻率f1顯示了懸臂13的固有振動頻率。
在這里，固定到懸臂13的端面13a的測試核苷酸鏈D與具有互補(bǔ)于測試核苷酸鏈D的堿基序列的目標(biāo)核苷酸鏈T雜交，形成雙鏈。在這種情況下，目標(biāo)核苷酸鏈T使懸臂13質(zhì)量增加，從而使懸臂13的固有振動頻率降低。因此，電壓的波形下移到圖6中虛線所示的位置。交流電源30在峰值時的頻率變?yōu)閒2。
相應(yīng)地，測定頻率(固有振動頻率)在電壓峰值時的變化可以檢測是否存在雜交。
而且，由于固有振動頻率的變化(f1-f2)與懸臂13的質(zhì)量變化確切相關(guān)，因此測定測試核苷酸鏈D被固定到懸臂之前的固有振動頻率、測試核苷酸鏈D被固定到懸臂之后的固有振動頻率、以及雜交反應(yīng)完成之后的固有振動頻率，可以定量檢測被固定到懸臂13的測試核苷酸鏈D的數(shù)目，或者與測試核苷酸鏈D雜交的目標(biāo)核苷酸鏈T的數(shù)目。
由于質(zhì)量變化的增大使固有振動頻率變化的檢測靈敏度提高，因此，優(yōu)選用錨著分子(anchor molecule)修飾目標(biāo)核苷酸鏈T的末端，以增加其質(zhì)量。
如上所述，當(dāng)反應(yīng)區(qū)10填充瓊脂糖凝膠等相變物質(zhì)時，有可能不能精確測定頻率。因此，在完成雜交反應(yīng)后，可以在測定頻率前將相變物質(zhì)變?yōu)槿苣z，并且可以通過旋轉(zhuǎn)基板1產(chǎn)生離心力作用來除去相變物質(zhì)。
在上述實施例中，懸臂13整體與壓電振動器一起形成。然而，懸臂并非局限于此。如圖7所示，作為驅(qū)動電極的壓電元件40a和作為檢測電極的壓電元件40b可以設(shè)置在懸臂13的上部。圖8顯示了在這種情況下懸臂13在含有壓電元件40a和40b的位置處的垂直截面圖。
如圖8所示，在懸臂13中，在硅基板41上形成由SiO2或SiNX組成的絕緣層42。而且，壓電元件40a和40b分別包括由Pt或In制成的下部電極層43a和43b、由PZT或SBT制成的壓電材料層44a和44b以及由Pt或In制成的上部電極層45a和45b，它們依次層疊。
當(dāng)檢測是否存在雜交反應(yīng)時，交流電源50作為驅(qū)動源使頻率改變，此時懸臂13振動并被激發(fā)。然后，由電壓表51作為振動檢測部件測定基于共振振幅的電位差。當(dāng)懸臂13的質(zhì)量如上所述由于雜交反應(yīng)而增加時，懸臂13的固有振動頻率降低，使電壓峰值時交流電源50的頻率降低。
當(dāng)以上述方式確認(rèn)由雜交反應(yīng)引起的固有振動頻率的變化時，在例如，從指定的細(xì)胞提取的樣品溶液S`中，可以發(fā)現(xiàn)與測試核苷酸鏈D互補(bǔ)的目標(biāo)核苷酸鏈，其中所述測試核苷酸鏈D含有與特定疾病相關(guān)的標(biāo)記基因。結(jié)果，可以預(yù)測上述細(xì)胞中出現(xiàn)上述疾病。
現(xiàn)參照圖9A和9B描述本實施例中用于生物測定的裝置的另一例基板。圖9A顯示了本例中從上方觀察到的基板平面圖。圖9B顯示了圖9A中X部位的放大平面圖。
圖9A所示基板60包括條狀溝槽檢測部位61。在條狀溝槽檢測部位61中，反應(yīng)區(qū)70具有在基板60上放射狀延伸的條狀溝槽。從形成條狀溝槽的縱向側(cè)觀察，懸臂73如圖9B所示以指定的間隔伸出并各自具有與在池檢測部位2的懸臂13相同的結(jié)構(gòu)。在設(shè)有懸臂73的部位，陰極71和陽極72相對設(shè)置，將反應(yīng)區(qū)70夾于其間。條狀溝槽檢測部位61具有將上述池檢測部位2排列在條狀溝槽內(nèi)的結(jié)構(gòu)。
每個陰極71可以形成常見的電極。每個陽極72也可以形成常見的電極。即，常見的陰極和常見的陽極可以彼此相對，它們將反應(yīng)區(qū)70夾于其間，并且它們在基板60呈放射狀排列。根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，針型探針可以從上方應(yīng)用到常見的陰極和常見的陽極，從而提供電流。
上述反應(yīng)區(qū)70可以在每個條狀溝槽中排列的凹陷(pin)(附圖未示出)中形成。在凹陷的反應(yīng)區(qū)中滴入非常小的液滴，可以實現(xiàn)基本相同的斑點尺寸。
