專利名稱：：篩選改變皮膚和/或頭發(fā)色素沉著的化合物的方法篩選改變皮膚和/或頭發(fā)色素沉著的化合物的方法本發(fā)明涉及鑒定在改變皮膚色素沉著方面具有活性的化合物的方法，以及在所述方法中有用的核酸分子、多肽和細(xì)胞。皮膚是身體中最大的器官，在溫度調(diào)節(jié)、保護(hù)免于物理和化學(xué)的傷害、保護(hù)免于感染以及維生素D的產(chǎn)生方面具有作用。存在著多種的皮膚顏色，其可能與氣候、大陸和文化相關(guān)。深色皮膚主要位于更靠近赤道的較熱的氣候中，被認(rèn)為提供了針對UV輻射和熱量的保護(hù)。淺色的皮膚在較冷的區(qū)域中存在，在該區(qū)域UV保護(hù)的需要較少，并且還與提高的維生素D產(chǎn)生相關(guān)。對于皮膚顏色負(fù)責(zé)的主要色素是胡蘿卜素、血紅蛋白以及特別是黑色素。黑色素由兩種主要亞型組成，較深色的真黑色素和較淺色的褐黑色素。黑色素由黑素細(xì)胞合成，與其他蛋白質(zhì)組合成微粒，其然后再分配到角質(zhì)形成細(xì)胞中。黑色素的數(shù)量受到UV輻射暴露的影響，因而通過提高皮膚中黑色素的數(shù)量產(chǎn)生了更深色的皮膚。組成型和誘導(dǎo)型皮膚和毛發(fā)色素沉著的遺傳學(xué)基礎(chǔ)還沒有完全了解，假說是多種基因涉及色素沉著。在外界因素，例如陽光影響皮膚顏色之前，這些基因的不同變體影響了個體的皮膚顏色表型。發(fā)明概述在本發(fā)明的第一個方面，提供了鑒定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著、或改變皮膚和/或毛發(fā)的黑色素組成(composition)，所述方法包括測定測試化合物調(diào)節(jié)NCKX介導(dǎo)的鈣離子跨膜運(yùn)動的能力。NCKX分子可以來自任何物種，特別是哺乳動物，最優(yōu)選的是人類。NCKX分子的實(shí)例是NCKX1(基因登記號no.NM—004727,蛋白質(zhì)登記號no,NP—004718);NCKX2基因登記號no.NM—020344,蛋白質(zhì)登記號no.NP_065077);NCKX3(基因登記號no.NM—020689,蛋白質(zhì)登記號no.NP—065740);NCKX4(基因登記號nos.NM—153648、NM—153646、NM—153647;蛋白質(zhì)登記號nos.NP—705934、NP—705932、NP705933);NCKX5(序列參見附圖1,基因登記號nos.NM—205850XM—208771，蛋白質(zhì)登記號nos.NP—995322XP—208771)以及NCKX6(基因登記號no.NM_024959,蛋白質(zhì)登記號no.NP—079235)(參見Cai&Lytton(2004)MolBiol&Evolutionvol21no9pgl692-1703以及Schnetkamp(2004)PflugersArch-EurJPhysiolvol447pg683-688)優(yōu)選地，NCKX分子是NCKX5。NCKX5也被稱為SLC24A5。優(yōu)選地，所述方法包括使包含NCKX分子或其變體、融合體或衍生物的膜暴露于測試化合物，并直接或間接地測量所述膜的一側(cè)或兩側(cè)的釣離子濃度的步驟。本發(fā)明的方法可以包括以下步驟(a)提供包含至少一種NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的膜，其中所述膜分割了兩個不同的區(qū)室；(b)在暴露于一種或多種測試化合物之前測量一個或兩個區(qū)室中的釣離子(Ca2+)濃度；(c)所述膜暴露于一種或多種測試化合物；(d)暴露于一種或多種測試化合物之后測量一個或兩個區(qū)室中的鈣離子(Ca2+)濃度；(e)通過比較步驟(b)和步驟(d)中測量的濃度來鑒定釣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量；本發(fā)明的方法還可以進(jìn)一步包括與對照值比較響應(yīng)于測試化合物的4丐運(yùn)動。這種比較可以使用以下步驟實(shí)現(xiàn)(f)重復(fù)上述步驟(a)、(b)、(d)和(e)來提供沒有暴露于一種或多種測試化合物時鈣離子(Ca2+)濃度改變的對照結(jié)果；(g)比較在暴露于所述測試化合物之后在步驟(e)中筌定的釣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量、在步驟(f)的對照中鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量(h)鑒定鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量是否響應(yīng)于對所述測試化合物的暴露而提高、降低或保持相同?？蛇x擇的對照方法將是比較鈣離子跨越不含NCKX蛋白質(zhì)的對照膜的運(yùn)動的數(shù)量。NCKX5(也稱為SLC24A5)是鈉、鈣/鉀交換器家族(NCKX)7的成員，以及發(fā)現(xiàn)影響斑馬魚中的色素沉著。在斑馬魚中，NCKX5中的突變展現(xiàn)了與"金色"突變相關(guān)的色素沉著的降低(Lamason(2005)Science310ppl782-1786)。已經(jīng)進(jìn)行了其他鈉-釣交換器的研究，顯示了例如NCKX1和NCKX2展現(xiàn)在人類光受體、牛心肌中的鈣交換功能(Winkfein(2003)Biochemistry42pp543-552andSchnetkamp(1996)Biochem.Cell.Biol.74pp535-539)以及動脈平滑肌Epublication:Doug(2006)AmericanJournalPhysiol.HeartCirc.Physiol(April14th2006)doi:10.1152/ajpheart.00196.2006。申請人現(xiàn)在已證明了NCKX5與黑素細(xì)胞中的鈉-鉀/鈣交換功能相關(guān)，并且該功能與皮膚色素沉著緊密地相關(guān)。此外，申請人證明了由于單核苷酸多態(tài)性(SNP),NCKX5以氨基酸111處的兩種等位形式存在。Alalll版本(version)與提高的鈣運(yùn)動相關(guān)，主要在深色皮膚中存在。Thrill版本與降低的釣運(yùn)動緊密相關(guān)，主要在較淺色的皮膚中存在(參見實(shí)施例1和2)。包括SNP的位置的NCKX5序列在附圖1中示出。優(yōu)選地，4丐離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量的提高表明測試化合物提高皮膚色素沉著，鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量的降低表明測試化合物降低皮膚色素沉著。任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括以下步驟(i)分離一種或多種測試化合物。進(jìn)一步任選地，所述方法包括以下步驟(j)將步驟(i)中分離的所述一種或多種測試化合物配制到化妝品或藥物制劑中。方便地，所述膜是生物膜，例如，優(yōu)選地作為完整細(xì)胞的部分的細(xì)月包膜。細(xì)胞膜和/或完整細(xì)胞的優(yōu)選的來源是倉鼠胚腎(HEK)細(xì)胞、擊掌(Highfive)昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、盤基網(wǎng)柄菌(dictyostelium)細(xì)胞、煙草植物細(xì)胞、p53缺陷細(xì)胞系H1299和/或細(xì)菌。有益地，所述NCKX5分子天然地位于所述膜中，或者人工地靶向所述膜，或重構(gòu)到人工的膜中。優(yōu)選地，當(dāng)所述NCKX5人工地輩巴向所述膜時，通過連接使多肽靶向膜或包括在膜中的前導(dǎo)序列和/或標(biāo)記，或通過刪除內(nèi)部區(qū)室存留信號，例如ArgArg基序來進(jìn)行。方便地，所述前導(dǎo)序列來源于NCKX2或4、酵母a配偶因子、NCX蛋白、TGFbeta、血細(xì)胞凝集素或病毒表面蛋白。優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列是hsNCKX2的N-末端序列(氨基酸1到120)。有益地，4丐離子(Ca2+)濃度和/或運(yùn)動利用選自Ca"+敏感性染料(熒光和/或非熒光的)、電生理學(xué)方法(例如膜片鉗)、放射性鉀(45Ca2+)或常規(guī)的質(zhì)譜法的方法來測量。優(yōu)選地，NCKX5分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物具有在氨基酸殘基111的密碼子處的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。氨基酸殘基111的密碼子處的SNP可以編碼丙氨酸或蘇氨酸(DVAGA/TTFMAAG)(參見附圖3)。所述方法還可以包括通過利用7>知的技術(shù)如電生理學(xué)方法如膜片鉗來測試所述測試化合物的選擇性(即，它是否影響任何其他的離子通道)的步驟。在本發(fā)明的第二個方面，是編碼融合蛋白的核酸分子，其包括編碼NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的核酸分子以及編碼膜靶向前導(dǎo)區(qū)肽和/或標(biāo)記(tag)的核酸分子。所述嵌合核酸分子可以編碼嵌合體，所述嵌合體包含NCK2的N末端和NCKX5的從151位到末尾；或NCKX4的N-末端1-200個氨基酸以及NCKX5的從151位到末尾。做為選擇，所述嵌合體可以包括NCKX2的C末端(11個氨基酸)代替NCKX5的最后11個氨基酸。優(yōu)選地，所述膜靼向前導(dǎo)區(qū)肽和/或標(biāo)記是來源于NCKX2或4、酵母a配偶因子、NCX蛋白、TGFbeta、血細(xì)胞凝集素或病毒表面蛋白。最優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列是hsNCKX2的N-末端序列(氨基酸1到120)。有益地，編碼所述NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的核酸分子包括在氨基酸殘基111的密碼子處的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。在氨基酸殘基111處的SNP可以編碼丙氨酸或蘇氨酸。因而，所述分離的核酸分子適合于表達(dá)本發(fā)明的多肽。"適合于表達(dá)，，意思是所迷核酸分子是一種多核苷酸，其可以被翻譯來形成所述多肽，例如RNA,或者編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸(優(yōu)選的是DNA)按照適當(dāng)?shù)娜∠蛞约坝糜诒磉_(dá)的正確閱讀框浮皮插入表達(dá)載體例如質(zhì)粒中。所述多核苦酸可以連接到被任何希望的宿主識別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列上；這些控制物可以摻合入所述表達(dá)載體中。本發(fā)明的核酸分子可以是DNA或RNA,優(yōu)選的是DNA。所述DNA然后在適合的宿主中表達(dá)來產(chǎn)生包含本發(fā)明的化合物的多肽。因而，編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA可以根據(jù)已知的技術(shù)來使用、根據(jù)本文所含的教導(dǎo)來適當(dāng)?shù)匦揎?，以?gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體然后用于轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞，用于本發(fā)明的多肽的表達(dá)和生產(chǎn)。這些技術(shù)包括在以下美國專利Rutter等人的1984年4月3日授權(quán)的美國專利No4,440,859、Weissman的1985年7月23日授權(quán)的4,530,901、Crowl的1986年4月15日授權(quán)的4,582,800、Mark等人的1987年6月30日授權(quán)的4,677，063、Goeddel的1987年7月7日授權(quán)的4,678,751、Itakura等人的1987年11月3日授權(quán)的4,704,362、Murray的1987年12月1日授權(quán)的4，710,463、Toole,Jr.等人的1988年7月12日授權(quán)的4,757,006、Goeddel等人的1988年8月23日授權(quán)的4,766,075,以及Stalker等人1989年3月7日授權(quán)的4,810,648中所公開的那些，所有這些通過引用合并于本文。因此，在本發(fā)明的第三個方面，提供了包含本發(fā)明的第二個方面的核酸分子的表達(dá)載體。編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA可以連接到各種其他DNA序列上用于導(dǎo)入合適的宿主中。陪伴(companion)DNA將取決于宿主的性質(zhì)、將DNA導(dǎo)入宿主的方式、以及是保持游離還是需要整合。所述DNA被插入表達(dá)載體例如質(zhì)粒中，按照適當(dāng)?shù)娜∠蛞约坝糜诒磉_(dá)的正確閱讀框。如有必要，所述DNA可以連接到一皮任何希望的宿主識別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列上，不過這些控制物一般是所述表達(dá)載體上現(xiàn)有的。因而，DNA插入物可以可操作地連接到合適的啟動子。細(xì)菌啟動子包括大腸桿菌(E.coli)/acl和/"cZ啟動子、T3和T7啟動子、g;^啟動子、噬菌體XPR和PL啟動子、//zoA啟動子和^/7啟動子。真核的啟動子包括CMV即時早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LST的啟動子。其他適合的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達(dá)構(gòu)建體理想地還含有轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)，以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中，含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。(Hastings"國際專利號No.WO98/16643,1998年4月23日公開)許多表達(dá)系統(tǒng)是已知的，包括采用以下的系統(tǒng)用例如重組的噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)；用例如酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，釀酒酵母(Saccaromycescerevisiae));用例^口病毒表達(dá)載體(侈'H口，才干4夫病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用例如病毒或細(xì)菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞系統(tǒng)；用例如腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞系統(tǒng)。載體可以包括原核復(fù)制子，例如ColEl用于在原核生物中增殖，即使該載體將要用于在其他非原核細(xì)胞類型中表達(dá)。載體還可以包括能夠指導(dǎo)基因在用其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的合適的啟動子，例如原核啟動子。啟動子是由DNA序列形成的表達(dá)控制元件，其允許RNA聚合酶的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。與示范性的細(xì)菌宿主相容的啟動子序列一般地在質(zhì)粒載體中提供，所述質(zhì)粒載體含有方便的限制性位點(diǎn)用于本發(fā)明的DNA片段的插入。典型的原核載體質(zhì)粒有可從Biorad實(shí)^r室(Richmond,CA,USA)獲得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329;可從Pharmacia(Piscataway,NJ，USA)獲得的pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5;可從StratageneCloningSystems(LaJolla，CA92037，USA)獲得的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A。USA;、獲得的pSVL。