專利名稱：二次離子質量分析方法以及成像方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種二次離子質量分析方法以及成像方法。
背景技術：
近年，在生物化學和醫(yī)學的領域，開始著眼于在分子級別解析生物體，
并作為圖像顯示的質譜成像技術(以下稱為"IMS")的方法。該IMS是如 下方法，即，例如，通過二次離子質量分析法(secondary ion mass spectrometry ; 以下稱為"SIMS")， 激光解吸離子化 (laser desorption/ionization;以下稱為"LDI")，基體輔助激光解吸離子化法 (matrix-assisted laser desorption/ionization;以下稱為"MALDI")，將試樣的 任意部位離子化，通過飛行時間型質量分析法(TOFMS)進行質量分析， 使上述試料的物質的分布或局部狀態(tài)可視化的方法(非專利文獻1、非專利 文獻2)。通過該手法，如果測定蛋白質、肽、環(huán)境荷爾蒙等各種有機化合 物，則例如通過檢測出細胞級的功能變化而進行的超早期診斷、針對性醫(yī) 療(亍一，一乂^ K醫(yī)療)、候選新藥的挑選、新藥派送的檢索、弄清生命 現象或疾病等變?yōu)榭赡?，所以作為一種極有用的手法而被人們所期待。
具體來說，使用了 SIMS的IMS是利用二次離子的方法，該二次離子 是使加速并聚束至3 ~ 25keV的一次離子在高真空中照射在試料上，在物質 從上述試料的表面濺射時產生的。通常，作為一次離子源，使用產生Ga+ 或ln+的離子束的液體金屬離子源(liquid metal ion source;以下稱為"LMI")， 離子束的聚束徑通常為l|im，最大能夠實現lOOnm。并且，作為低價的一 次離子源的Cs+離子槍，其光斑直徑(spotdiameter)為2 3iim。
并且，LDI是使用激光束的方法，而不是如SIMS那樣使用一次離子束。 關于光照射，必須要有被試料或媒質吸收的波長的激光、試料分子的氣化 所需的充足的照射能量密度、以及適當的脈沖寬度(106~101QW/cm2)的激 光。作為代表光源，例如有4倍頻的Nd/YAG激光(波長266nm、脈沖寬
5度10ns、脈沖能量10m)，通常所使用的光斑直徑為1 5^im左右。
MALDI是在試料表面添加輔助有機分子離子化的基體，并照射激光束 的方法，通過上述基體，該方法具有抑制有機分子的分解并促進解吸和離 子化的優(yōu)點。作為光源，通常使用N2激光(波長337nm、脈沖寬度4ns) 或3倍頻Nd: YAG激光(波長355nm、脈沖寬度10ns)，照射能量比LDI 小很多，為105~ 1()8w/cm2左右。
但是，在使用SIMS的情況下，雖然橫向分辨率(lateral resolution)優(yōu) 良，但存在以下問題。例如，由于生物體試料中的原子和離子的彈性碰撞 而破壞蛋白質等有機分子，因此每個分割試料表面的極小單位只能進行一 次測定。并且，來自于有機分子的二次離子生成量在一次離子的積分照射 量超過一定的值(static SIMS limit)時，逐漸減少并消失，SIMS的static SIMS limit為大約10 1(^個/cm2，當使一次離子電流密度為lnA4m^時，照射 時間為大約15~150pS，圖像中存在大的問題點。如上所述，只能進行一次 測定，并且，在離子化效率差并且來自有機分子的二次離子生成量低的情 況下，不能進行充分的測定，使用SIMS的方法中靈敏度成為問題。另外， SIMS中還存在由一次離子的電荷而引起的試料的帶電(充電)問題。
并且，由于SIMS的使用的質量范圍達到500左右，所以不適合于測 定蛋白質等目標。因此，提出將甘油等不發(fā)揮性液態(tài)化合物作為液體基體 而添加的二次離子質量分析(liquid-SIMS，以下稱為"LSIMS")，能夠將實 用的質量范圍擴大到3000左右。但是，雖然能夠擴大質量范圍或回避static SIMS limit而提高靈敏度，但是存在物質分布散亂的問題。
另一方面，在使用LDI的情況下，不存在如SIMS那樣的試料表面充 電的問題，并且與SIMS的static SIMS limit相當的離子生成量的減少比 SIMS少。但是，由于每1個脈沖的離子生成量非常小，因此需要多次脈
沖照射并反復進行測定和信號積分，該方法也存在靈敏度的問題。
而且，在MALDI的情況下，與SIMS或LDI的實用的質量范圍至500