此外，在條狀溝槽檢測部位61中，可以使用送液部件，它可以利用毛細(xì)作用或利用經(jīng)指定的方法旋轉(zhuǎn)盤狀基板60而產(chǎn)生的離心力。
具體地，在基板61的中心位置設(shè)置儲液部件62。在儲液部件62中注入樣品溶液S(S`)或清洗液，所述清洗液用于除去反應(yīng)后沒有被活性結(jié)合(actively bond)的過量目標(biāo)核苷酸鏈T。使基板60旋轉(zhuǎn)，以便順利并且可靠地將液體從基板中心區(qū)域供至條狀溝槽(即，反應(yīng)區(qū)70)。
在條狀溝槽檢測部位61，條狀溝槽檢測部位單位或者成組的條狀溝槽檢測部位單位可以固定不同的測試核苷酸鏈D。
以下簡述基板1和60的位置信息和旋轉(zhuǎn)同步信息。在基板1和60的旋轉(zhuǎn)方向，形成許多事先由光盤控制過程(disc mastering processs)形成的地址凹陷(adderss pit)。當(dāng)基板1和60被視為光盤時，作為滴加檢測位置的反應(yīng)區(qū)10和70可以被視為用戶數(shù)據(jù)區(qū)。在其它區(qū)域，同步凹陷(synchronizingpit)由樣品伺服系統(tǒng)(sample servo system)來排列并且也用作跟蹤伺服系統(tǒng)(tracking servo)。緊隨其后插入地址部分(adderss parts)(光盤上的地理地址)，以便給出位置信息。
地址部分由扇區(qū)標(biāo)志開頭(sector mark starting)、VFO、地址標(biāo)志(adderssmark)和ID(標(biāo)識符)組成，其中扇區(qū)標(biāo)志開頭作為第一圖形，VFO用于應(yīng)用(apply)實際上為旋轉(zhuǎn)盤的旋轉(zhuǎn)相，地址標(biāo)志用于應(yīng)用地址數(shù)據(jù)的開頭位置，ID包括磁道(track)和扇區(qū)(sector)等的數(shù)目。
當(dāng)采用具有上述結(jié)構(gòu)的基板1和60進(jìn)行生物測定時，使用了至少包括下述部件和器具(mechanicsm)的裝置。即，該裝置(附圖中未示出)至少包括使上述基板1和60保持旋轉(zhuǎn)的基板旋轉(zhuǎn)部件、在基板1和60通過基板旋轉(zhuǎn)部件而旋轉(zhuǎn)時將樣品溶液S(S`)以指定的順序和時間滴到反應(yīng)區(qū)10和70的滴定部件、將滴加部件(其噴嘴)和基板間的距離保持在指定距離的焦點伺服器(focus servo mechanicsm)、以及根據(jù)基板1和60提供的位置信息和旋轉(zhuǎn)同步信息使樣品溶液S(S`)沿著基板1和60的反應(yīng)區(qū)10和70滴下的跟蹤伺服器(tracking servo mechanicsm)。
當(dāng)利用上述基板1和60以及使用它們的生物測定裝置時，可優(yōu)選實施根據(jù)本發(fā)明的上述相互作用檢測方法。
即，當(dāng)在懸臂13和73的端面固定的測試核苷酸鏈D與目標(biāo)核苷酸鏈T雜交時，懸臂13和73的質(zhì)量增加。相應(yīng)地，懸臂13和73的固有振動頻率降低。因此，測定固有振動頻率的變化可以檢測雜交作用。
此外，可以通過陰極11和71以及陽極12和72在反應(yīng)區(qū)10和70上形成電場。因此，當(dāng)測試核苷酸鏈D和目標(biāo)核苷酸鏈T反應(yīng)區(qū)10和70內(nèi)伸長時，它們可以相對移動并雜交。相應(yīng)地，雜交效率提高了。
本發(fā)明并非局限于上述實施例以及附圖對其的說明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離附屬的權(quán)利要求和其要旨的前提下可以進(jìn)行各種變形、替換或者等同物。
例如，在上述實施例中，用于生物測定的基板形成盤狀。然而，基板并非局限于上述形狀，可以適當(dāng)?shù)剡x擇矩形和其它平板形狀并進(jìn)行測定。