這種載體利用S;40晚期啟動子來驅(qū)動克隆的基因的表達(dá)，表達(dá)的最高水平在T抗原生產(chǎn)細(xì)胞，例如COS-l細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)?？烧T導(dǎo)的哺乳動物表達(dá)載體的實(shí)例是pMSG，也可從Pharmaciaii(Piscataway，NJ，USA)獲得。這種載體利用小鼠乳腺胂瘤病毒長末端重復(fù)的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子來驅(qū)動克隆的基因的表達(dá)。優(yōu)選的載體是piEI/153A(可從Cytostore獲得)和pcDNA3.1(可從Invitrogen獲得)。這些載體的圖譜在附圖6和7中給出。有用的酵母質(zhì)粒載體是pRS403-406和pRS413-416,—般可從StratageneCloningSystems(LaJolla,CA92037，USA)獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(Yips)，包括酵母選擇性標(biāo)記HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲點(diǎn)質(zhì)粒(YCps)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以用于構(gòu)建含有編碼序列以及例如合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制物的表達(dá)載體。一種這樣的方法包括經(jīng)由同聚物尾部來連接。同聚物polydA(或polydC)尾部通過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶被添加到要克隆的DNA片段上暴露的3'OH基團(tuán)。該片段S^火:i:后留;的缺n可以通過DNA"聚合酶來填;'，通過DNA連接酶來連接游離末端。另一種方法涉及通過粘性末端來連接。相容的粘性末端可以通過適合的限制性內(nèi)切酶的作用在DNA片段和載體上產(chǎn)生。這些末端將通過互補(bǔ)堿基配對快速地退火，其余的斷口可以通過DNA連接酶的作用來閉合。進(jìn)一步的方法利用了稱為連接物(linker)和銜接頭(adaptor)的合成的分子。通過噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I來產(chǎn)生具有鈍的末端的DNA片段，它們移除突出的3'末端并填充凹進(jìn)的3'末端。合成的連接物、含有規(guī)定的限制性內(nèi)切酶的識別序列的鈍端化的雙鏈DNA，可以通過T4DNA連接酶來連接到鈍端化的DNA片段。它們隨后用合適的限制性內(nèi)切酶消化來產(chǎn)生粘性末端，并連接到具有相容的末端的表達(dá)載體上。銜接頭也是化學(xué)上合成的DNA片段，其含有一個用于連接的鈍末端，但是其還具有一個預(yù)先形成的粘性末端。含有多種限制性內(nèi)切酶的合成的連接物是可從多種來源、包括InternationalBiotechnologiesInc,NewHaven,CN，USA獲得的。修飾編碼本發(fā)明的多肽的DNA的希望的途徑將利用如所Saiki"a/(1988)Science239,487-491公開的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在這種方法中，要酶學(xué)擴(kuò)增的DNA的側(cè)翼是兩個特異性寡核苷酸引物，所述引物本身被合并到擴(kuò)增的DNA中。所述特異性引物可以含有限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，其可以用于利用本領(lǐng)域已知的方法克隆到表達(dá)載體中。預(yù)期在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的示范性的酵母屬有畢赤酵母(尸/c/na)(漢遜酵母(/a"""w/a))、酵母(Sacc/zaromycM)、克魯維酵母(A7矽veromFM)、假絲酵母(C朋&^)、球擬酵母(rww/o/^'s)、有孢圓(ron^wpora)、裂歹直酵母(5"c/zz'zc^"cc/z(3Tomyce力、固嚢酵母(C"eramyce力、管囊酵母(尸ac/yAyo/ew)、德、巴利酵母(De6arowyc^)、才每奇酵母(Me&c/mmlow/a)、紅冬孢酵母CR/206fo^on^wm)、紅冬孢酵母(Z/ewcas*pon'<iz'wm)、So^yoawct^、4貞扭P孑包酵母(5^on'fif/o6o/us1)、擬內(nèi)孑包霉(^7Jom少co/^z力等等。優(yōu)選的屬選自畢赤酵母(漢遜酵母)、酵母(&cc/z"myc^)、克魯維酵母、耶氏酵母(F^row'")和漢遜酵母。酵母屬的實(shí)例有釀酒酵母、意大利酵母(S."a"cw力和魯氏酵母(S.w力0?？唆斁S酵母屬的實(shí)例有脆壁克魯維酵母(/rag&力和乳酸克魯維酵母(〖/acto)。畢赤酵母(漢遜酵母)屬的實(shí)例有安格斯(尸.(以前的多形漢遜酵母(//./0/;^70^/7"))、異常畢赤酵母(尸.tmoma/a)、巴斯德畢赤酵母(尸.；"Wo"力和碎嚢畢赤酵母(尸.c"戸w/We)。解脂耶氏酵母(J./^0(y"c")是適合的耶氏酵母的實(shí)例。在EP251744、EP258067和WO90/01063中一般地教導(dǎo)了釀酒酵母的轉(zhuǎn)化的方法，所有這些通過引用合并在此。釀酒酵母的適合的啟動子包括與甘油醛-3-磷酸脫氫酶、已糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、葡糖激酶、a-配偶因子信息素、a-配偶因子信息素的基因PGK1基因、GAL1或gall0基因、CYC1、PH05、TRP1、ADH1、ADH2;PRB1啟動子、GUT2啟動子和涉及5'調(diào)節(jié)區(qū)域與其它啟動子的5'調(diào)節(jié)區(qū)域或與上游活化位點(diǎn)的雜交的雜交啟動子(例如，EP-A-258067的啟動子)相關(guān)的那些。在粟酒裂殖酵母(SC/^C^"CC/Z"ra/7^CM/7CW&)中<吏用的方^更的可調(diào)節(jié)啟動子有Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所描述的來自nmt基因的硫胺可抑制啟動子，以及Hoffman&Winston(1990)Genetics124,807-816所描述的葡萄糖可抑制的fbpl基因啟動子。轉(zhuǎn)錄終止信號優(yōu)選的是真核基因的3'側(cè)翼序列，其含有用于轉(zhuǎn)錄終止的適當(dāng)?shù)男盘柡投嗑巯佘账?。適合的3'側(cè)翼序列可以是，例如，與所使用的表達(dá)控制序列天然地連接的基因的序列，即，可以相應(yīng)于所述的啟動子。做為選擇，它們都可以是不同點(diǎn)的，在這種情況下，釀酒酵母^D///基因的終止信號是優(yōu)選的。在本發(fā)明的第四個方面，提供了含有本發(fā)明的第二和第三方面的核酸分子和/或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步地在其表面顯示了本發(fā)明的第二和第三方面的核酸分子和/或表達(dá)載體所編碼的多肽。然后根據(jù)本文公開的教導(dǎo)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合條件下培養(yǎng)已經(jīng);陂本發(fā)明的重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞足夠的時間，以允許多肽的表達(dá)，其然后可以作為可溶的多肽或作為膜的部分來被回收。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。細(xì)菌細(xì)胞優(yōu)選地是原核宿主細(xì)胞，一般地是大腸桿菌的菌抹，例如可從BethesdaResearchLaboratoriesInc.,Bethesda,MD,USA獲得的大腸桿菌菌林DH5,以及可從Rockville，MD，USA的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的RR1(NoATCC31343)。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括酵母和哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選的脊推動物細(xì)胞，例如來自小鼠、大鼠、猴或人類成纖維細(xì)胞系的那些。酵母宿主細(xì)l包包括YPH499、YPH500和YPH501，其一^:可/人StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA獲得?？赡艿牟溉閯游锼拗骷?xì)胞包括倉鼠胚腎細(xì)胞、可從ATCC作為CCL61獲得的中國倉鼠卯巢(CHO)細(xì)胞，可從ATCC作為CRL1658獲得的NIHSwiss小鼠胚胎細(xì)胞NIH/3T3,以及可從ATCC作為CRL1650獲得的猴腎衍生的COS-1細(xì)胞?？赡艿睦ハx細(xì)胞有擊掌和Sf9細(xì)胞，其可以用桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞宿主通過公知的方法來實(shí)現(xiàn)，其一般取決于所使用的載體的類型。對于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，參見，例如Cohene"/n972)/Voc.Ato/.^cm/.&/.固69，2110andSambrookf2001)M0/ecwA2rC/om力g,Z^orafor_yMww"/,3rdEd.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.。在Shermana/"986)Mef/zc^/"J^aWGewWcs,J丄a60ra"r少M(fèi)a,/,ColdSpringHarbor,NY.中描述了酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Beggs(1978)A^w"275,104-109的方法也是有用的。對于脊推動物細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞中有用的試劑，例如磷酸4丐和DEAE-葡聚糖或脂質(zhì)體制劑，可從StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.，Gaithersburg，20877,USA獲得。電穿孔對于轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是有用的，用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和脊推動物細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。例如，許多細(xì)菌物種可以通過在LuchanskyWa/O988)Mo/.A^crc^zo/.2,637-646中描述的方法來轉(zhuǎn)化，通過引用合并在此。利用25pFD的6250V每cm、懸浮在2.5XPEB中的DNA-細(xì)胞混合物的電穿孔之后，一致地回收了最大數(shù)量的轉(zhuǎn)化體。通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法在Becker&Guarente(1990)M^/zo心194,182中公開了?？梢允褂梦锢矸椒▽NA導(dǎo)入動物和植物細(xì)胞中。例如，顯微注射利用了非常細(xì)的吸移管來直接將DNA分子注射到要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的核中。另一個實(shí)例包括用高速的微粒轟擊細(xì)胞，通常是包被有DNA的金或鴒的顆粒。成功地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即，含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞可以通過公知的技術(shù)來鑒定。例如，一種選擇技術(shù)涉及向表達(dá)載體中摻入編碼轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的可選擇性狀的DNA序列(標(biāo)記物)。這些標(biāo)記物包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大腸桿菌和其他細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨千西林抗性基因。做為選擇，這種可選擇性狀的基因可以在另一個載體上，所述載體被用于共同轉(zhuǎn)化期望的宿主細(xì)胞。標(biāo)記基因可以用于鑒定轉(zhuǎn)化體，但是希望的是確定那些細(xì)胞含有重組DNA分子，哪些含有自我連接的載體分子。這可以通過利用克隆載體來實(shí)現(xiàn)，所述克隆載體中DNA片段的插入破壞了該分子上存15在的基因之一的完整性。由于該基因的功能的喪失，因而可以鑒定重組。鑒定成功地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的另一種方法涉及培養(yǎng)產(chǎn)自本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的導(dǎo)入的細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。細(xì)胞可以被收獲和裂解，利用例如Southern(1975)丄M/.98，503或Berent""/("1985)^o&c/z.3,208所描述的方法才企查它們的DNA內(nèi)容物中所述DNA的存在。做為選擇，當(dāng)重組DNA能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)時，成功的轉(zhuǎn)化可以通過公知的免疫學(xué)方法來確認(rèn)。例如，用表達(dá)載體成功地轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生顯示合適的釣交換功能的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第五個方面，提供了包含本發(fā)明的第二方面的核酸分子所編碼的多肽的多肽。如以上討論的，肽/多肽可以利用宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體從編碼核酸分子上表達(dá)。產(chǎn)生肽的可選擇的方法是化學(xué)合成。如Lu"0981)丄C&附.46,3433和其中的參考文獻(xiàn)所公開的，通過固相肽合成的Fmoc-聚酰胺方式，可以合成肽。9-藥基曱氧羰基(Fmoc)基團(tuán)提供了臨時的N-氨基保護(hù)。這種高度的堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)的重復(fù)裂解利用N,N-二曱基曱酰胺中的20%哌啶來進(jìn)行。側(cè)鏈官能團(tuán)可以作為它們的丁基醚(對于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸)、丁基酯(對于谷氨酸和天冬氨酸)、丁氧羰基衍生物(對于賴氨酸和組氨酸)、三苯甲基衍生物(對于半胱氨酸)和4-曱氧基-2,3,6-三曱基苯磺酰衍生物(對于精氨酸)來保護(hù)。當(dāng)谷氨酰胺或天冬酰胺是C-末端殘基時，利用4,4'-二曱氧基二苯曱基基團(tuán)來保護(hù)側(cè)鏈氨基官能團(tuán)。固相支持物是基于聚二曱基-丙烯酰胺聚合物，其由三種單體二曱基丙烯酰胺(主鏈-單體)、二丙烯酰乙烯二胺(交聯(lián)劑)和丙烯酰肌氨酸曱酯(官能化試劑)構(gòu)成。所使用的可裂解的肽-樹脂連接試劑是酸不穩(wěn)定的4-羥甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外，所有氨基酸衍生物作為它們的預(yù)先形成的對稱的肝衍生物來添加，天冬酰胺和谷氨酰胺利用反轉(zhuǎn)的N,N-二環(huán)己基-碳二亞胺/L-羥基苯并三唑介導(dǎo)偶聯(lián)操作來添加。所有的偶聯(lián)和脫保護(hù)反應(yīng)利用茚三酮、三硝基苯石黃酸或isotin測試過程來監(jiān)視。在合成完成時，肽從樹脂支持物上裂解，伴隨著通過用含有50%清除劑混合物的95%三氟乙酸處理來除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。通常使用的清除劑是乙二硫醇、苯酴、苯曱醚和水，確切的選擇取決于被合成的肽的組成氨基酸。通過在真空中蒸發(fā)來除去三氟乙酸，隨后用二乙醚研磨法提供粗肽。