左右相對，即使對蛋白質那樣的超過該范圍的質量范圍的目標也能進行測 定，能夠實現非常優(yōu)良的靈敏度。但是，根據基體的組成或添加方法，存 在物質分布的變動的問題。并且，通過基體內部的能量傳播，離子生成部 位擴大得比照射光斑直徑大，所以，即使激光束聚束至極限，也難以實現高的橫向分辨率。
非專利文獻1:內藤康秀，"以生物體試料為對象的質量顯微鏡"，J.MassSpectrom. Soc.Jpn. Vol. 53， No.3 pl25-132， 2005
非專利文獻2:新間秀一、瀨籐光利、"成像質譜分析的動向"J.MassSpectrom. Soc. Jpn Vol. 53， No.4 p230-238， 200
發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種能夠以優(yōu)良的靈敏度進行蛋白質或環(huán)境荷爾蒙等有機分子分析的新方法。
本發(fā)明是一種提高了靈敏度的二次離子質量分析方法，其所涉及的二
次離子質量分析方法包括準備被分析試料的工序，該被分析試料的分析
對象分子以埃摩爾(amol)或亞埃摩爾級存在于照射一次離子束的區(qū)域中；向被分析試料照射一次離子束的工序；以及對二次離子進行質量分析的工序，該二次離子通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生，上述一次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。
并且，本發(fā)明是一種使用二次離子質量分析的成像方法，其所涉及的成像方法包括向被分析試料照射一次離子束的工序；對二次離子進行質量分析的工序，該二次離子通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生；以及基于得到的二次離子的質量分析結果進行圖像處理的工序，上述一次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。
另外，本發(fā)明是一種成像裝置，包括對被分析試料進行二次離子質
量分析的二次離子質量分析單元、以及基于得到的二次離子的質量分析結
果進行圖像處理的圖像處理單元，上述二次離子質量分析單元具有離子源、將一次離子束照射于被分析試料表面的照射單元、以及對通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生的二次離子進行質量分析的質量
分析單元，上述離子源是產生1.25keV/amu以上的重離子束的離子源，上述照射單元具有將從上述離子源產生的一次離子束控制在1.25keV/amu以上的控制單元。
本發(fā)明通過在二次離子質量分析法(以下稱為SIMS。)中使用1.25keV/amu以上的重離子束(以下稱為"高速重離子束")作為一次離子束，從而即使被分析試料為蛋白質或多糖類等生物體關聯物質，也能夠抑制如以往的SIMS那樣的上述生物體關聯物質的破壞，提高離子化效率。因此，根據本發(fā)明，能夠以高靈敏度分析蛋白質等生物體關聯物質。并且，
由于不需要如以往的LSIMS或MALDI那樣的基體，所以能夠實現高橫向分辨率。并且，根據本發(fā)明，由于能夠以高靈敏度對生物體關聯物質進行質量分析，所以能夠根據得到的分析進行圖像顯示(成像)。如果能夠進行圖像顯示，則能夠容易地確認生物體關聯物質的有無及其分布，因此，本發(fā)明作為生物體關聯物質的新的分析方法，在例如臨床、新藥研制等醫(yī)學領域或生物學等各領域中極為有用。


圖1是表示本發(fā)明的SIMS裝置的一個例子的示意圖。
圖2是表示本發(fā)明的成像裝置的一個例子的示意圖。
圖3是表示本發(fā)明的SIMS的一個例子的示意圖。
圖4是本發(fā)明的一實施例的關于海藻糖薄膜的質譜分析的結果。
圖5是本發(fā)明的其它實施例的關于海藻糖薄膜的質譜分析的結果，(A)
為正離子的結果，(B)為負離子的結果。
圖6 (A)是表示海藻糖相對Au離子束的阻止能(電子的阻止能/核的
阻止能)與離子束的能量之間的關系的圖表。
圖6 (B)是表示海藻糖相對銅離子束的阻止能(電子的阻止能/核的阻
止能)與離子束的能量之間的關系的圖表。
圖6 (C)是表示海藻糖相對氧離子束的阻止能(電子的阻止能/核的阻
止能)與離子束的能量之間的關系的圖表。
圖7是本發(fā)明的其它實施例的關于精氨酸薄膜的質譜分析的結果。圖8是表示本發(fā)明的其它的實施例的二次離子收獲率與電子的阻止能