此外，在上述實施例中，測定測試核苷酸鏈D和目標(biāo)核苷酸鏈T有無雜交反應(yīng)的情況可以被解釋為一種代表例。然而，本發(fā)明并非局限于上述檢測有無雜交反應(yīng)的實例。
特別是，可以在上述反應(yīng)區(qū)10和70內(nèi)由測試核苷酸鏈D形成雙鏈核苷酸，并且除了進(jìn)行雜交反應(yīng)之外，還可以進(jìn)行雙鏈核苷酸與肽(或蛋白質(zhì))間的相互作用、酶反應(yīng)相互作用以及其它分子間的相互作用。特別是，當(dāng)使用雙鏈核苷酸時，可以分析受體分子如作為轉(zhuǎn)錄因子的激素受體和具有反應(yīng)元件的DNA分子的結(jié)合。
如上所述，“生物測定”泛指根據(jù)雜交或物質(zhì)間的其它相互作用進(jìn)行的生化分析。
工業(yè)實用性本發(fā)明特別優(yōu)選用于基于DNA芯片的生物測定方法，并且可以用于基因突變分析、SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析、基因表達(dá)頻率分析等。本發(fā)明可以在包括藥物開發(fā)、臨床診斷、藥物基因?qū)W、法醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多種領(lǐng)域以及其它領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種用于測定檢測部位的物質(zhì)間相互作用的相互作用檢測方法，所述檢測部位包括至少一個懸臂，該懸臂的至少一個部分經(jīng)表面處理可以固定測試物質(zhì)，所述檢測部位還包括為固定在表面處理部位的測試物質(zhì)與與目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用提供場所的反應(yīng)區(qū)，用于振動和激發(fā)懸臂的驅(qū)動源，以及用于測定懸臂的振動幅度的振動檢測部件，所述的相互作用檢測方法包括通過測定所述懸臂固有振動頻率基于所述相互作用而發(fā)生的變化來測定所述相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的相互作用檢測方法，其中，所述懸臂配有振動器，它在對向電極之間設(shè)置壓電材料，且所述驅(qū)動源通過在對向電極之間施加交流電壓而振動和激發(fā)所述懸臂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的相互作用檢測方法，其中，所述測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)為核苷酸鏈，且所述相互作用為雜交作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的相互作用檢測方法，還包括形成電場的步驟，其中，在所述反應(yīng)區(qū)形成電場，并且當(dāng)所述測試核苷酸鏈和目標(biāo)核苷酸鏈在所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)伸展時，它們相對移動以進(jìn)行雜交。
5.一種生物測定裝置，其具有檢測部位，所述檢測部位包括至少一個懸臂，該懸臂有至少一個部分經(jīng)表面處理可以固定測試物質(zhì)，所述檢測部位還包括為固定在表面處理部位的測試物質(zhì)與與目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用提供場所的反應(yīng)區(qū)、用于振動和激發(fā)懸臂的驅(qū)動源、以及用于檢測懸臂的振動幅度的振動檢測部件。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物測定裝置，其中，所述懸臂配有振動器，它在對向電極之間設(shè)置壓電材料，且所述驅(qū)動源通過在對向電極之間施加交流電壓而振動和激發(fā)所述懸臂。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物測定裝置，其中，所述測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)為核苷酸鏈，且所述相互作用為雜交作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物測定裝置，其中，所述檢測部位還包括電場形成部件，該部件用于在所述反應(yīng)區(qū)形成電場，并且使所述測試核苷酸鏈和目標(biāo)核苷酸鏈在伸展的同時發(fā)生相對移動，以便進(jìn)行雜交。