通過簡單的萃取操作除去任何存在的清除劑，在水相的凍干時提供了沒有清除劑的粗肽。用于肽合成的試劑一般可從Merck/Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,Nottingham,UK獲得。純化可以通過一些技術(shù)，例如空間排阻層析、離子交換層析和(主要地)反相高效液相層析的任何一種或組合來進(jìn)行。肽的分析可以使用薄層層析、反相高效液相層析法、酸水解后的氨基酸分析，和通過快原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析來進(jìn)行。在本發(fā)明的第六個方面，提供了包含以下的成套試劑盒(i)至少一種膜，其包括本發(fā)明的第五方面中定義的至少一種多肽和/或至少一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在其表面展示了本發(fā)明的第五方面定義的至少一種多肽；(ii)固相支持物或溶液，在所述固相支持物可以固定所述至少一種膜和/或所述至少一種細(xì)^M所述溶液可以懸浮所述至少一種膜和/或所述至少一種細(xì)胞；(iii)多孔的平板；(iv)鉤敏感性檢測系統(tǒng)(例如，染料)以及(v)使用所述試劑盒的說明書在本發(fā)明的第七個方面，提供了本發(fā)明的第一方面的步驟(i)中分離的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于特征為過度的色素沉著和/或降低的色素沉著的疾病的治療，和/或在陽光誘導(dǎo)的皮膚損傷的預(yù)防中的用途。優(yōu)選地，提高釣運(yùn)動的化合物可以用于藥物的制造，所述藥物用于治療特征為降低的色素沉著的疾病和/或用于陽光誘導(dǎo)的皮膚損傷的預(yù)防。做為選擇，降低鈣運(yùn)動的化合物可以用于藥物的制造，所述藥物用于特征為提高的色素沉著的疾病的治療。17在本發(fā)明的第八個方面，提供了本發(fā)明的第一方面的步驟(i)中分離的化合物在化妝品產(chǎn)品的制造中的用途，所述化妝品產(chǎn)品用于提高和/或降低皮膚色素沉著。優(yōu)選地，提高鈣運(yùn)動的化合物可以用于化妝品產(chǎn)品的制造，所述化妝品產(chǎn)品用于提高皮膚色素沉著。做為選擇，降低釣運(yùn)動的化合物可以用于化妝品產(chǎn)品的制造，所述化妝品產(chǎn)品用于降低皮膚色素沉著。利用本發(fā)明的方法鑒定和分離的化合物的用途可以是作為NCKX5功能的抑制物或活化物。NCKX5的抑制物可以用作色素沉著抑制物，例如，在深色皮膚中，交換器的抑制作用將會降低色素產(chǎn)生并且皮膚顏色變淺，其在某些亞洲社會是期望的。這些抑制物還可以增強(qiáng)皮膚中的UV依賴性維生素D合成，因?yàn)楹谏氐慕档蛯档推つw中維生素D的UV依賴性合成的黑色素誘導(dǎo)的封阻，其一般具有健康益處，包括對骨骼，例如，隨著時間的過去改善和/或防止骨質(zhì)疏松癥的益處。反之，活化交換器的成分可以用于增強(qiáng)皮膚中的色素產(chǎn)生。例如，具有淺色皮膚的消費(fèi)者可以獲得天然的棕黃色，而沒有來自日光照射的風(fēng)險(例如，灼傷和與之相關(guān)的不適、皮膚老化以及皮膚癌)?；罨镆部梢允褂米攸S色化產(chǎn)品來為皮膚預(yù)備之后的日光照射，所謂的曬前處理。這種棕黃色化產(chǎn)品的使用可以降低光照老化的長時間影響，因而將間接地具有皮膚老化益處。例如，皺紋、氣色不好、松弛、細(xì)紋、老年斑、色斑色素沉著可以凈皮降4氐。對UV和/或可見光特別敏感的個體，可以使用棕黃色化產(chǎn)品來在他們外出時更好地防護(hù)日光照射；例如，患有卟啉癥或著色性干皮病的患者。這些活化物的保護(hù)可以擴(kuò)展到不適合日光照射的個體，例如，對皮膚癌特別敏感的人，例如，是由于缺陷性的DNA修復(fù)機(jī)制或光毒性反應(yīng)。SLC24A5的抑制物和活化物也可以用于改變皮膚和/或毛發(fā)色素的色素沉著或組成，從而改變皮膚和/或毛發(fā)顏色。SLC24A5的抑制物和活化物也可以用于動物中的色素沉著，從而使動物的皮毛或皮膚顏色變淺或變深。動物中色素沉著的利用可以從動物對抗曬傷的保護(hù)到改變皮膚色素沉著用于織物原料例如皮革。在本發(fā)明的笫九個方面，提供了通過本發(fā)明的第一方面的方法鑒定的化合物。使用的術(shù)語的含義術(shù)語"核普酸序列"或"核酸"或"多核苷酸"或"寡核苷酸"可互換地使用，是指核苷酸的異聚物或這些核香酸的序列。這些術(shù)語也是指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈的或雙鏈的，可以代表有義或反義鏈，是指肽核酸(PNA)或是指任何DNA樣或RNA樣材料。在此處的序列中，A是腺噤呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鳥嘌呤，N是A、C、G或T(U)。期待的是，當(dāng)多核苷酸是RNA時，本文提供的序列中的T(胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶)替換。一般地，本發(fā)明提供的核酸片段可以從基因組的片段和短的寡核苷酸連接物，或從一系列的寡核苷酸，或從單獨(dú)的核苷酸來組裝，以提供能夠在重組轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)的合成核酸，所述重組轉(zhuǎn)錄單位包含來自微生物或病毒操縱子或真核基因的調(diào)節(jié)元件。術(shù)語"多肽"或"肽，，或"氨基酸序列，，是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列或其片段，是指天然發(fā)生的或合成的分子。多肽"片段"、"部分"或"區(qū)段"是至少約5個氨基酸的氨基酸殘基的延伸，優(yōu)選至少約7個氨基酸，更優(yōu)選的至少9個氨基酸，最優(yōu)選至少17個或更多個氨基酸。要有活性，任何多肽必須具有足夠的長度來顯示生物學(xué)和/或免疫活性。如本文使用的，術(shù)語"功能等效的變體"是指一種蛋白質(zhì)，其中在一個或多個位置上有保守的或非保守的氨基酸插入、刪除或替換，只要這種改變產(chǎn)生了一種蛋白質(zhì)，它的基本性質(zhì)，例如酶活性(活性的類型和比活性)、耐熱性、某些pH范圍下的活性(pH穩(wěn)定性)沒有顯著改變。在上下文中"顯著地，，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將會說，該變體的性質(zhì)仍然是不同的，但相對于最初的蛋白質(zhì)不會是非顯而易見的。"保守性替換，，是預(yù)定的組合，例如Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;以及Phe、Tyr。功能等效的變體可以指核苷酸和氨基酸序列，例如，突變體序列，其不同于參考序列在于一個或多個替換、刪除或添加，它的凈效果不產(chǎn)生參考序列和目標(biāo)序列之間的有害的功能差異。一般地，這種基本上等效的序列與本文列出的序列之一的不同不超過約35%(即，與相應(yīng)的參考序列相比，在基本上等效的序列中單獨(dú)的殘基替換、添加和/或刪除的數(shù)目處于基本上等效的序列中殘基的總數(shù)是約0.35或更少)。這樣的序列被稱為與所列序列具有65%的序列同一性。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的基本上等效的序列，例如，突變體，不同于所列序列不超過30%(70%的序列同一性)；在這個實(shí)施方式的變體中，不超過25%(75%的序列同一性)；在這個實(shí)施方式的進(jìn)一步的變體中，不超過20%(80%的序列同一性)，在這個實(shí)施方式的進(jìn)一步的變體中，不超過10%(90%的序列同一性)，在這個實(shí)施方式的進(jìn)一步的變體中，不超過5%(95%的序列同一性)。根據(jù)本發(fā)明的基本上等效的氨基酸序列，例如突變體，優(yōu)選地具有與所列氨基酸序列的至少80%的序列同一性，更優(yōu)選地至少85%的序列同一性，更優(yōu)選地至少90%的序列同一性，更優(yōu)選地至少95%的序列同一性，更優(yōu)選地至少98%的序列同一性，和最優(yōu)選地至少99%的序列同一性。本發(fā)明的基本上等效的核酸分子可以具有更低百分比的序列同一性，考慮到，例如，遺傳密碼的冗余或簡并性。優(yōu)選地，所述核酸分子具有至少約65%的同一性，更優(yōu)選地至少約75%的同一性，更優(yōu)選地至少約80%的序列同一性，更優(yōu)選地至少85%的序列同一性，更優(yōu)選地至少90%的序列同一性，更優(yōu)選地至少約95%的序列同一性，更優(yōu)選地至少98%的序列同一性，和最優(yōu)選地至少99%的序列同一性。對于本發(fā)明來說，具有基本上相等的生物學(xué)活性和基本上相等的表達(dá)特征的序列被認(rèn)為是基本上等效的。兩種多肽之間的序列同一性百分比可以利用適合的計(jì)算機(jī)程序來確定，例如，威斯康星大學(xué)遺傳計(jì)算小組的GAP程序，要理解的是，同一性百分比是相對于其序列已經(jīng)被最佳地對準(zhǔn)(aligned)的多肽來計(jì)算的。做為選擇，對準(zhǔn)可以利用ClustalW程序(Thompson"a/."1994)M/c/e,c爿"A22,4673-80)進(jìn)行。使用的參數(shù)可以是如下的快速配對對準(zhǔn)參數(shù)K-重數(shù)(字)大小1,窗口大小5,缺口罰分3，頂部對角線的數(shù)目5。計(jì)分方法x百分比。多對照參數(shù)缺口開口罰分10,缺口延長罰分0.05。計(jì)分矩陣BLOSUM。如本文使用的術(shù)語"功能等效的融合體"表示本發(fā)明的多肽與另一個多肽可操作地連接。在融合蛋白內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的全部或部分。在一個實(shí)施方式中，融合蛋白包含根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的至少一個生物學(xué)活性部分。在另一個實(shí)施方式中，融合蛋白包含根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的至少兩個生物學(xué)活性部分。在所述融合蛋白中，術(shù)語"可操作地連接"意圖表明根據(jù)本發(fā)明的多肽和另一種多肽是相互按閱讀框(in-frame)融合的。多肽可以融合到N-末端或C-末端，或融合到中間。本發(fā)明的多肽的基本性質(zhì)沒有顯著地改變。"顯著地，，在本文中是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將會說，變體的性質(zhì)仍然是不同的，但是相對于最初的蛋白質(zhì)的性質(zhì)將不是非顯而易見的。如本文使用的術(shù)語"功能等效的衍生物"代表親本多肽的片段或修飾的版本?？梢酝ㄟ^添加一個或多個天然或非天然發(fā)生的氨基酸或其他分子，例如，來便于將所述多肽聯(lián)結(jié)到另一個肽或多肽，聯(lián)結(jié)到大的載體蛋白或固相支持物上，或它插入膜中(例如，氨基酸酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和其衍生物，NHr乙?；駽OOH-末端酰胺基，等等)來修飾衍生物，并且至少一種親本多肽的基本性質(zhì)沒有顯著地改變。"顯著地，，在本文中是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將會說，變體的性質(zhì)仍然是不同的，但是相對于最初的蛋白質(zhì)的性質(zhì)將不是非顯而易見的。如本文使用的術(shù)語"純化的"或"基本上純化的"表示所指的核酸或多肽基本上沒有其他的生物學(xué)大分子，例如，多核苷酸、蛋白質(zhì)，等等。在一個實(shí)施方式中，多核苷酸或多肽被純化，從而它構(gòu)成了存在的所指生物學(xué)大分子按重量的至少95%,更優(yōu)選地按重量至少99%的(但是可以存在水、緩沖液和其他小分子，特別是分子量低于1000道爾頓的分子)。如本文使用的術(shù)語"分離的"是指分離自至少一種其他成分(例如，核酸或多肽)的核酸或多肽，所述其他成分與所述核酸或多肽在它的天然來源中一同存在。在一個實(shí)施方式中，所述核酸或多肽僅存在溶劑、緩沖液、離子或通常在同樣溶液中存在的其他成分。術(shù)語"分離的，，和"純化的，，不包括在它們的天然來源中存在的核酸或多肽。術(shù)語"重組"，當(dāng)在本文中使用時是指多肽或蛋白質(zhì)，意思是多肽或蛋白質(zhì)來自于重組(例如，微生物、昆蟲或哺乳動物)表達(dá)相同。"微生物"是指重組多肽或蛋白質(zhì)在細(xì)菌或真菌(例如，酵母)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。作為產(chǎn)物，"重組微生物"定義了多肽或蛋白質(zhì)基本上沒有天然的內(nèi)源物質(zhì)，并且沒有伴隨著相關(guān)的天然糖基化。在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物例如大腸桿菌中表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)將沒有糖基化修飾；在酵母中表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)將具有一般不同于哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的糖基化模式。術(shù)語"表達(dá)載體"是指質(zhì)粒或噬菌體或病毒或載體，用于從DNA(RNA)序列表達(dá)多肽。表達(dá)工具可以包含轉(zhuǎn)錄單位，所述轉(zhuǎn)錄單位包含(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳元件，例如，啟動子和通常的增強(qiáng)子，(2)被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列；和(3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列。被設(shè)計(jì)用于在酵母或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的結(jié)構(gòu)單位優(yōu)選地包括允許翻譯的蛋白質(zhì)^L宿主細(xì)胞細(xì)胞外分泌的前導(dǎo)序列。做為選擇，當(dāng)重組蛋白質(zhì)沒有前導(dǎo)區(qū)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列地表達(dá)時，它可以包括氨基末端曱疏氨酸殘基。這個殘基隨后可以或可以不從表達(dá)的重組蛋白質(zhì)上裂解來提供最終產(chǎn)物。術(shù)語"區(qū)室"是指不連續(xù)的3D區(qū)域，其可以含有或不含有溶液和/或固體物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，區(qū)室可以包括細(xì)胞的內(nèi)側(cè)、環(huán)繞細(xì)胞的溶液、膜的一側(cè)含有的空間，例如，多孔平板上的反應(yīng)孔。術(shù)語"膜"表示分隔兩個環(huán)境的、任何薄的、一般是平面的結(jié)構(gòu)或材料。本發(fā)明的膜包括生物膜9脂雙分子層膜)例如細(xì)胞膜、細(xì)胞器的膜或能夠支持插入的蛋白質(zhì)的人工膜，例如聚合的膜。術(shù)語"改變組成，，表示通過利用NCKX的抑制物和活化物來改變毛發(fā)和/或皮膚的顏色和/或黑色素組成。毛發(fā)和/或皮膚的黑色素組成通過組織中存在的真黑色素和褐黑色素的比例來確定。優(yōu)選的實(shí)施方式現(xiàn)在將參考以下附圖來描述包含了本發(fā)明的某些優(yōu)選的方面的實(shí)例，其中22附圖l-NCKX5(SLC24A5)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參考序列。顯示與皮膚色素沉著相關(guān)的Ala/ThrSNP的位置的NCKX5的核苦酸和氨基酸序列。附圖2-與人類皮膚色素沉著相關(guān)的等位基因的分布。顯示等位基因的頻率和相關(guān)皮膚顏色的圖。參考等位基因是含有蘇氨酸的，可選擇的拷貝是含有丙氨酸的。因此，丙氨酸等位基因顯示了主要存在于深色皮膚中。附圖3-NCKX5同源性和Ala/Thr變異的位置附圖4-利用修飾的NCKX2的釣排出。附圖顯示了由于NCKX2分子的兩種變體(Ala和Thr)的4丐排出的數(shù)量，所述NCKX2分子已經(jīng)被修飾成相似于NCKX5。NCKX2中的Alal77(相當(dāng)于NCKX5中的Alalll)(深色皮膚等位基因)與提高的鉀交換相關(guān)。附圖5-黑素細(xì)胞的染色。