的關系的圖表。
圖9是表示本發(fā)明的其它的實施例的母離子與分解離子的比的圖表。圖IO是本發(fā)明的其它的實施例的三甘氨酸薄膜的圖像，(A)是像素數
為15X15像素的結果，(B)是像素數為30X30像素的結果，(C)是參考
的CDD圖像。
8圖11 (A)是本發(fā)明的其它實施例的三甘氨酸薄膜的圖像照片，同圖(B)是表示上述三甘氨酸薄膜的離子強度和掃描坐標的關系的圖表。
圖12是本發(fā)明的其它的實施例的關于海藻糖薄膜的質譜分析的結果。圖13是本發(fā)明的其它的實施例的關于三甘氨酸薄膜的質譜分析的結果。
圖14是關于肽的質譜分析的結果的一個例子。
圖15是關于肽的成像的結果的一個例子。
圖16是關于混合脂質試料的質譜分析的結果的一個例子。
具體實施方式
〈SIMS〉
在一個方案中，本發(fā)明是一種提高了靈敏度的二次離子質量分析方法
(SIMS)，包含以下工序準備被分析試料的工序，該被分析試料的分析
對象分子以埃摩爾(amol)或亞埃摩爾級存在于一次離子束照射的區(qū)域中；使照射一次離子束被分析試料的工序；以及對二次離子進行質量分析的工序，該二次離子通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生；上述一次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。本發(fā)明中所謂的"重離子"是指比He離子重的離子，keV/amu為表示離子束的速度的一般的單位，"amu"是Atomic Mass Unit的縮寫。
上述一次離子束的速度，如果如上述那樣為1.25keV/amu以上則沒有特別的限制，優(yōu)選為2keV/amu以上，更優(yōu)選為4keV/amu以上。并且，速度的上限也沒有特別限制，例如，為83,000keV/amu以下，優(yōu)選8,300keV/amu以下，更優(yōu)選為1,250keV/amu以下。
作為上述一次離子束的離子源，沒有特別限制，可以為例如Au、 Ar、Ga、 In、 Bi、 02、 Cs、 Xe、 SF5、 C60、 Ag、 Si、 C、 Cu等。其中，從容易構成亮度高的離子源的角度出發(fā)，優(yōu)選Ga、 In、 Au、 Bi。在離子源為Au的情況下， 一次離子種類例如有Au+、 Au2+、 Au3+、 Au4+、 Au5+，從離子原子價越大能量越高的角度出發(fā)，優(yōu)選多價離子。
上述一次離子束滿足上述速度即可，優(yōu)選與上述分析對象分子的一次離子束相對的電子的阻止能，與核阻止能同等或為由核阻止能支配的離子
9能量的重離子束。并且，例如在AU離子的情況下，與上述分析對象分子的一次離子束相對的電子的阻止能變得與核阻止能同等的分界點的離子能
量，優(yōu)選為0.5MeV以上，更優(yōu)選為1MeV以上，特別優(yōu)選為5MeV以上，其上限沒有特別限制，例如為1000MeV以下。上述阻止能是指帶電粒子前進物質中的單位長度的過程中，通過與物質的相互作用而失去能量的程度，其中，電子的阻止能是指由帶電粒子和物質的電子系的相互作用而產生的阻止能(非彈性散射的貢獻)，核阻止能是指通過帶電粒子和原子核的彈性碰撞而產生的阻止能(彈性散射的作用)。另外，對該技術領域的從業(yè)人員來說，基于技術常識能夠了解與各種離子種類相對的分析對象分子的電子的阻止能與核阻止能的關系。
另外，上述一次離子束的能量沒有特別限制，例如，優(yōu)選0.5MeV以上，更優(yōu)選lMeV以上，特別優(yōu)選5MeV以上，其上限沒有特別限制，例如為1000MeV以下。
在本發(fā)明中，上述一次離子束通常為聚束離子束，其束徑為例如5 10，OOOnm，優(yōu)選為5 1000nm，更優(yōu)選為5 100nm。并且， 一次離子束的劑量沒有特別限制，例如，為1012 1015ions/cm2，優(yōu)選為1012 1014ions/cm2，更優(yōu)選為1012 1013ions/cm2。
本發(fā)明中，上述一次離子束可以為連續(xù)模式照射(非脈沖照射)，也可以為非連續(xù)模式的照射(脈沖照射)。在脈沖照射中，頻率例如為100Hz 100kHz，優(yōu)選lkHz 100kHz，更優(yōu)選lkHz 50kHz，脈沖寬度例如為5 100ns，優(yōu)選5 20ns，更優(yōu)選5ns以下。脈沖化例如可以通過靜電場/靜磁場進行。