9.一種用于生物測定的基板，其具有檢測部位，所述檢測部位包括至少一個懸臂，所述懸臂有至少一個部分經(jīng)表面處理可以固定測試物質(zhì)，所述檢測部位還包括反應(yīng)區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)為固定在表面處理部位的測試物質(zhì)與與目標(biāo)物質(zhì)之間的相互作用提供場所。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于生物測定的基板，其中，所述檢測部位為池檢測部位，在該池檢測部位中，所述懸臂從壁表面突出，并且所述基板上設(shè)置多個池檢測部位。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于生物測定的基板，其中，所述基板形成盤狀基板，并且，從上方觀察時，所述池檢測部位在所述盤狀基板上呈放射狀。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于生物測定的基板，其中，所述池檢測部位的單位或成組的多個池檢測部位的單位分別固定不同的測試物質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于生物測定的基板，其中，所述基板形成盤狀基板，所述反應(yīng)區(qū)設(shè)置在放射狀延伸的條狀溝槽中，并且，所述懸臂從所述條狀溝槽的一側(cè)突出。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于生物測定的基板，其中，所述池檢測部位的單位或成組的多個池檢測部位的單位分別固定不同的測試物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于生物測定的基板，其中，所述反應(yīng)區(qū)用能在室溫和適宜反應(yīng)溫度之間產(chǎn)生凝膠和溶膠的可逆相變的物質(zhì)填充。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于生物測定的基板，其中，通過測定所述懸臂的固有振動頻率基于所述相互作用而發(fā)生的變化來檢測該相互作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于生物測定的基板，其中，所述測試物質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)為核苷酸鏈，并且所述相互作用為雜交作用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于生物測定的基板，其中，所述檢測部位還包括電場形成部件，該部件用于在所述反應(yīng)區(qū)形成電場，并且使所述測試核苷酸鏈和目標(biāo)核苷酸鏈在伸展的同時發(fā)生相對移動，以便進(jìn)行雜交。
全文摘要
在池檢測部位(2)中，懸臂(13)的端面(13a)事先經(jīng)過表面處理以便固定測試核苷酸鏈(D)。在反應(yīng)區(qū)(10)，由陰極(11)和陽極(12)產(chǎn)生電場，導(dǎo)致從噴嘴(3)滴下的目標(biāo)核苷酸鏈(T)向端面(13a)移動，同時目標(biāo)核苷酸鏈T保持伸展?fàn)顟B(tài)。當(dāng)測試核苷酸鏈(D)和目標(biāo)核苷酸鏈(T)雜交時，懸臂(13)的質(zhì)量增加，固有振動頻率降低。因此，將交流電壓施加到懸臂(13)來測定固有振動頻率的變化時，可以檢測有無雜交作用，并定量檢測所雜交的目標(biāo)核苷酸鏈(T)的數(shù)目等。
文檔編號G01N27/00GK1688884SQ0382368
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者真峰隆義, 木下隆 申請人:索尼株式會社