用NCKX5抗血清染色的黑素細(xì)胞顯示了斑點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)染色和核周染色。附圖6-pIE1/1534載體圖附圖7-pcDNA3.1載體圖附圖8-Myc標(biāo)記化的人類NCKX5核普酸序列附圖9-Myc標(biāo)記化的人類NCKX5氨基酸序列附圖10-Myc和1D4標(biāo)記化的人類NCKX5核苦酸序列附圖ll-Myc和1D4標(biāo)記化的人類NCKX5氨基酸序列附圖12-Myc標(biāo)記化的人類NCKX2/NCKX5嵌合體核苷酸序列附圖13-Myc標(biāo)記化的人類NCKX2/NCKX5嵌合體氨基酸序列附圖14-在C-末端具有ID4標(biāo)記的Myc標(biāo)記化的人類NCKX2/NCKX5嵌合體核酸分子附圖15-在C-末端具有ID4標(biāo)記的Myc標(biāo)記化的人類NCKX2/NCKX5嵌合體氨基酸序列附圖16-NCKX5表達(dá)的Western印跡(包括NCKX5和NCKX5/NCKX2嵌合體以及1D4和myc標(biāo)記化的版本)附圖17-在擊掌昆蟲細(xì)胞和HEK細(xì)胞中NCKX5表達(dá)的Western印跡(包括NCKX5和NCKX5/NCKX2嵌合體以及1D4和myc標(biāo)記化的版本)。23附圖18-在B16中Na+劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca"釋放。通過比色杯方法4企測。附圖19-在B16中Na+劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca^釋放。-通過96孔分析來4企測。附圖20-在B16中Na+劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca^釋放。通過96孔方法在深色人類黑素細(xì)胞中劑量依賴性Na+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca"釋放。附圖21-在B16中Na+劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca^釋放。通過共焦顯微鏡;險查來檢測。附圖22-在B16中Na+劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca^釋放。在l]igRNA的逆轉(zhuǎn)錄之后實(shí)時PCR檢測的、B16細(xì)胞中SLC24和SLC8的表達(dá)。附圖23-異源NCKX2分析。異源NCKX2分析擴(kuò)大到高通量篩選形式，在Amaxa96孔Nucleofection設(shè)備中測試。附圖24-顯示SLC24A5水平的降低的表。5個獨(dú)立的siRNA雙螺旋(由Invitrogen設(shè)計(jì))在人類原代黑素細(xì)月包中降4氐SLC24A5mRNA水平達(dá)95%或更多。這種效應(yīng)可以用重新轉(zhuǎn)染維持直到10天(數(shù)據(jù)未顯示)。附圖25-SLC24A5mRNA的敲低(knockdown)降低人類黑素細(xì)胞的色素SLC24A5敲低、隨后是細(xì)胞數(shù)量的歸一化(normalisation)(通過犁刀計(jì)數(shù))和離心來團(tuán)化黑素細(xì)胞，提供了SLC24A5涉及黑色素生成過程的定性的證據(jù)。'附圖26-SLC24A5敲低后的ICC分析利用深色的原代人類黑素細(xì)胞(Cascade)進(jìn)行了5天敲低(利用雙螺旋492和對照)。用于檢測的初級抗體兔抗NCKX5細(xì)胞質(zhì)環(huán)體(利用肽序列DEGQPFIRRQSRTDSG產(chǎn)生)和綿羊pAb抗TGN46;標(biāo)記通過AlexaFluor488抗兔和633抗綿羊IgG?？筃CKX5多克隆抗體定位在TGN內(nèi)。附圖27-黑色素生成的定性評定在輕微著色的人類黑素細(xì)胞(復(fù)制x3)中，用雙螺旋(492)注意到處理后黑色素含量的降低。附圖28-敲低后NCK5的Western印跡分析利用Western印跡，我們研究了siRNA介導(dǎo)的敲低后5天的NCKX5蛋白質(zhì)表達(dá)(測試了所有5種siRNA雙螺旋和對照)。還使用Western印跡來評估相同的樣品中酪氨酸酶(tyr)的表達(dá)和加工(成熟)。SDS-PAGE(對于NCKX5為10%PA,對于tyr為4-12%,5pg蛋白質(zhì)/泳道)。A)NCKX5的Western印跡通過兔抗NCKX5pAb(抗C-末端肽)來檢測。B)tyr的Western印跡，通過山羊pAb(SantaCruz)。1=沒有處理，2=亂序siRNA對照,3-7=siRNA185、260、301、492、1110。Western印跡A)顯示了在對照孔中約42和44KDa(顯著地小于NCKX5的預(yù)測的m.w.)2個條帶。這些條帶在使用SLC24A5特異性雙螺旋的樣品中沒有(泳道3-7)。可能的是，雙聯(lián)體代表了另外的SLC24A5剪接變體的存在。在敲低后酪氨酸酶的表達(dá)和加工(B)表明，NCKX5沒有^艮大地改變酪氨酸酶的表達(dá)和/或熟化，酪氨酸酶是黑色素生物合成的限速酶。附圖29-SLC24A5mRNA敲低抑制了B16中的黑色素合成用siRNA雙螺旋或?qū)φ辙D(zhuǎn)染細(xì)胞(Lipofectamine2000)8小時。在分析之前培養(yǎng)細(xì)胞另外3天。除去培養(yǎng)基，通過OD450定量黑色素。在使用l%tritonxlOO裂解之前，利用Wstl增殖試劑(Roche)測量細(xì)胞生存力。通過BCA分析測定每個孔的蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)(各自一式四份)連續(xù)地重復(fù)3次。3種siRNA雙螺旋(256、567和762)可見地降低了黑色素合成。附圖30-小鼠SLC24A5siRNA雙螺旋縮小mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平所有5種siRNA雙螺旋顯示了能夠在小鼠B16黑素細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)SLC24A5mRNA敲低。3種雙螺旋顯示了能夠在測試條件下降低mRNA水平超過80%。用50nM的siRNA雙螺旋轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Lipofectamine2000)8小時。在收獲和實(shí)時PCR分析之前，細(xì)胞培養(yǎng)另外24小時。附圖31-SLC24A5siRNA雙螺旋和B16細(xì)胞中的生存力評定處理后的細(xì)胞生存力和蛋白質(zhì)含量測定可以幫助鑒定B16黑素細(xì)胞中SLC24A5調(diào)節(jié)色素產(chǎn)生的方式。在每個實(shí)驗(yàn)結(jié)束時的細(xì)胞生存力評定暗示了與2種雙螺旋(256和567)的使用相關(guān)的顯著的毒性。這個結(jié)論得到蛋白質(zhì)含量獲得的數(shù)據(jù)的支持。在測試的實(shí)驗(yàn)條件下，雙螺旋762看起來降低了色素產(chǎn)生而不影響生存力。附圖32-在各種細(xì)胞中鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)釣釋放100,000細(xì)胞在96孔平板中一式三份打板過夜。如方法中所描述的測量響應(yīng)于鈉的細(xì)胞內(nèi)4丐釋放。數(shù)據(jù)減去背景，皂苷歸一化以用于比較。數(shù)據(jù)是3個副本的平均值。附圖33-在各種細(xì)胞中鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)4丐釋放100,000細(xì)胞在96孔平板中一式三份打板過夜。如方法中所描述的測量響應(yīng)于鈉的細(xì)胞內(nèi)4丐釋放。數(shù)據(jù)減去背景，皂普歸一化以用于比較。數(shù)據(jù)是3個副本的平均值。實(shí)施例1-在S.Asian世系(ancestry)的個體中NCKX5的分布研究已經(jīng)顯示了，在具有SAsian世系的UK志愿者的個體中，在NCKX5的不同等位基因版本和皮膚顏色之間的相關(guān)性(在申請人的共同待決US申請中描述)。NCKX5具有編碼處在氨基酸位置111處的變異的單核苷酸多態(tài)性，在深色皮膚中存在著Alalll氨基酸殘基的優(yōu)勢，而在淺色皮膚中，存在著Thrill氨基酸殘基的優(yōu)勢。附圖2顯示了在深色和淺色皮膚類型中這兩種等位基因的分布，來自總共230位南亞血統(tǒng)的志愿者。利用色度計(jì)測量未暴曬的皮膚來選擇志愿者。色度計(jì)的LH賣數(shù)給出了皮膚的反射光的直接讀出，其隨后與皮膚的黑色素含量直接相關(guān)。落入皮膚顏色分布的20%"極端"末尾的志愿者進(jìn)行基因分型。因而，這些志愿者具有與平均值相比的更淺或更深的皮膚顏色。NCKX5的氨基酸111處的非同義多態(tài)性的等位基因頻率差異是39%,具有發(fā)現(xiàn)錯誤的極低的概率(錯誤發(fā)現(xiàn)率-9.7x10—13)。實(shí)施例2-NCKX5的活性通過突變NCKX交換器(NCKX2)來研究了NCKX5的活性和兩種等位基因(Alalll和Thrill)對鈉-鉀/鈣交換的影響，所述NCKX交換器被發(fā)現(xiàn)在自然中插入到視桿光受體細(xì)胞膜中，更緊密地相似于NCKX5。在Winkfeinwa/.(2003)Biochemistryvol42pg543-552中以及根據(jù)Kang"(2005)JBiolchem..vol280pg6823-6833研究它們的影響中描述了這些構(gòu)建體的產(chǎn)生方法。置111)來修飾成兩種形式，即，一種NCKX2形式具有Alal77,另一種形式具有Thrl77。(對于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中變體的位置以及NCKX家庭的序列同一性的比較，參見附圖3)表達(dá)了修飾的NCKX2，測量的該分子的鈣交換功能。發(fā)現(xiàn)的是，同與深色皮膚相關(guān)的Alal77版本相比，與淺色皮膚相關(guān)的Thrl77版本顯示了顯著降低的鈣交換。(參見附圖4)實(shí)施例3-NCKX5轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和定位分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)方法使用Taqman探針(購自AppliedBiosystems)利用實(shí)時PCR測量mRNA水平，并針對持家基因人類轉(zhuǎn)錄因子IIDTATA框結(jié)合蛋白(huTBP)來歸一化。預(yù)先設(shè)計(jì)的NCKX和證實(shí)有效的sybr引物來自Qiagen:5196、5197、5198、5199、5200、5201、5202、5203、5204、5205、5206、5207。使用的引物/探針是NCKX5ABI引物/探針集hs01385406—gl，跨越外顯子3-4,FAM-連接的。huTBPABI引物/探針集4326322E,VIC-連接的。材料cDNA來自培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分離自各種膚色的印度人來源的供體，以及來自白種人和黑人供體的商業(yè)上的來源。來自印度志愿者的cDNA從皮膚活檢獲得。商業(yè)上來源的cDNA來自不同的人體組織(腦、結(jié)腸、腎臟、肺、肌肉、胃和子宮)。發(fā)現(xiàn)27檢測所有測試的培養(yǎng)的黑素細(xì)胞和皮膚活檢物中的NCKX5mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。皮膚活檢物中的NCKX5mRNA表達(dá)水平看起來與測試的小的群組(n=22)中膚色差異、人種來源或SLC24A5基因型不相關(guān)。利用Taqman探針通過實(shí)時PCR在非皮膚組織(腦、結(jié)腸、腎臟、肺、肌肉、胃和子宮)中沒有檢測到NCKX5mRNA。利用Taqman探針由實(shí)時PCR在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞(即，除了黑素細(xì)胞外的皮膚細(xì)胞)中沒有檢測到SLC24A5mRNA,然而，利用Sybr綠4企測方法(利用qiagenquantitect試劑盒使用Bioradicycler的快速的PCR方法)的證據(jù)是，低水平的SLC24A5mRNA可以存在于真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中(與來自同一供體的培養(yǎng)的黑素細(xì)胞低得多的水平)。在培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中，NCKX5mRNA水平比NCKX1(SLC24A1)mRNA水平高。利用Sybr綠檢測方法，在培養(yǎng)物的黑素細(xì)胞中檢測到NCKX4(SLC24A4)和NCKX6(SLC24A6)mRNA,但是水平低于NCKX5或NCKX1(SLC24A1)。蛋白質(zhì)定位工具針對來自NCKX5的2個肽片段(一個處在預(yù)測的大的親水性的環(huán)體中，一個處在蛋白質(zhì)的羧基末端)產(chǎn)生兔多克隆抗血清。針對所述肽將抗體親和力純化。通過Eurogenetec利用以下方案產(chǎn)生抗體用兩種肽片段初次免疫2只兔子，之后是在初次免疫之后2、4和8周2次隨后的強(qiáng)化免疫。肽結(jié)合到匙孔血藍(lán)蛋白，在最初的免疫后12周收集最后的出血。在親和純化之后，每種肽結(jié)合到spharose,5mL最終的出血血清與之分批孵育，裝入柱中，在PBS中洗滌，并洗脫到100mM甘氨酸-HClpH2.5中。洗脫物在交換到PBSA中pH9的lMTrisabd緩沖液上中和。利用驢抗兔Alexa-fluor488(Invitrogen)進(jìn)行二次檢測。結(jié)合的抗體的可視化利用共焦熒光顯微術(shù)來進(jìn)行。材料來自白種人(caucasian)或黑人(negroid)供體的培養(yǎng)的原代人類黑素細(xì)胞在玻璃蓋片上生長，在2%多聚甲醛中固定，用0.5%皂苷滲透化。發(fā)現(xiàn)沒有質(zhì)膜染色的證據(jù)表明，NCKX5不定位在質(zhì)膜中。點(diǎn)狀的染色在整個細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。表明黑素細(xì)胞中NCKX5的存在。(對于染色參見附圖5)實(shí)施例4-NCKX5表達(dá)載體的構(gòu)建所有的克隆插入到任一載體pEIA和pcDNA3.1的XhoI/NotlDNA限制性位點(diǎn)之間。pIEA作為TriplExpress載體獲自Cytostore(www.cytostore.com),它的結(jié)構(gòu)和序列在附圖6中顯示。PCDNA3.1載體可以購自Invitrogen(www.invitrogen.com)，它的結(jié)構(gòu)在附圖7中示出。編碼NCKX5氨基酸序列(氨基酸63-64EF;(GAGTTT))的DNA利用標(biāo)準(zhǔn)重組方法^f奮飾來導(dǎo)入EcoRIDNA限制性位點(diǎn)(GAATTC)。EC0R1限制性位點(diǎn)的插入不改變氨基酸編碼序列，但是導(dǎo)入了限制性位點(diǎn)用于任意插入標(biāo)記。在某些克隆中，編碼myc標(biāo)記蛋白質(zhì)序列(QKLISEEDL)的核酸分子被直接插入新插入的EC0R1限制性位點(diǎn)的上游，即，在N末端的區(qū)域中。myc標(biāo)記—皮單克隆抗體識別，其可以用于Western印跡來鑒定新合成的蛋白質(zhì)。編碼1D4標(biāo)記的核酸分子直接添加到NCKX5序列的末端的終止密碼子之前，即，在C末端。1D4標(biāo)記凈皮單克隆抗體識別，其也可以用于Western印跡來鑒定新合成的蛋白質(zhì)。hsNCKX2的N-末端序列從位置1(M)到120(Q),加上WT序列的位置84處的myc標(biāo)記，利用EcoRI限制性位點(diǎn)連接到hsNCKX5的部分構(gòu)建體的氨基酸63。如上所述制備的克隆的序列在810到15中給出。實(shí)施例5-NCKX5在宿主細(xì)胞中的表達(dá)方法昆蟲HighFiveTM細(xì)胞利用合適的轉(zhuǎn)染方法，即，使用Farrell"(1998)Bio/Technology60pp656-663所描述的鱗翅昆蟲表達(dá)系統(tǒng)方法，用實(shí)施例l的載體轉(zhuǎn)染，例如，編碼全長人類NCKX5蛋白質(zhì)、連接到編碼人類NCKX2信號肽的前導(dǎo)序列。收集HighFive細(xì)胞，用150mMNaCl、20mMHepes(pH7.4)、80mM蔗糖和200mMEDTA洗滌兩次。最終的團(tuán)粒重懸浮在200mL水冷的、含有1%TritonX-100、0.5。/。