本發(fā)明的方法的飛行時間型離子質量分析(TOFMS)，與以往方法相同，能夠通過一次離子束的脈沖照射進行。但是，根據本發(fā)明的方法，也可以為非脈沖照射。可以通過非脈沖照射進行TOFMS的理由是基于以下機理。當照射一次離子束時，產生二次電子和二次離子，并顯示出如下性質，即，二次電子的脈沖比二次離子的脈沖高。因此，利用二次電子和二次離子的脈沖的高度的不同，決定分析的開始時間和結束時間。具體來說，如圖3的示意圖所示，從對被分析試料照射連續(xù)模式的離子起，首先，取出比二次離子的脈沖高的二次電子的脈沖信號，以其為分析開始信號。然后，取出其后產生的二次離子的脈沖(比二次電子低的脈沖)信號，以其為分析結束信號。從該分析開始信號到檢測出分析結束信號的時間為飛行
時間(TOF)。根據這樣的非脈沖照射，由于不使用離子的利用效率低(例如0.1%以下)的脈沖束，所以能夠提高離子的利用效率，并提高分辨率。并且，在非脈沖照射的情況下，與脈沖照射相比較，束的量少也可以(約lkcps 100kcps)。本發(fā)明中檢測出的二次離子可以是正二次離子和負二次離子中的任意一種，但是在進行這樣的非脈沖照射的TOFMS分析時，優(yōu)選檢測出負二次離子。另外，在非脈沖照射的情況下，通過使用二次電子等監(jiān)視脈沖間隔，從而能夠減小因脈沖的重疊所產生的噪聲。
在本發(fā)明中，上述一次離子束通常在真空中照射被分析試料為好。作為真空條件，沒有特別限制，可以采用與以往的SIMS相同的條件，例如，1(^ 1(rspa的范圍。并且，通過例如通過將一次離子與大氣隔離的薄膜而射入試料的方法、或者通過差動排氣而維持壓差，也可以在大氣中進行照射。
在本發(fā)明的二次離子質量分析方法中，被分析試料是分析對象分子以埃摩爾(amol)或亞埃摩爾級存在于一次離子束照射的區(qū)域的被分析試料。作為被分析試料，只要是包含分析對象分子的物質則沒有特別限制，例如，生物關聯試料等。在本發(fā)明中，所謂分析對象分子，是指二次離子質量分析中作為檢測對象的分子。作為上述分析對象分子，例如有生物關聯物質和生物體高分子，具體來說，例如，蛋白質、多肽、氨基酸、單糖或多糖等糖類、DNA或RNA等核酸、脂質、以及環(huán)境荷爾蒙等。另外，本發(fā)明中的生物關聯物質不僅限于例如從生物分離(単離)的物質，還可以是例如通過酶反應或化學合成等而人工調制的物質。在本發(fā)明中，分析對象分子的分子量沒有特別限制，例如為50以上，優(yōu)選100以上，其上限也沒有特別限制，例如為10，000以下、5，000以下、或2,000以下，例如，50 10，0000，優(yōu)選100 5，000，更優(yōu)選100 2,000,進而更優(yōu)選100 500。
本發(fā)明的二次離子質量分析方法基于以下知識，即，作為一次離子束的重離子束的能量例如為0.5MeV或越高，二次離子的收獲率越大，越不會引起分析對象分子的分解。即， 一般地認為， 一次離子束的能量越高，則一次離子束照射時，分析對象分子越容易被分解，即使收獲率提高，也
ii無法期望靈敏度提高。但是，本發(fā)明的二次離子質量分析方法中，由于能 夠提高二次離子收獲率并抑制分析對象分子的分解，所以能夠檢測出埃摩 爾或亞埃摩爾級的分析對象分子，能夠實現高靈敏度的二次離子質量分析 方法。根據本發(fā)明的二次離子質量分析方法，例如，能夠分析微量的被分
析試料。在本發(fā)明中，所謂埃摩爾或亞埃摩爾，是指例如0.01 1,000X 1(T18 摩爾，優(yōu)選0.1 100Xl(T's摩爾。本發(fā)明的二次離子質量分析方法的被分 析試料的分析對象分子以埃摩爾或亞埃摩爾級存在于照射一次離子束照射 的至少1個區(qū)域即可。
并且，由于二次離子收獲率能夠進一步提高，上述被分析試料也可以 通過例如另外添加MALDI中使用的基體劑，或在上述被分析試料的表面 蒸鍍金屬薄膜等而形成。
上述被分析試料通常配置于被分析試料用的基板(載臺)上。上述基 板的組成沒有特殊限制，例如，Si基板、ITO等透明導電帶膜基板、以及 不銹鋼等的金屬基板，另外，從一次離子的射入量少的角度出發(fā)，例如為 玻璃等的絕緣基板等。并且，從能夠進一步提高二次離子收獲率角度出發(fā)， 優(yōu)選Au或Ag等基板。 〈成像方法〉
作為其它的形式，本發(fā)明是一種使用二次離子質量分析的成像方法， 包含以下工序將一次離子束照射于被分析試料的工序、對通過上述一次 離子束的照射而從上述被分析試料產生的二次離子進行質量分析的工序、 以及基于得到的二次離子的質量分析結果而進行圖像處理的工序，上述一 次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。關于一次離子束及其照射條件， 以及二次離子的質量分析方法，如上所述。在本發(fā)明的成像方法中，被分 析試料包含分析對象分子，例如生物關聯試料等，上述分析對象分子的含 有量沒有特別限制。作為上述分析對象分子，如上所述，例如有生物關聯 物質、生物體高分子等。上述圖像處理包含，例如，將得到的二次離子的 分析結果變換為圖像信號，以及顯示變換的圖像信號，這些可以利用以往 周知的方法進行。
作為本發(fā)明的成像方法的一個方案，例如有如下成像方法，該方法包 含使一次離子束掃描并照射于被分析試料的XY平面；分別分析從上述被分析試料的各照射區(qū)域產生的二次離子；以及基于上述二次離子的質量 分析結果而得到上述被分析試料的各照射區(qū)域的圖像信號，并將對應上述 各照射區(qū)域的上述圖像信號顯示在與上述被分析試料的XY平面相當的 XY坐標上。
一次離子束的掃描方法沒有特別限制，例如，可以通過移動被分析試 料而掃描，也可以使一次離子束偏轉并移動照射部位，從容易操作的角度 出發(fā)，例如，優(yōu)選使用XY軸載臺等使被分析試料移動的方法。
在本發(fā)明的成像方法中，像素的大小沒有特別限制，例如，0.01X0.01 U m 10X 10 u m，優(yōu)選0.01 X 0.01 ti m 5 X 5 u m，更優(yōu)選0.01 X0.01 y m
1X1 um。上述像素一般為分割進行圖像處理的區(qū)域的最小單位， 一邊的 長度與掃描的一次離子束的移動量相當。即，在本發(fā)明中，上述像素與各 照射區(qū)域意義相同。因此，例如，將各像素的質譜分析(分析結果)轉換 成圖像信號，另一方面，將XY坐標分割為像素，并顯示對應各像素的圖 像信號，從而能夠如下述那樣使被分析試料可視化。
并且，一 個像素的分析所需要的時間沒有特別限制，例如，0.01 10sec， 優(yōu)選0.01 lsec，更優(yōu)選0.01 0.1sec。
作為本發(fā)明的成像方法的其它的形式，例如有以下成像方法，該方法 包含將一次離子束照射于上述被分析試料并面狀地產生二次離子；在維 持上述被分析試料的面上的二次離子的相對位置關系的狀態(tài)下進行質量分 析；以及基于上述二次離子的分析結果得到圖像信號，并以將其與上述位 置關系對應的方式作為離子像投影于顯示部。如下所述，這是替換一次離 子束的掃描而使用擴大離子光學系統的方法，據此，例如，由于同時檢測 出從多個位置產生的二次離子，所以，在圖像處理中，能夠實現時間的進 一步縮短。
〈SIMS裝置〉
接下來，作為本發(fā)明的進行二次離子質量分析的裝置，具有離子源、 將一次離子束照射于被分析試料的表面的照射單元、以及對通過上述一次 離子束的照射而從上述被分析試料產生的二次離子進行質量分析的質量分 析單元，上述離子源是產生1.25keV/amu以上的重離子束的離子源，上述 照射單元例如為具有將由上述離子源產生的一次離子束控制在
131.25keV/amu以上的控制單元的SIMS裝置。通過該裝置，能夠執(zhí)行上述的 本發(fā)明的SIMS。作為上述控制單元，沒有特別限制，可以使用通常的離子 加速器。
圖l表示本發(fā)明的SIMS裝置的一個例子。另外，圖1為本發(fā)明的SIMS 裝置的一個例子，但不僅限定于此。同一圖中所示的SIMS裝置具有包含 離子源11、加速器12、振動電磁鐵13及聚束/偏轉系統14的一次離子束照 射單元、以及作為質量分析單元的二次離子分析器16。雖然沒有圖示，上 述照射單元通常另外具有用于產生等離子的電極對(陰極和陽極)，以及一 次離子的引出極。上述質量分析單元通常在被分析試料15和分析器16之 間另外具有產生的二次離子的引出極、以及將引出的二次離子放大的微通 道板(MCP)等電子倍增元件。并且，被分析試料15通常配置于載臺上， 為了進行掃描分析，上述載臺優(yōu)選在XY平面上移動的XY軸載臺。