脫氧膽酸鹽、140mMNaC1、25mMTris(pH7.5)、100mMEDTA和蛋白酶抑制物片劑(RocheMolecularBiochemicals產(chǎn)品號1836170)的放射免疫沉淀緩沖液中，在水上孵育20分鐘。樣品在微離心機(jī)中在20,0003g旋轉(zhuǎn)沉淀5分鐘。取出上清液，利用Bradford染料-結(jié)合操作(Bio-Rad)分析蛋白質(zhì)濃度。在所有蛋白質(zhì)分析中，牛血清白蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)樣品在8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，在含有192mM甘氨酸、20。/o曱醇和0.05o/。SDS的25mMTris緩沖液、pH8.3中，用GelcodeBlue(Pierce)染色或轉(zhuǎn)移到硝化纖維(Bio-Rad)上。對于Western印跡,膜在TBST(10mMTris、pH8.0、100mMNaCl、0.05%吐溫20)和10%脫脂乳中封閉，在TBST中簡單清洗，隨后在室溫下與添加1%的TBST中的初級抗體孵育lh(1:20稀釋度的PMe-lB3或10mg/ml的6H2抗體)。在洗滌之后，膜用1:5000稀釋度的結(jié)合到辣根過氧化酶的綿羊抗小鼠免疫球蛋白在加有1%skim的TBST中孵育lh，然后再次洗滌。利用LumiGlo化學(xué)發(fā)光的試劑(NewEnglandBiolabs)進(jìn)行免疫4全測。HEK293細(xì)胞在EMEM(Earle，s最低必需培養(yǎng)基)在37°C、5%C02在T175cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)，所述燒瓶含有購自Biowhittaker的丙酮酸鈉和非必需氨基酸，以及含有購自Sigma的10。/。FCS(胎牛血清)和2mML-谷氨酰胺。例如所描述的磷酸釣沉淀轉(zhuǎn)染方法，用實(shí)施例2中制造的載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，例如，編碼與編碼人類NCKX2信號肽的前導(dǎo)序列連接的截短的人類NCKX5蛋白質(zhì)。表達(dá)測試的結(jié)果在附圖16和17的Western印跡中顯示。這些印30跡顯示了，測試細(xì)胞表達(dá)了各種標(biāo)記化形式的NCKX5和NCKX2/NCKX5嵌合體。實(shí)施例6-利用NCKX5分析的測試化合物分析材料含有丙酮酸鈉和非必需氨基酸的Earle，s最低必需培養(yǎng)基(EMEM)購自Biowhittaker。胎牛血清(FCS)、Dulbecco，s的必需培養(yǎng)基(DMEM)、L-谷氨酰胺、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、胰蛋白酶、二甲亞砜(DMSO)購自Sigma。Fluo4-AM釣敏感染料購自MolecularProbes。玻璃底的96孑L平氺反購自Greiner。FLEXstation和FLEXstation消耗品購自MolecularDevices。細(xì)胞培養(yǎng)HEK293細(xì)胞在EMEM(Earle，s最低必需培養(yǎng)基)在37°C、5%C02在T175cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)，所述燒瓶含有購自Biowhittaker的丙酮酸鈉和非必需氨基酸，以及含有購自Sigma的10。/qFCS(胎牛血清)和2mML-谷氨酰胺。用NCKX2/NCKX5嵌合體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞利用合適的轉(zhuǎn)染方法，例如先前所描述的(KangWa/(2005)JBiolChem280(8):6823-6833)磷酸4丐沉淀，用編碼連接到編碼人類NCKX2信號肽的前導(dǎo)序列的全長人類NCKX5蛋白質(zhì)的嵌合體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，以使蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上表達(dá)。在轉(zhuǎn)染之后，HEK293細(xì)胞以合適的細(xì)胞密度打板在玻璃底96孔平板上，例如，2xl()S個細(xì)胞每孔，并在37。C、5%(302下粘附過夜。分析過程粘附的細(xì)胞用溫暖的PBS洗滌，用溶于DMEM中、高達(dá)10pM的4丐敏感性染料Fluo4-AM孵育直到lh。在染料加載之后，通過先前描述的(KangW2005)用分析洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞兩次來除去未水化的染料。培養(yǎng)基替換為耗盡Na+的分析緩沖液來觸發(fā)反向Ca2+/Na+交換(Kangefa/2005)。細(xì)胞然后在37。C暴露于來自化合物庫的各種劑量的化合物持續(xù)不同的時間。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到FLEXstation,并用CaCl2、隨后是KC1處理，來啟動鉀調(diào)節(jié)的Ca"/Na+交換。實(shí)時地測量細(xì)胞內(nèi)熒光。在反應(yīng)平臺期，皂香添加到細(xì)胞中來測定最大熒光作為染料加載對照。此外，這種方法可以通過向測試細(xì)胞添加改變的4丐或鉀濃度來用于評定鈣或鉀依賴性。這個實(shí)驗(yàn)可以包括用熒光團(tuán)報告物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，來對照轉(zhuǎn)染效力。對于數(shù)據(jù)分析，從測試細(xì)胞中減去未處理的空白細(xì)胞的熒光。未知樣品中觀'J量的鈣流動的數(shù)量通過與連續(xù)稀釋的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定。確定與未處理的細(xì)胞相比測試化合物對鈣流動數(shù)量的影響，記錄活性的任何提高或降低。該分析可以評估與未處理的細(xì)胞相比測試化合物對最大熒光、熒光速率、Vmax、Km或最大熒光的時間的影響。確定發(fā)揮效果的測試化合物可以在寬的濃度范圍上重新測試來確認(rèn)效力。分析的自動化該分片斤可以人工地進(jìn)4亍，4旦也可以是自動4t的，例如，利用Hamilton機(jī)器人系統(tǒng)。一旦轉(zhuǎn)染和打板完成，機(jī)器人能夠進(jìn)行所有的洗滌、染料加載、平板的溫度依賴性孵育、化合物添加和平板向FLEXstation的轉(zhuǎn)移。對于高通量篩選，分析可以^皮修改為在384孔或更多孔的平板中使用。實(shí)施例7-小鼠B16細(xì)胞中NCKX活性的研究所有材料購自Sigma，除了B16鼠黑色素瘤細(xì)胞(ATCC);Fluo4畫AM,RiboGreen(MolecularProbes);thapsigargin(SantaCruz);Greiner黑色玻璃底96孔平板(GreinerBio-One);StealthRNAi雙螺旋，Lipofectamine2000,Opti國MEM(Invitrogen);Rneasy總RNA提取試劑盒，QuantiTectPCR引物(Qiagen);第一股cDNA合成試劑盒(Roche);ibidi(x-flowslides(ibidiIntegratedBioDiagnostics);SYBRGreenPCR主混合物(Bio-Rad);細(xì)月包培養(yǎng)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FCS和2mML-谷氨酰胺的EMEM中在37°C、5%C02在T175cm2燒瓶中培養(yǎng)，利用胰蛋白酶-EDTA每周兩次繼代增殖。HEK293細(xì)胞在具有2mML-谷氨酰胺的EMEM中和調(diào)節(jié)到含有1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉，90%;熱鈍化的馬血清，10%的Earle，sBSS中培養(yǎng)。StealthRNAi雙螺旋對鼠SLC24A5的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時，B16細(xì)胞以25,000細(xì)胞/孔打板到48孔平板中。一式四份的細(xì)胞反應(yīng)孔用2pg/ml的Lipofectamine2000和把向SLC24A5或亂序?qū)φ盏?0nMStealthRNAi雙螺旋(來自Invitrogen)轉(zhuǎn)染。還僅用Lipofectamine或未處理的陰性對照進(jìn)行反應(yīng)。用Opti-MEM進(jìn)行所有的稀釋度。RNAi雙螺旋序列是雙螺旋370反義3'-UGAAAGUUGCACCUGCAACAUCCUG-5';正義5'-CAGGAUGUUGCAGGUGCAACUUUCA-3';雙螺旋370亂序?qū)φ辗戳x3'-UGACUAUUGACACGCGUCACAACUG-5';正義5'隱CAGUUGUGACGCGUGUCAAUAGUCA曙3';雙螺旋762反義3'-UUCAAUUCUCUCCUCCAUAGCUCUG國5'正義5'誦CAGAGCUAUGGAGGAGAGAAUUGAA畫3';雙螺旋762亂序?qū)φ辗戳x3'-UUCUCACUUACUCUCCUCGAUACUG畫5';正義5'-CAGUAUCGAGGAGAGUAAGUGAGAA-3'雙螺旋1265反義3'畫AUAUCAAACACAUUGGAUCCCACGA國5'正義5'-UCGUGGGAUCCAAUGUGUUUGAUAU-3';雙螺旋256反義3'-UAAUGAGGAAGUAGAUUACGAUACC-5'正義5'-GGUAUCGUAAUCUACUUCCUCAUUA-3';雙螺旋567反義3'國AUACACUGCACAGUCUCGGAAGAGG-5'正義5'-CCUCUUCCGAGACUGUGCAGUGUAU畫3'.細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑孵育6-8h,然后除去試劑并用補(bǔ)充有10%FCS和4mML-谷氨酰胺的無酚紅DMEM替換72h。在72h時，采集細(xì)胞用于生存力和總蛋白測定，分析上清液的黑色素產(chǎn)生。B16鼠黑色素瘤細(xì)胞的SLC8和SLC24mRNA分析在胰蛋白酶消化之后，根據(jù)廠家的說明書，利用RNeasymini試劑盒，以及柱上DNAse處理，從B16細(xì)胞提取總RNA。提取物的總濃度根據(jù)廠家的說明書利用RiboGreen測定，用BMGFluostarOptima平板讀取器測量熒光。未知樣品的吸光度值與具有15ng/)iil-l嗎1的動態(tài)范圍的七點(diǎn)參考曲線比較。根據(jù)廠家的說明書利用第一鏈合成試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄從1pg總RNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成。在20pl反應(yīng)中進(jìn)行RT，其中需要好過20pl的cDNA,進(jìn)行多次反應(yīng)，集中cDNA。然后利用Bio-RadiCycler用SYBRGreen檢測通過實(shí)時PCR分析SLC24mRNA表達(dá)。針對鼠SLC8A1-SLC8A3、鼠SLC24A1-SLC24A6和鼠GAPDH的外顯子-外顯子邊界的QuantiTectPCR引物購自Qiagen。通過cDNA的連續(xù)稀釋和熔化曲線分析確i^引物效力。利用Act方法相當(dāng)于GAPDHmRNA表達(dá)將目標(biāo)基因表達(dá)歸一化。參見附圖22的表格，顯示了NCKX5(SLC24A5)在B16細(xì)胞中表達(dá)，但在SLC8中不表達(dá)。深色人類黑素細(xì)胞的SLC8和SLC24mRNA分析在胰蛋白酶消化之后，4艮據(jù)廠家的說明書，利用RNeasymini試劑盒，以及柱上DNAse處理，從深色人類黑素細(xì)胞提取總RNA。提取物的總濃度才艮據(jù)廠家的說明書利用RiboGreen測定，用BMGFluostarOptima平板讀取器測量熒光。未知樣品的吸光度值與具有15ngl-l的動態(tài)范圍的七點(diǎn)參考曲線比較。根據(jù)廠家的說明書利用第一鏈合成試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄從1|ig總RNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成。在20pl反應(yīng)中進(jìn)行RT,其中需要好過20pi的cDNA,進(jìn)行多次反應(yīng)，集中cDNA。然后利用Bio-RadiCycler用SYBRGreen檢測通過實(shí)時PCR分析SLC24mRNA表達(dá)。引物序列是SLC24A1:正向5'畫TCTGCACAACAGCACCAT-3';反向5'-CTCTCCTCCTCCTTCTCCTT-3';SLC24A2:34正向5'-ATGATACACACCCTTGACC-3';反向5'-CCTTTTCTCTGAACCTCCCTT-3';SLC24A3:正向5'-CGTCTTATACTTCACTGTACCC-3';反向5'-AACCAATGATTGTGACCATCC-3';SLC24A4:正向5'-GACACAGACAGCCAAGAA-3';反向5'-GCATAGAACATATACAGAGCACCA國3';SLC24A5:正向5'-GAGATGGAGGCATCATAATCTA-3';反向5'-CCTGAGACAATCCAAGGGATTC-3'SLC24A6:正向5'-AGGCTTCACTGGCTCTT-3';反向5'國AGGCATCTCCAATGCTGTTC誦3';GAPDH:正向5'陽GGACCTGACCTGCCGTCT-3';反向5'-TAGCCCAGGATGCCCTTG國3'.針對人類SLC8A1-SLC8A3內(nèi)的外顯子-外顯子邊界的QuantiTectPCR引物購自Qiagen。通過cDNA的連續(xù)稀釋和熔化曲線分析確認(rèn)引物效力。利用ACt方法相當(dāng)于GAPDHmRNA表達(dá)將目標(biāo)基因表達(dá)歸一化。懸浮的各種細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)NCKX活性的分析才艮據(jù)先前的描述(Altimimi&Schnetkamp2007)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Na誘導(dǎo)的Ca"釋放的分析。B16細(xì)胞胰蛋白酶消化，在300g離心3分鐘。細(xì)胞用500jxl基礎(chǔ)DMEM、12^MFluo3-AM重懸浮，在室溫下孵育35分鐘，在軌道回轉(zhuǎn)混合4義上旋轉(zhuǎn)。細(xì)胞300g離心2分鐘，在1.5mlNa+加載培養(yǎng)基中洗滌。細(xì)胞重懸浮值在275plNa+加載緩沖液(150mMNaCl、具有精氨酸的20mMHepespH7.4、3mMKC1、1.5mMCaCl2、10mM葡萄糖、250pM磺吡酮)中。50|ilB16細(xì)胞懸浮在塑料、各側(cè)透明的比色杯中的2mLKC1培養(yǎng)基中。磁性蚤置于比色杯中，將比色杯置于具有磁性攪拌器的發(fā)光光譜計(jì)中，啟動并夾套加熱到25°C。開始跟蹤，每1秒讀取。在10秒時，添加2pMFCCP,1|liM短桿菌肽和1毒胡蘿卜素。在180秒時，添加75mMNaCl,在200秒時添加350pMCaCl2,—旦跟蹤到達(dá)平臺期，添加0.01%皂香。在添加鈉之前10秒的平均熒光計(jì)數(shù)被用于從鈉誘導(dǎo)的釣跟蹤的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)中減去背景信號。皂普誘導(dǎo)的跟蹤的最后10秒的平均熒光計(jì)數(shù)用于歸一化鈉誘導(dǎo)的釣跟蹤的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)。附圖18顯示了在比色杯懸浮液中研究時B16細(xì)胞中Na+依賴性Ca^釋放的劑量依賴性特性。通過HTS方法在各種細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)NCKX活性的分析將早先描述的懸浮分析修改為以96孔形式使用(Altimimi&Schnetkamp2007)。細(xì)胞以100,000細(xì)胞/孔打板到Greiner玻璃底96孔平板中，粘附過夜。移除培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基中的Ca"+敏感性染料Fluo4-AM在37。C加載細(xì)胞30分鐘。用鈉加載緩沖液(150mMNaCl、具有精氨酸的20mMHepespH7.4、3mMKCl、1.5mMCaCl2、10mM葡萄糖、250iiM石黃吡酮)洗滌細(xì)胞，洗滌之后，30pl的鈉加載緩沖液置于細(xì)胞上。