使用該裝置，例如，能夠如以下那樣進行被分析試料的SIMS。首先， 通過在陽極和陰極之間施加電壓而產生等離子，產生一次離子(重離子)， 另外，通過在陽極和陰極之間施加電極，取出上述一次離子。然后，通過 加速器12將取出的一次離子束(同一圖中的A)加速到1.25keV/amu以上， 通過使加速后的一次離子束通過分配電磁鐵13而振動后，通過聚束/偏轉 系統14 (例如偏轉板)而偏轉向被分析試料的方向。使該一次離子束照射 于被分析試料15 (例如，生物體關聯試料)，產生二次離子(同一圖中B)。 然后，施加于二次離子引出極，將二次離子導入分析器16，進行質量分析 (質量/電荷比)。引出的二次離子也可以在通過多離子板(MCP)等電子 倍增元件并放大后，通過分析器16進行質量分析。雖然沒有圖示，通過一 次離子束的照射而產生的二次離子通過加速電壓而得到運動能量，在飛行 管中向著分析器飛行。通過使該飛行管的長度變長，或者，通過使用反射 型分析計，能夠進一步提高分辨率。
上述裝置中，如果使一次離子束掃描并照射，能夠得到被分析試料的 XY平面上的分析結果。掃描例如可以通過使配置被分析試料的載臺在X 軸和Y軸方向移動而進行，也可以使一次離子束通過靜電場或靜磁場而偏 轉并移動照射部位。
另外，也可以與切割細胞的裝置(切片裝置)和二維電泳裝置相聯動。在具有上述切片裝置的情況下，例如，由于能夠連續(xù)地進行細胞的切片和
分析，所以，例如能夠對3維的分布進行解析。并且，在以往的MALDI 中，由于在被分析試料中添加基體并調制試料，所以在電泳地供給試料的 情況下，從凝膠體切割出來是必須的，而根據本發(fā)明的方法，能夠保持原 樣地分析電泳供給的試料。因此，與電泳裝置聯動，能夠以高靈敏度迅速 進行分析。
〈成像裝置〉
在作為其它的方案下，本發(fā)明一種成像裝置，包含以下單元對被分
析試料進行二次離子質量分析的二次離子質量分析單元、以及基于得到的 二次離子的質譜分析結果而進行圖像處理的圖像處理單元，上述二次離子 質量分析單元具有離子源使一次離子束照射、被分析試料表面的照射單元， 以及對通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生的二次離子進
行質量分析的質量分析單元，上述離子源是產生1.25keV/amu以上的重離 子束的離子源，上述照射單元將從上述離子源產生的一次離子束控制在 1.25keV/amu以上。作為上述二次離子質量分析單元，例如有上述SIMS裝 置。
作為本發(fā)明的成像裝置的一個方案，例如有一種成像裝置，其中，上 述二次離子質量分析單元包含使一次離子束掃描并照射于分析試料的XY 平面的掃描單元，上述圖像處理單元包含基于上述二次離子的質量分析結 果而得到上述被分析試料的各照射區(qū)域的圖像信號的圖像信號制作單元、 以及在與上述被分析試料的XY平面相當的XY坐標中顯示與上述各照射 區(qū)域相對應的上述圖像信號的顯示單元。作為上述掃描單元，例如有偏轉 單元或上述被分析試料的移動單元。
圖2表示本發(fā)明的圖像顯示裝置的一個例子。另外，圖2是本發(fā)吸的 圖像顯示裝置的一個例子，但是并不僅限于此，并且，與上述圖1相同的 位置賦予相同的符號。同一圖中所示的圖像顯示裝置在圖1所示的SIMS 裝置之外，另外具有作為圖像信號制作單元的運算部17以及顯示部18。使 用該裝置，例如能夠如以下那樣進行被分析試料的成像。
首先，如上所述，使一次離子束(圖中A)掃描并照射被分析試料15 的XY平面，在分析器16中對產生的二次離子(圖中B)進行質量分析。
15該質量分析的分析結果被輸入運算部17并被轉換為圖像信號，該被轉換的 圖像信號被輸入顯示部18并顯示被分析試料15的二維圖像。具體來說， 通過掃描照射而得到各像素的分析結果，這些分析結果被分別轉換為圖像
信號。在與被分析試料的XY平面相當的XY坐標中顯示對應該各像素的 圖像信號即可。據此，能夠顯示被分析試料的二維圖像。
從演算部17的分析結果向圖像信號的轉換沒有特別限制，可以采用以 往周知的方法。具體來說，例如，每隔作為標的m/z，將各像素的離子信號 的強度(例如離子計數或離子電流值等)置換為表示顏色的濃淡的信號即 可。例如，可以設定為離子信號的強度相對越高，則顏色的濃度相對越濃， 離子信號的強度相對越弱，則顏色的濃度相對越淡。這樣將分析結果(離 子信號的強度)置換為表示顏色的濃度的信號，并將該信號輸入顯示部。 并且，在顯示時，以被分析試料的XY平面的X軸Y軸為基準，在被分析 試料的各像素(各照射區(qū)域)的坐標(x、 y)上，顯示各像素的圖像信號 所表示的顏色，因此，被分析試料通過顏色的濃淡而作為二維圖像被顯示。 顏色的濃淡，例如能夠以灰色標度表示，該灰色標度以顏色的濃度階段地 將白到黑分割。并且，除此之外，例如，也能夠通過以Z軸(垂直軸)作 為離子信號強度的三維圖形或彩色圖像顯示。特別是在作為彩色圖像顯示 的情況下，例如，如果每隔作為標的m/z而使色相變化，則在l個圖像中， 能夠顯示多個物質的分布。
并且，代替進行一次離子束掃描的方法(即"scanning mode")，也可 以使用放大離子光學系統。該方法是以反映被分析試料表面的目的物質的 二維分布的方式，面狀地產生二次離子，在維持二次離子的相對位置關系 的狀態(tài)下進行分析，將該分析結果與位置關系相對應并作為離子像投影于 顯示部的方法(投影方法投影型)。作為具體例子，例如，如果在分析器 (檢測器)的前段或后段配置放大離子光學系統(例如靜電透鏡、靜電場 或磁場的物鏡等)，能夠將放大的離子像投影于顯示部。據此，能夠同時檢 測出從多個位置產生的二次離子，所以，在圖像處理中，能夠進一步縮短 時間。
實施例1
通過檢測出照射MeV的高速重離子束而產生的二次離子，進行海藻糖的分析。
通過旋轉覆蓋(^匕'> - 一 f < >夕')海藻糖水溶液而在單晶Si基板
上形成厚度為100nm的海藻糖薄膜。而且，將高速重離子束以下述條件照 射于該海藻糖薄膜，并檢測出產生的二次離子(負離子)。圖4表示照射 9Me V( Au5+)的離子朿時的質譜分析的結果。 (條件)
射入離子3MeV(15keV/amu)
6MeV(30keV/a—
9MeV(45keV/amu) 試料海藻糖薄膜(分子量342.30) 束的能量 10pA(根據F.C.測量，有抑制柵極) 束徑直徑2mm 脈沖50納秒，反復10kHz 測定時間500秒 1次測定的照射量 106ions
( 10 ions/cm )
入射角30°
如圖4所示，通過照射9MeV的離子束，能夠檢測出光譜分析中2分 子的葡萄糖結合的海藻糖(T-OH)的峰值。在通常的SIMS的情況下，由 于2分子的葡萄糖之間的1， 1結合被切斷，所以不能檢測出二糖的海藻糖， 但通過照射MeV的離子束，已知能夠不切斷結合而檢測出海藻糖。
并且，同樣地將離子束(6MeV Au4+)照射于海藻糖薄膜，分別檢測 出產生的正離子和負離子。其結果如圖5所示。同一圖(A)為表示正離子 的質譜分析，同一圖(B)為表示負離子的質譜分析。如同一圖中所示，通 過正離子和負離子中的任意一種，都能分別檢測出海藻糖的峰值(T-0HT、 T-H—)。特別是由于海藻糖的峰值比葡萄糖的峰值大，所以在海藻糖的情況 下，優(yōu)選通過負離子檢測。
另外，在圖6 (A)中，表示Au離子束所對應的海藻糖的阻止能(電 子的阻止能/核的阻止能)與離子束的能量的關系。在同一圖中，縱軸為阻 止能(eV/A)，橫軸為能量(MeV)，實線為電子的阻止能、虛線為核的阻止能的結果。如同一圖中所示，照射的離子束的能量約為3MeV以上時電 子的阻止能處于支配地位，因此，如果以至少1MeV以上進行離子照射， 能夠得到與上述同樣的結果。
圖6 (B)表示與Cu離子束所對應的海藻糖的阻止能(電子的阻止能/ 核的阻止能)與離子束的能量的關系。在同一圖中，縱軸為阻止能(eV/A)， 橫軸為能量(MeV)，左側的山形的線表示電子的阻止能，右側的山形的線 表示核的阻止能。如同一圖中所示，電子阻止能和核阻止能相同的能量為 700keV、 11keV/amu，電子阻止能為核阻止能的2倍的能量為1200keV、 19keV/amu。
圖6 (C)表示與C離子束所對應的海藻糖的阻止能(電子的阻止能/ 核的阻止能)與離子束的能量的關系。在同一圖中，縱軸為阻止能(eV/A)， 橫軸為能量(MeV)，左側的山形的線表示電子的阻止能，右側的山形的線 表示核的阻止能。如同一圖中所示，電子阻止能和核阻止能相同的能量為 15keV、 1.25keV/amu，電子阻止能為核阻止能的2倍的能量為30keV、
照射9MeV的高速重離子束(AuS+)，通過檢測產生的二次離子而進行精 氨酸的分析。
通過旋轉覆蓋精氨酸水溶液而在單晶Si基板上成厚度為100nm的精氨 酸薄膜(分子量174.2)。而且，將MeV的離子束以與上述實施例1相同的 條件照射于該精氨酸薄膜，并檢測出產生的二次離子(正離子)。圖7表示 該質譜分析的結果。
如圖7所示，能夠檢測出精氨酸的峰值。特別是由于能夠觀察到母離 子(Arg+H) +的大的峰值，所以可知氨基酸難以通過MeV離子束的照射而
(1)與實施例1和實施例2相同，在Si基板表面上分別形成海藻糖 薄膜和精氨酸薄膜，確認產生的二次離子的收獲率和電子的阻止能的關系。 二次離子收獲率作為二次離子和一次離子的比(二次離子/一次離子)而求 得。照射的離子束的離子種類、能量、以及規(guī)格化能量(速度的2倍)如
實施例3
18下所示。