含有2pMFCCP、1^M短桿菌肽和1(xM毒胡蘿卜素的100pl的KC1分析緩沖液(150mMKC1具有精氨酸的20mMHepespH7.4、100EDTA)置于細(xì)胞上，平才反插入到MolecularDevicesFLEXStatkm中。每3秒進(jìn)行焚光讀取持續(xù)300秒。在120秒添加120mMNaCl,在200秒添加350pMCaCl2，在260秒添加0.01%皂苷。在分析之后，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到Excel。從每個Na+和皂苷誘導(dǎo)的熒光部分中減去背景熒光。通過Na+數(shù)據(jù)的增值乘以皂苷數(shù)據(jù)的倒數(shù)，將減去背景的Na+熒光然后進(jìn)行歸一化，得到減去背景的皂苷熒光。通過Z'因子、信噪比和信號背景比的分子，評估了這種分析對HTS的適用性。在獨(dú)立的三天的每一天如上所述分析B16細(xì)胞的一個平板。Z'因子計(jì)算為{1-[(3*激動劑SD)+(3*NSBSD)]}/(激動劑平均值-NSB平均值)，如早先描述的(Chen2006，Zhang1999),其中NSB是非特異性背景。該分析的Z'因子是0.4,S:N22.5，S:B2.8，表明分析適合于HTS。該分析形式被自動化，用于在Hamilton機(jī)器人平臺上對HTS使用。附圖19和20顯示了當(dāng)在模擬高通量分析的96孔分析中研究時，36在B16細(xì)胞中Na+依賴性Ca"釋放的劑量依賴性特征。通過實(shí)時共焦顯微鏡檢查在各種細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)NCKX活性的分析描述的分析適合于通過實(shí)時共焦顯微鏡檢查在LeicaTCSSP1共焦顯微鏡上使用。細(xì)胞播種到ibidipflowslides中，粘附過夜。移除培養(yǎng)基，用無血清DMEM中的Fluo4-AM在37。C加載30分鐘。細(xì)胞用鈉加載緩沖液(150mMNaCl、具有精氨酸的20mMHepespH7.4,3mMKCl，1.5mMCaCl2,10mM葡萄糖，250pM石黃吡酮)洗滌，在洗滌之后，載玻片置于LeicaTCSSP1共焦的掃描激光器顯微鏡(LeicaMicrosystemsGmbH,Wetzlar,Germany)的平臺上。掃描頭裝到反轉(zhuǎn)的LeicaDMIRBE顯微鏡上。40Xplanapo1.25n.a.油浸相差物鏡用于同時在熒光和相差上采集圖像。對于圖象獲取，選擇512x512像素的幀大小，樣品掃描頻率設(shè)置為最大值(每0.87秒1幀)或更一般地每2秒1幀。488nm激發(fā)波長的氬離子激光器用于激發(fā)Fluo-4加載的細(xì)胞。從500-585nm捕獲熒光發(fā)射。所有圖像中的視野是250x250pm。在5分鐘內(nèi)收集典型的數(shù)據(jù)集。在零時間，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到KC1分析緩沖液(150mMKC1、20mMHepespH7.4和精氨酸、含有2jiMFCCP的100mMEDTA、1短桿菌肽和1|nM毒胡蘿卜素)。在180秒，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到75mMNaCl,在250秒，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到350一CaCl2緩沖液。圖像的分析和.avi影片文件的輸出通過LdcaLCS操作軟件進(jìn)行，結(jié)果作為.xml文件輸出。通過加亮圖像內(nèi)的細(xì)胞并將它們標(biāo)繪為時間的函數(shù)，來評估隨著時間的過去的像素強(qiáng)度。附圖21表現(xiàn)了共焦顯微鏡檢查方法，顯示了B16細(xì)胞中的Na+依賴性Ca2+釋放。HEK293細(xì)胞中異源NCKX2活性的分析培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞以10,000個細(xì)胞每孔打板在玻璃底96孔平板中，粘附過夜。在粘附之后，細(xì)胞用克隆到pcDNA3.1表達(dá)載體中的hNCKX2基因的短的剪接變體來轉(zhuǎn)染。所述短的剪接變體缺失蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)環(huán)體內(nèi)的17個氨基酸的延伸。還將c-Myc標(biāo)記插入堿基241-242之間的BstEII位點(diǎn)，響應(yīng)于氨基酸殘基81(Prinsen""/2000,WinkfeinW2003)。根據(jù)廠家的說明書用Mirus293試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染48h。在轉(zhuǎn)染之后，移除培養(yǎng)基，細(xì)胞用無血清DMEM中的Fluo4-AM在37。C加載30分鐘。細(xì)胞用鈉加載緩沖液(150mMNaCl、具有精氨酸的20mMHepespH7.4、3mMKCL、1.5mMCaCl2、10mM葡萄糖、250pM^5黃吡酮)洗滌，在洗滌之后，30|Lil的鈉加載緩沖液置于細(xì)胞上。含有2pMFCCP、1短桿菌肽和1毒胡蘿卜素的100|il的KCL分析緩沖液(150mMKCL、具有精氨酸的20mMHepespH7.4、100|aMEDTA)置于細(xì)胞上，平板插入MolecularDevicesFLEXStation中。每3秒進(jìn)行熒光讀取持續(xù)500秒。在150秒添加350jaMCaCl2,在180秒添加75mMNaCl，在350秒添加0.01%皂普。做為選擇，外源表達(dá)hNHCX2的HEK293細(xì)胞用Fluo4-AM在37。C在生理鹽溶液(150mMNaCl,具有精氨酸的20mMHepespH7.4,6mM葡萄糖，0.25mM磺吡酮，0.1^M烏本苷士1.5mMCaCl2)中加載30分鐘。在除去細(xì)胞外的染料之后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到LiCl2分析緩沖液(150mMLiCl2、具有精氨酸的20mMHepespH7.4、6mM葡萄糖、O.lmMEDTA)中。在120秒，添加350|iMCaCl2,隨后添加50mMKCL來啟動最大速度的反向4丐交換。在最大熒光時添加0.01%皂苷。在分析之后，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到Excel。從每個Na+和皂苷誘導(dǎo)的熒光部分中減去背景熒光。通過Na+數(shù)據(jù)的增值乘以皂苷數(shù)據(jù)的倒數(shù)，將減去背景的Na+熒光然后進(jìn)行歸一化，得到減去背景的皂苷熒光。參見附圖23。實(shí)施例7的參考文獻(xiàn)AltimimiH.F,Schne汰ampP.P.M(2007),J5z'o/C/zem282(6):3720-3729ChenC,SmithC,MinorL,DamianoB.DevelopmentofFLIPR畫basedHTSAssayforGi-CoupledGPCRs.InHandbookofAssayDevelopmentinDrugDiscovery,pages305-317.PublihsedbyTaylorFrancis.2006.ZhangJH,ChungTD,OldenburgKR1999.ASimpleStatisticalParameterforUseinEvaluationandValidationofHighThroughputScreeningAssays.J5z'蘭o/Scree"4(2):67-73.PrinsenCF,SzerencseiRT,SchnetkampPP.Molecularcloningandfunctionalexpressionofthepotassium-dependentsodium-calcium38exchangerfromhumanandchickenretinalconephotoreceptors./A^wms"'2000;20:1424-1434.WinkfeinRJ,SzerencseiRT,KinjoTG，KangK，PerizzoloM,EisnerL,SchnetkampPP.ScanningmutagenesisofthealpharepeatsandofthetransmembraneacidicresiduesofthehumanretinalconeNa+/Ca2+-K+exchanger.Bz'oc/zemW^y2003;42:543-552。實(shí)施例8評估B16細(xì)胞中與黑色素生成相關(guān)的NCKX5活性的方法A)黑色素產(chǎn)生的定量、蛋白質(zhì)含量和培養(yǎng)的B16小鼠黑素細(xì)胞的細(xì)胞生存力。1)敲低后72小時的細(xì)胞處理從每個孔中除去無苯酚DMEM培養(yǎng)基用于分泌的黑色素的定量。然后用Dulbeccos磷酸鹽緩沖鹽水(dPBS)(Sigma-Aldrich,Poole,UK)清洗培養(yǎng)平板的每個孔一次，替換為0.5mlWstl試劑(在培養(yǎng)基中1/10稀釋)(RocheDiagnosticsLtd,WestSussex,UK)。培養(yǎng)平板在37。C、5。/。CO2孵育30分鐘。從每個孔中除去Wstl試劑，用于細(xì)胞生存力的測定，每個孔再次用dPBS清洗。dPBS中200pi的1%w/vTritonX-100(Sigma-Aldrich，Poole，UK)添加到培養(yǎng)平板的每個孔中。平板在4。C在軌道搖動器上孵育20分鐘。移除來自每個孔的上清液，在13000g離心5分鐘來除去細(xì)胞碎片。保留可溶成分用于蛋白質(zhì)定量。2)黑色素分析lmg合成的黑色素(Sigma-Aldrich,Poole,UK)溶于50|il的100%DMSO中。滴加950|il無苯酚DMEM+10%FCS來產(chǎn)生1mg/mL的上標(biāo)準(zhǔn)。這個標(biāo)準(zhǔn)在培養(yǎng)基+FCS中連續(xù)稀釋(5倍)來得到用于定量樣品制品中的黑色素(/人1000到8pg/ml)。100)il的每種標(biāo)準(zhǔn)物和樣品一式兩份置于96孑L微滴定板(GreinerBio-OneLtd，Gloucestershire,UK)中，每個樣品復(fù)制物的光密度(OD)利用DynexMRX平板讀取器(DynexTechnologiesLtd,WestSussex,UK)在450nm測量。每個培養(yǎng)物級分的黑色素含量從合成的黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。3)Wstl分析測量孵育后Wstl試劑的100pl餾分(雙份地測量)的OD450。比專支每種處理的OD450來評估相對生存力。4)蛋白質(zhì)含量測定利用BCA分析試劑盒(PerbioScienceUKLtd,Northumberland,UK)根據(jù)廠家的說明書用以下的修改來測量每個tritonX-100細(xì)胞培養(yǎng)物級分的蛋白質(zhì)含量10(J的每種溶解的蛋白質(zhì)級分一式兩份置于96孔樣i量滴定板中。150pi的dH20在添加BCA顯色試劑之前添加到每種樣品中。通過BSA的2倍連續(xù)稀釋(利用dPBS中的1%tritonX-100)來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(范圍=2000到15.6|ag/ml)。含有所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的平板孵育15分鐘，測量OD595。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個樣品的蛋白質(zhì)含量。5)每嗎蛋白質(zhì)的黑色素貼數(shù)的計(jì)算每個樣品的|ig/ml黑色素含量除以2來得到每個樣品的總黑色素。來自BCA分析的i!g/ml蛋白質(zhì)含量乘以2.5(以考慮分析的稀釋步驟)，然后除以5(計(jì)算用于裂解細(xì)胞和釋放蛋白質(zhì)的氚的體積)。最后，對于每種處理，總黑色素(pg)值除以總蛋白(貼)值來得到每蛋白質(zhì)的黑色素pg數(shù)。結(jié)果參見附圖29,顯示了NCKX5蛋白質(zhì)確實(shí)調(diào)節(jié)色素產(chǎn)生。B)黑色素產(chǎn)生的定量、NCKX5蛋白質(zhì)表達(dá)和培養(yǎng)的人類黑素細(xì)月包的細(xì)力包生存力。在siRNA介導(dǎo)的SLC24A5敲低之后，進(jìn)行以下的分析1)細(xì)胞生存力評估siRNA處理后5天的黑素細(xì)胞生存力通過A)中描述的Wstl分析來評估，但是具有以下改變lmL的1/10稀釋的(在培養(yǎng)基中)Wstl試劑添加到含有人類黑素細(xì)胞的6孔平板的每個孔中。在試劑的移除和OD450評估之前，平板在37。C、5。/c)CO2孵育60分鐘。2)蛋白質(zhì)和黑色素分級培養(yǎng)的細(xì)胞(從6-孔培養(yǎng)平板上胰蛋白酶消化下來)利用每份樣40品100|al的含蛋白酶抑制物混合物(Sigma-Aldrich,Poole,UK)的dPBS中的1。/otritonX-100,在1.5mleppendorf管中水上裂解20分鐘。離心細(xì)胞(13000g10分鐘)來從溶解的蛋白質(zhì)分離黑色素和細(xì)胞碎片。每個上清液級分的蛋白質(zhì)濃度通過A)中描述的BCA分析來測定。3)SDS-PAGE和向PVDF膜的電泳轉(zhuǎn)移20pg蛋白質(zhì)(通過BCA分析測定的)重構(gòu)到含有l(wèi)x還原劑(InvitrogenLtd,Paisley,UK)的20pi的lxLDS加載緩沖液(InvitrogenLtd,Paisley,UK)中，加熱到40°C30分鐘，用lxMOPS運(yùn)行緩沖液(InvitrogenLtd,Paisley,UK)力口載到10%Novexbis誦tris丙埽酰胺凝膠上。在樣品旁側(cè)跑動Kaleidosc叩e分子量標(biāo)示物(Bio-RadLaboratoriesLtd,HemelHempstead,UK)用于大小測定。利用Bio-Radmini-cellIItrans-blotter和1xTris-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液(InvitrogenLtd,Paisley,UK)+15。/。v/v曱醇(100Vl小時)，通過電泳轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。4)Western印跡來檢測NCKX5:含有轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的膜利用PBS+0.05%tween20(PBST)中的2。/ow/v脫脂乳蛋白質(zhì)(SMP)溫和攪拌地"封閉"1小時。肽親和力純化的兔多克隆抗體(利用相當(dāng)于NCKX5的C-末端-GNNKIRGCGG的肽產(chǎn)生)使用PBST中的2%SMP稀釋到0.5pg/ml。稀釋的抗體與膜在室溫下孵育2小時。然后用PBST清洗膜(4x5分鐘洗滌)。過氧化物酶結(jié)合的抗兔IgG(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.PA，USA)利用PBST中的2%SMP稀釋1/4000,與膜孵育1小時。最后，用PBST使用6x5分鐘清洗來洗滌膜。SuperSignalWesternpico(PerbioScienceUKLtd，Northumberland,UK)化學(xué)發(fā)光檢測試劑用于根據(jù)廠家說明書探測膜上的二級抗體結(jié)合。結(jié)果的可視化通過ChemidocXRS成<象系統(tǒng)(Bio-RadLaboratoriesLtd，HemelHempstead,UK)。5)黑色素含量的測量向2)節(jié)中獲得的黑色素+細(xì)胞碎片的每個團(tuán)粒中，添加0.5mL的二乙醚乙醇(1:1比例)。Eppendorf管大力渦旋30秒，在B000g離心5分鐘。小心地移除乙醚層拋棄，再添加0.5ml。搖動試管，如前所述離心。再次移除液相，容許黑色素團(tuán)粒在室溫下風(fēng)干IO分鐘。黑色素團(tuán)粒通過添加200pl的1MNaOH+10%DMSO并在50。C孵育1小時(偶爾攪動)來溶解。每個樣品的80^tl等分量轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板，一式兩份。測定每個樣品的OD450,根據(jù)如上所述制備的合成的黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個級分的黑色素含量。在處理比較中，結(jié)果表示為每lig蛋白質(zhì)的黑色素嗎數(shù)。結(jié)果參見附圖30和31,顯示了siRNA敲低展現(xiàn)了小鼠B16細(xì)胞中SLC24A5mRNA的降^f氐和蛋白質(zhì)含量結(jié)果。實(shí)施例9人類細(xì)胞中siRNA敲低結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)分離自淺著色的或深著色的新生兒包皮的原代人類黑素細(xì)胞從CascadeBiologies獲得。黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基(MGM)是指補(bǔ)充有HMGS(CascadeBiologies)的培養(yǎng)基254。黑素細(xì)胞培養(yǎng)物在37°C、10%C02維持在MGM中。細(xì)胞以2xl(^細(xì)胞/cm2(黑色素生成實(shí)-瞼)或lxl(^細(xì)胞/cn^來播種(免疫熒光實(shí)驗(yàn))，在轉(zhuǎn)染之前容許粘附24h。用寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞StealthsiRNA雙螺旋寡核苷酸(表1)購自Invitrogen,以20-100nM的終濃度使用。雙螺旋260的亂序的、非粑向版本用作對照。s涯A雙螺旋1852603014921110序列33AGGGCCACAGGAAATAGCACCCAAT3'TCCCGGTGTCCTTTATCGTGGGTTA5'GAGCGCAGAGATGGAGGCATCATAA3'CTCGCGTCTCTACCTCCGTAGTATT5'CGTTTACATGTTCATGGCCATATCT3'GCAAATGTACAAGTACCGGTATAGA5'GCACCATCCTTGGATCTGCAATTTA3'CGTGGTAGGAACCTAGACGTTAAAT5'CCGCATTTACATATATCCTGGTTTG3'GGCGTAAATGTATATAGGACCAAAC5'外顯子目標(biāo)1&2邊界外顯子2外顯子23&4邊界外顯子7表針對人類SLC24A5設(shè)計(jì)的siRNA雙螺旋的序列和外顯子目標(biāo)。培養(yǎng)基(Gibco)中稀釋(1:50),并在室溫孵育15分鐘。siRNA雙螺旋在Opti-MEMI中稀釋，并與1倍體積的稀釋的Lipofectamine2000組合。在室溫下15分鐘的孵育期之后，添加4倍體積的Opti-MEM,產(chǎn)生的混合物用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在37。C和10%C02的6-8h孵育期之后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到MGM。細(xì)胞在0天轉(zhuǎn)染，如果需要在第5天再次轉(zhuǎn)染。免疫熒光細(xì)胞在玻璃蓋玻片上生長，用標(biāo)明的siRNA雙螺旋轉(zhuǎn)染。在72h、5天或10天的孵育之后，蓋玻片上的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后用PBS中的2%PFA固定，進(jìn)一步洗滌3次，用PBS中的0.5°/。皂普滲透化。蓋玻片與0.2Q/。BSA/0.1。/。皂苷/PBS在室溫下孵育lh,然后在室溫下在0.2。/。BSA/0.P/。皂苷/PBS中與初級抗體孵育1.5h。使用的初級抗體稀釋度是抗NCKX5(827),1:500;抗NCKX5(826),1:25以及抗TGN46(AbDSerotec)，1:200。蓋玻片用0.1。/o皂香/PBS洗滌兩次，用0.2。/。BSA/0.1。/。皂苷/PBS洗滌兩次，然后在室溫下在0.2%BSA/0.1。/。急苦/PBS中與二級抗體孵育45分鐘。二級抗體(Alexa488結(jié)合的抗兔或Alexa633結(jié)合的抗綿羊)購自Invitrogen,以1:500的稀釋度使用。蓋玻片用0.2%BSA/0.1。/。皂苷/PBS洗滌兩次，用0.1%皂苷/PBS洗滌兩次，然后用MilliQ清洗，用VectaShield(VectorLaboratories)固定培養(yǎng)基來固定。利用共焦顯微鏡觀察細(xì)胞并照相。隨著時間的過去siRNA雙螺旋對SLC24A5降低的結(jié)果參見附圖24。當(dāng)與未敲低的結(jié)果比較時，敲低后人類黑素細(xì)胞中黑色素色素的降低的目視解釋參見附圖25。免疫熒光結(jié)果參見附圖25。顯示敲低siRNA處理的細(xì)胞中黑色素產(chǎn)生降低的定量分析結(jié)果還參見附圖27。實(shí)施例10-HEK293細(xì)胞中天然SLC24A5(NCKX5)的缺乏的展示在各種細(xì)胞中鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放我們展現(xiàn)了SLC24A5mRNA在HEK293細(xì)胞和人類角質(zhì)形成細(xì)胞中是不可檢測的。此外，與原代人類黑素細(xì)胞或B16細(xì)胞相比，在MEWO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)更低。因而，我們研究了這些細(xì)胞中Na+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca"釋放的程度。IOO，OOO個細(xì)胞一式三份打板到96孔平板中，粘附過夜，如"通過HTS方法在各種細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)NCKX活性的分析"中描述的研究細(xì)胞內(nèi)Ca"釋放。雖然在HEK293、MEWO和角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測到一定的活性，歸一化的活性的排位次序遵循我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)分布的預(yù)測(附圖32)。附圖33的跟蹤的早期時間點(diǎn)顯示了，在表達(dá)高水平的SLC24A5轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞(深色和淺色黑素細(xì)胞、B16黑素細(xì)胞)和具有不可檢測的SLC24A5轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞(HEK-293和角質(zhì)形成細(xì)胞)之間，胞具有中度水平的SLC24A5轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(在這些條件下;產(chǎn)生黑色素)，其與鈉誘導(dǎo)的鈣釋放的中度水平相符。HEK293和人類角質(zhì)形成細(xì)胞的SLC24和SLC8mRNA表達(dá)為了評估SLC24A5和SLC8家族成員釋放在HEK293細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平上表達(dá)，從培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行實(shí)時PCR。沒有檢測到SLC24A5mRNA,以很低水平檢測到SLC8mRNA。早先的研究展現(xiàn)了，在未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中沒有檢測到質(zhì)膜NCKX活性，表明NCKX1-NCKX4蛋白質(zhì)不以可檢測的水平表達(dá)(Kang"a/2005;Cooper""/1999;Visser"a/2007)?；駽T±SDSLC24A5未檢出SLC8A131.7±0.2SLC8A230.6±0.2SLC8A331.5±0.2以上的表4各顯示了從HEK293細(xì)胞提取的1pgRNA凈皮逆轉(zhuǎn)錄，如方法中所描述的進(jìn)行實(shí)時PCR。數(shù)據(jù)是三個反應(yīng)的平均值士SD。44SLC24A127.4±0.2SLC24A236.1±0.5SLC24A329.8士0.0SLC24A4未檢出SLC24A534.2士0.6SLC24A624.0土0.0SLC8A131.8±0.2SLC8A233.8±0.3SLC8A3未檢出SNARE21.2±0.1上文的表^^各顯示了在1pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄之后，利用SYBRgreen實(shí)時PCR檢測的、從人類角質(zhì)形成細(xì)胞提取的mRNA。表格的值是雙份反應(yīng)的平均值士SD。實(shí)施例10的參考文獻(xiàn)KJRang,TGKinjo,RTSzerencsei,PPMSchnetkamp(2005).ResiduesContributingtotheCalciumandPotassiumBindingPocketoftheNCKX2Na+/Ca2+-K+Exchanger.JBiolChem280(8):6823-6833.CBCooper,RJWinkfein,RTSzerencsei,PPMSchne汰amp(1999).cDNACloningandFunctionalExpressionoftheDolphinRetinalSodium-calcium-PotassiumExchangerNCXKl:ComparisonwiththeFunctionallySilentBovineNCKX1.Biochemistry38:6276-6283.FVisser,VValsecchi,LAnnunziato，JLytton(2007).ExchangersNCKX2，NCKX3,andNCKX4:IdentificationofThr-551asaKeyResidueinDefiningtheApparentK+AffinityofNCKX2.JBiolChem282(7):4453-62.實(shí)施例11藥品的和化妝品制劑本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了藥物制劑，其包含與化妝上、藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑或載體混合的，包含本發(fā)明的第一方面的方法的步驟(i)優(yōu)選地，所述制劑是含有活性成分的日劑量或單位、每日的亞劑量或其合適的部分的單位劑量。本發(fā)明的化合物通常將口服地或通過任何胃腸外的途徑，以包含活性成分的藥物制劑的方式，任選地以無毒的有才幾或無機(jī)酸加鹽、石咸加鹽的形式、以藥學(xué)上可接受的劑型來施用。取決于要治療的失調(diào)和患者，以及給藥途徑，所述組合物可以以改變的劑量來施用。在人類治療中，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)地施用，但一般將與根據(jù)施用的預(yù)定途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來選擇的、適合的藥學(xué)的賦形劑、稀釋劑或載體混合地施用。例如，本發(fā)明的化合物可以以片劑、膠嚢、珠(ovules)、酏劑、溶液或懸浮液的形式局部地、口服地、面頰地或舌下地施用，其可以含有調(diào)味劑或著色劑，用于即時的、延遲的或控釋的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物也可以通過海綿體內(nèi)注射來施用。這樣的片劑可以含有賦形劑例如微晶纖維素、乳糖、枸櫞酸鈉、碳酸釣、二堿磷酸釣和甘氨酸，崩解劑例如淀粉(優(yōu)選的玉米、馬鈴薯或木薯典范)、淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)羧甲纖維素鈉和某些復(fù)合的硅酸鹽，以及造粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)羥基-丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此夕卜，可以包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯和滑石粉。相似類型的固體組合物也可以在膠嚢用作填料。就此來說優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙二醇。對于水懸浮液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以組合各種甜味或調(diào)味劑、色素或染料，乳化劑和/或懸浮劑，以及稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇和甘油，以及它們的組合。本發(fā)明的化合物還可以胃腸外地施用，例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、頭蓋骨內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用，或者它們可以通過輸注技術(shù)來施用。它們最好以無菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物質(zhì)，例如足夠的鹽或葡萄糖來使溶液與血液等滲。如有必要，水溶液應(yīng)該被適當(dāng)?shù)鼐彌_(優(yōu)選的緩沖到3到9的pH值)。適合的胃腸外制劑在無菌條件下的制備通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)容易地實(shí)現(xiàn)。適合于腸胃外施用的制劑包括含水和無水的無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及含水和無水的無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿瓶和小瓶，并可以保存在冷凍干燥(凍干)的條件中，僅需要在使用前即時添加無菌的液體載體例如注射用水。臨時的注射溶液和懸浮液可以從無菌的粉劑、顆粒和早先描述的種類的片劑來制備。對于向人類患者口服和胃腸外施用，本發(fā)明的化合物的每日劑量水平通常是1mg/kg到30mg/kg。因而，例如，本發(fā)明的片劑或膠嚢可以含有一劑的活性化合物，用于一次單份地、兩份或更多份地施用，視情況而定。在任何情況下醫(yī)師將確定實(shí)際的劑量，其將最適合于任何單獨(dú)的患者，并且將隨著特定患者的年齡、重量和反應(yīng)而變。以上的劑量是平均情況的示范。當(dāng)然，可以有單獨(dú)的例子，其中更高的或更低的劑量范圍是優(yōu)點(diǎn)，這些處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的化合物還可以鼻內(nèi)地或通過吸入來使用，并且以干粉吸入器或氣溶膠噴射的方式方便地輸送，其借助于適合的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A3)或1,1,1,2,3,3,3國六氟丙烷(HFA227EA3)、二氧化碳或其他適合的氣體從加壓容器、泵、噴霧器或噴霧劑呈現(xiàn)。對于加壓的氣霧劑來說，劑量單位可以通過提供閥門來遞送計(jì)量的數(shù)量來確定。加壓的容器、泵、噴霧器或噴霧劑可以含有活性化合物的溶液或懸浮液，例如，利用乙醇和推進(jìn)劑的混合物作為溶劑，其可以另外含有潤滑劑，例如三油酸山梨坦。用于吸入器或吹入器中的(例如，從明膠制成的)膠嚢和藥筒可以配制為含有本發(fā)明化合物的粉末混合物和適合的粉末基劑，例如乳糖或淀粉。優(yōu)選地調(diào)整氣霧劑或干粉制劑，從而每次計(jì)量的劑量或"吹"遞送出本發(fā)明的化合物的合適的劑量給患者。要理解的是，氣霧劑的總?cè)談┝繉⑹腔颊吆突颊唛g不同的，可以以單劑量，或更通常地以分開的劑量在全天中施用。做為選擇，本發(fā)明的化合物可以以栓劑或子宮栓的形式施用，或者它們可以以洗液、溶液、乳膏劑、軟膏劑或樸^f分的形式表面地應(yīng)用。本發(fā)明的化合物還可以穿真皮地施用，例如，通過^f吏用皮膚貼片。它們還可以通過眼睛途徑施用，特別是用于治療眼的疾病。對于眼科的使用，本發(fā)明的化合物可以配置為等滲的、調(diào)整了pH值的、無菌鹽水中的微?；瘧腋∫?，或優(yōu)選地，配置為等滲的、調(diào)整了pH值的、任選地組合了防腐劑例如苯扎氯銨的無菌鹽水中的溶液。做為選擇，它們可以是配制在軟膏，例如礦脂中。對于皮膚的局部應(yīng)用，本發(fā)明的化合物可以被配制作為適合的軟膏，所述軟膏含有懸浮于或溶于例如以下一種或多種的混合物中的活性化合物礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。做為選擇，它們可以被配制作為適合的洗液或乳膏劑，所述洗液或乳膏劑含有懸浮于或溶于例如以下一種或多種的混合物中的活性化合物礦物油、單硬脂酸山梨糖醇酐酯、聚乙二醇、液狀石蠟、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蠟、鯨臘醇、2-辛十二醇、苯曱醇和水。適合于口腔中表面施用的制劑包括錠劑，其包含處在調(diào)味的基質(zhì)、通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的活性成分；軟錠劑，包含處在惰性基質(zhì)例如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠中的活性成分，以及漱口藥，包含在適合的液體載體中的活性成分。一般地，在人類中，本發(fā)明的化合物的口服或表面施用是優(yōu)選的途徑，是最方便的。在接受者患有吞咽障礙或在口服施用后的藥物吸收損傷的情況下，藥物可以胃腸外地施用，例如，舌下給藥或面頰給藥。對于獸醫(yī)學(xué)用途，本發(fā)明的化合物根據(jù)正常的獸醫(yī)學(xué)實(shí)踐作為適合的可接受的制劑來施用，獸醫(yī)將決定給藥方式和施用途徑，其將是最適合于特定的動物的。皮膚病學(xué)可接受的運(yùn)載體載體，來作為活性物的稀釋劑、分散劑或載體。運(yùn)載體可:包括通常用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的材料，例如，水、液體或固體軟化劑、硅酮油劑、乳化劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑、粉劑、推進(jìn)劑等等。運(yùn)載體通常將構(gòu)成組合物按重量計(jì)的5%到99.9%,優(yōu)選地從25%48到80%,并且可以沒有其他的化妝品添加劑，形成組4、物的平4軒?？蛇x的皮膚有益材料和化妝品添加劑除了活性物之外，還可以包括其他特定的皮膚有益活性物，例如防曬劑、皮膚增亮劑、皮膚棕黃化劑。運(yùn)載體還可以進(jìn)一步包括添加劑，例如抗氧化劑、芳香劑、不透明劑、防腐劑、著色劑和緩沖劑。產(chǎn)品制備、形式、使用和包裝為了制備本發(fā)明的方法中使用的表面組合物，可以采用用于制備皮膚護(hù)理產(chǎn)品的通常的方式。活性成分一般按照常規(guī)的方式摻入皮膚病學(xué)上/化妝上可接受的載體中。活性成分可以首先適當(dāng)?shù)厝芙饣蚍稚⒃趯⒁⑷胨鼋M合物中的一部分水或其他的溶劑或液體中。優(yōu)選的組合物是水包油或油包水或水包油包水乳劑。組合物可以是常規(guī)的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的形式，例如乳膏劑、凝膠或洗液、膠嚢等等。組合物也可以是所謂的"洗下的(wash-off)"產(chǎn)品，例如，沐浴或淋浴凝膠，可能含有活性物的遞送系統(tǒng)來促進(jìn)清洗期間對皮膚的粘附。最優(yōu)選的產(chǎn)品是"留下(leave-on)"產(chǎn)品；一種在其應(yīng)用于皮膚之后沒有^艮快的刻意的清洗步驟的情況下來應(yīng)用于皮膚的產(chǎn)口口O組合物可以以任何適合的方式，例如，在罐子、瓶子、試管、滾球(roll-ball)中等等，以常規(guī)的方式包裝。設(shè)想的是，本發(fā)明的組合物可以被包裝為兩種獨(dú)立組合物的試劑盒，一種含有巖芽酸，另一種含有酚化合物，來同時地或連續(xù)地應(yīng)用于皮膚。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以配制成適合于口服攝食的形式，例如膠嚢、片劑或類似的。本發(fā)明的方法可以向需要治療的皮膚每天進(jìn)行一次或多次。皮膚外觀的改善通常在3到6個月后顯露，取決于皮膚狀況、發(fā)明的方法中使用的活性組分的濃度、使用的組合物的數(shù)量以及使用的頻率。一般地，少量的組合物，例如0.1到5ml從適合的容器或敷涂器上應(yīng)用于皮膚，利用手或手指或適合的設(shè)備涂遍和/或擦入皮膚中。任選地可以跟隨著清洗步驟，取決于所述組合物是配制為"留下"還是"洗去"產(chǎn)品。以下的制劑描述了適合于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途的水包油乳膏劑。標(biāo)明的百分比是按組合物的重量。wt%Wt%Wt%444巖芽酉臾(甘、油三酉旨)exElysion1.1523綠茶多酚020EGCG001槲皮素0.500Brij56*444Alfol16RD*444三乙醇胺0.750.750.75丁烷-l,3國二醇333黃原膠0.30.30.3芳香劑qsqsqs丁基化羥基曱苯0.010.010.01水到100到100到100*Bnj56是十六醇POE(10)Alfol16RD是十六醇以下的制劑描述了根據(jù)本發(fā)明的乳化乳膏劑。完整化學(xué)名稱或CTFA命名胡荽籽油exLodersCroklaan(PA甘油三酯，總脂肪酸的60-75%)商品名WT.%2.0WT.%3WT%1.5沒食子酸100染料木素02Diadzein001.5EDTA二鈉SequestereneNa20.050.050.05硅酸鋁4美VeegumUltra0.60.60.6<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>上述的表面組合物和上述的制劑都提供了有效的化妝處理，來改善皺紋、老化、光致?lián)p傷和/或發(fā)炎的(irritated)皮膚，當(dāng)應(yīng)用于通過老化或光致老化而惡化的正常皮膚時，或當(dāng)應(yīng)用于年輕皮膚時，來幫助阻止或延遲這樣的惡化改變。所述組合物對于潤滑發(fā)炎的皮膚、調(diào)節(jié)干燥皮膚、淺化皮膚顏色和降低油和皮脂分泌也是有效的。所述組合物可以按照常規(guī)的方式來加工。權(quán)利要求1.一種鑒定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著、或改變皮膚和/或毛發(fā)的黑色素組成，所述方法包括測定測試化合物調(diào)節(jié)NCKX介導(dǎo)的鈣離子跨膜運(yùn)動的能力。2.權(quán)利要求l的方法，包括使包含NCKX分子或其變體、融合體或衍生物的膜暴露于測試化合物，并直接或間接地測量所述膜的一側(cè)或兩側(cè)的釣離子濃度的步驟。3.權(quán)利要求1或2的方法，包括以下步驟(a)提供包含至少一種NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的膜，其中所述膜分割了兩個不同的區(qū)室；(b)在暴露于一種或多種測試化合物之前測量兩個區(qū)室中的4丐離子(Ca2+)濃度；(c)使所述膜暴露于一種或多種測試化合物；(d)在暴露于一種或多種測試化合物之后測量兩個區(qū)室中的鈣離子(Ca2+)濃度；(e)通過比較步驟(b)和步驟(d)中測量的濃度來鑒定鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量；4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述NCKX分子是NCKX5。5.權(quán)利要求3或4的方法，進(jìn)一步包括與對照測量比較響應(yīng)于測試化合物的釣離子運(yùn)動的步驟。6.權(quán)利要求3、4或5中的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(f)重復(fù)上述步驟(a)、(b)、(d)和(e)來提供沒有暴露于一種或多種測試化合物時釣離子(Ca2+)濃度改變的對照結(jié)果；(g)比較在暴露于所述測試化合物之后在步驟(e)中鑒定的鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量、在步驟(f)的對照中鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量；(h)鑒定鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量是否響應(yīng)于對所述測試化合物的暴露而提高、降低或保持相同。7.權(quán)利要求3、4或5的方法，進(jìn)一步包括比較跨越不含NCKX蛋白的對照膜的4丐離子運(yùn)動數(shù)量的步驟。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量的提高表明所述測試化合物提高皮膚和/或毛發(fā)色素沉著，鈣離子(Ca2+)跨膜運(yùn)動的數(shù)量的降低表明所述測試化合物降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著。9.前迷權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(i)分離所述一種或多種測試化合物。10.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(j)將步驟(i)中分離的所述一種或多種測試化合物配制到化妝品或藥物制劑中。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述膜是生物膜。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述生物膜是細(xì)胞膜。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞膜是完整細(xì)胞的部分。14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述細(xì)胞膜和/或完整細(xì)胞選自倉鼠胚腎(HEK)細(xì)胞、擊掌昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞、煙草植物細(xì)胞、p53缺陷細(xì)胞系H1299和/或細(xì)菌。15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述NCKX分子天然地位于所述膜中、人工地靶向所述膜、或重構(gòu)在人工的膜中。16.權(quán)利要求15的方法，其中通過連接將多肽靶向或包括在膜中的前導(dǎo)序列和/或標(biāo)記來將所述NCKX人工地把向所述膜。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述前導(dǎo)序列來自NCKX2或4、酵母a配偶因子、NCX蛋白、TGFbeta、血細(xì)胞凝集素或病毒表面蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述前導(dǎo)序列是hsNCKX2的N末端序列(氨基酸1到120)。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述鈣離子(Ca2+)濃度和/或運(yùn)動利用選自Ca^敏感性染料(熒光和/或非熒光的)、膜片鉗或放射性釣的方法來測量。20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物具有在氨基酸殘基lll的等效密碼子處的單核普酸多態(tài)性(SNP)。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述氨基酸殘基lll的等效密碼子處的SNP可以是丙氨酸或蘇氨酸。22.—種編碼融合蛋白的核酸分子，包含編碼NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的核酸分子，和編碼膜粑向前導(dǎo)肽和/或標(biāo)記的核酸分子。23.權(quán)利要求22的核酸分子，其中所述NCKX分子是NCKX5。24.權(quán)利要求23的核酸分子，其中所述膜靶向前導(dǎo)肽和/或標(biāo)記來自NCKX2或4、酵母a配偶因子、NCX蛋白、TGFbeta、血細(xì)胞凝集素或病毒表面蛋白。25.權(quán)利要求24的核酸分子，其中所述前導(dǎo)序列是hsNCKX2的N末端序列(氨基酸1到120)。26.權(quán)利要求22到25中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述編碼NCKX分子或其功能等效的變體、融合體或衍生物的核酸分子具有在氨基酸殘基lll的等效密碼子處的單核普酸多態(tài)性(SNP)。27.權(quán)利要求26的核酸分子，其中所述氨基酸殘基lll的密碼子處的SNP可以是丙氨酸或蘇氨酸。28.包含權(quán)利要求22到27中任一項(xiàng)的核酸分子的表達(dá)載體。29.含有權(quán)利要求22到28中任一項(xiàng)的核酸分子和/或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。30.權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞，進(jìn)一步在它的表面展示權(quán)利要求22到28的任一項(xiàng)中所要求的核酸分子和/或表達(dá)載體編碼的多肽。31.—種多肽，其包含權(quán)利要求22到27中任一項(xiàng)的核酸分子所編碼的多肽。32.—種成套試劑盒，包含(i)至少一種膜，其包含權(quán)利要求31中定義的至少一種多肽和/或至少一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在其表面展示權(quán)利要求31中定義的至少一種多肽；(ii)固相支持物或溶液，所述固相支持物可以固定所述至少一種膜和/或所述至少一種細(xì)胞，所述溶液可以懸浮所述至少一種膜和/或所述至少一種細(xì)^^;(iii)多孔的平板；(iv)鈣敏感性檢測系統(tǒng)；和(v)使用所述試劑盒的說明書33.權(quán)利要求32的試劑盒，其中所述鈣檢測系統(tǒng)是鈣敏感性染料。34.權(quán)利要求9到21的步驟(i)中分離的化合物在藥物制造中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防特征為過度的色素沉著和/或色素沉著降低，和/或在陽光誘導(dǎo)的皮膚損傷和/或皮膚癌的預(yù)防中的用途。35.權(quán)利要求34的用途，其中提高鈣運(yùn)動的化合物可以用于藥物制造，所述藥物用于治療或預(yù)防特征為色素沉著降低的疾病，和/或用于預(yù)防陽光誘導(dǎo)的皮膚損傷和/或皮膚癌和/或特征為維生素D缺乏的疾病(例如，骨質(zhì)疏松癥)。36.權(quán)利要求34的用途，其中降低釣運(yùn)動的化合物可以用于藥物制造，所述藥物用于治療或預(yù)防特征為色素沉著提高的疾病。37.權(quán)利要求9到21的步驟(i)中分離的化合物在化妝品制造中的用途，所述化妝品用于提高和/或降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著。38.權(quán)利要求37的用途，其中提高鈣運(yùn)動的化合物可以用于化妝品的制造，所述化妝品用于提高皮膚和/或毛發(fā)色素沉著。39.權(quán)利要求37的用途，其中降低4丐運(yùn)動的化合物可以用于化妝品的制造，所述化妝品用于降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著和治療年齡斑點(diǎn)。40.利用權(quán)利要求1到21中任一項(xiàng)的方法筌定的化合物。41.一種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的、鑒定提高或降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著的化合物的方法。42.—種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的核酸分子。43.—種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的表達(dá)載體。44.一種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的宿主細(xì)胞。45.—種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的多肽。46.—種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的成套試劑盒。47.—種基本上參考實(shí)施例和附圖在此描述的用途。全文摘要本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物提高或降低皮膚和/或毛發(fā)色素沉著，所述方法包括測定測試化合物調(diào)節(jié)NCKX介導(dǎo)的鈣離子跨膜運(yùn)動的能力(例如，NCKX5)。所述方法包括使包含NCKX分子或其變體、融合體或衍生物的膜暴露于測試化合物，并直接或間接地測量所述膜的一側(cè)或兩側(cè)的鈣離子濃度的步驟。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的方法中有用的試劑盒、核酸分子、多肽和細(xì)胞。文檔編號G01N33/50GK101657720SQ200780028600公開日2010年2月24日申請日期2007年5月30日優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日發(fā)明者C·D·賈曼,M·R·格林,P·P·M·施內(nèi)特坎普,R·M·奧博恩,R·S·金格爾,S·威爾遜,W·費(fèi)爾塞爾申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司