能量規(guī)格化能量離子種類
10KeV0.25keV/amuAr+
0.5MeV2.5keV/amuAu+
1MeV5keV/amuAu2+
1.5MeV7.5keV/amuAr+
3MeV15keV/amuAr3+
6MeV30keV/amuAu4+
9MeV45keV/amuAu5+
這些結果如圖8所示。在同一圖中，數字表示離子束的能量(單位 MeV)，各個符號為表示，精氨酸的正離子(■)、精氨酸的負離子(□)、 海藻糖的正離子(▲)、海藻糖的負離子(△)的結果。如同一圖所示，通 過照射電子阻止能高的離子束，二次離子收獲率(收獲率=二次離子/一次 離子)提高。即，通過照射能量高的離子束，離子化效率提高。
(2) 將不同能量的離子束照射于精氨酸薄膜，確認母離子和分解離子 的收獲率比與電子的阻止能之間的關系。
與實施例2相同，在Si基板上形成精氨酸薄膜。然后，除了使離子束 (Au離子)的能量變化為0.5MeV、 1MeV、 3MeV、 6MeV、 9MeV以外， 進行與上述實施例相同的分析。然后，將產生的母離子(Arg+H) +和分解 離子(Arg-COOH+H) +的比作為收獲率比(Arg-COOH+H) +/ (Arg+H) + 而求得。其結果如圖9所示。
如同一圖中所示，通過照射電子阻止能高的離子束，分解離子減少。 即，通過照射能量高的離子束，能夠抑制分解離子的產生，并高效率地生 成母離子。
(3) 檢測級別
當如上述那樣將9MeV八115+的一次離子束照射于海藻糖時，海藻糖分 子離子的收獲量約為0.1分子離子/一次離子。因此(i)束徑為0.3"m， (ii)界限劑量為1012—次離子/(^12以下，(m)假定在基板表面吸附著l分子層(2X10"分子/cm2)海藻糖時，能夠檢測出IOO個海藻糖分子離子。 此時，由表面的海藻糖分子數為2X10S分子，能夠推測到能檢測出0.3埃 摩爾的分子。
并且，在進行成像的情況下，研究每1像素能夠檢測出怎樣程度的海 藻糖分子離子的問題。9MeVAuS+的一次離子束照射于海藻糖時，考慮MCP 等電子倍增元件的檢測效率，認為海藻糖分子離子的收獲量約為0.1分子離 子/—次離子。因此(i )使1像素為llxmXl"m (l(T8cm2)， ( ii )當假 定界限劑量為10"—次離子/cm2以下時，每1像素能夠檢測出1000個海藻 糖分子離子。由該結果可知，成像中能夠進行充分的分子檢測。
實施例4
(1) 將6MeV的銅離子束(95keV/amu)照射于表面覆蓋網格的三甘 醇(Gly-Gly-Gly)薄膜并進行質量分析，基于其結果進行成像處理。另外， 除特別表示的限制，其它條件與實施例1相同。
通過旋轉覆蓋三甘氨酸水溶液而在單晶Si基板上形成厚度為100nm的 三甘氨酸薄膜(lcmXlcm)，另外，以網格覆蓋上述三甘氨酸薄膜。上述 網格為每一英寸通過70條金屬線(金屬線的間隔為360um)，金屬線的粗 為大約30um。
然后， 一邊掃描一邊將6MeV的高速重離子束(銅離子束)照射于該 三甘氨酸薄膜表面，并檢測出二次離子(負離子)。然后，使用檢測結果進 行圖像處理。該圖像如圖10所示。另外，在同一圖(A)是像素數為15X 15像素的結果，同一圖(B)是像素數為30X30像素的結果。同一圖中與 光學顯微鏡圖像合而顯示(同一圖(C))。
(2) 并且，與上述三甘氨酸薄膜相對，如圖11 (A)的圖像照片中所 示，使銅離子束沿著Y軸方向(圖中箭頭)掃描，并測定產生的二次離子 的強度。另外，針孔徑為10um，掃描寬度為150iim，步寬為lum。其 結果表示于圖ll (B)的圖表中。由同一圖可知束的半峰寬約為5um。
實施例5
與實施例l相同，在Si基板上形成海藻糖薄膜，在其表面配置與實施 例4相同的網格。而且，連續(xù)照射(100cps) 9MeV的八115+束作為一次離 子，將檢測到二次電子作為分析開始信號，將檢測到負的二次離子作為分析結束信號而進行TOFMS。另一方面，以以下條件非連續(xù)地將9MeV的 AuS+束照射(脈沖照射)于同樣的海藻糖表面，并進行TOFMS。將這些結 果在圖12中合并表示。 束徑直徑2mm
束的能量5000cps (連續(xù)照射) 10pA(脈沖照射) 脈沖50納秒，反復10kHz (脈沖照射) 測定時間500秒(脈沖照射)200秒(連續(xù)照射) l次測定的照射量 106ions
( 10 ions/cm )
入射角30。
如同一圖所示，即使通過連續(xù)照射，也得到與脈沖照射相類似的光譜 分析，并且，分辨率也變優(yōu)良一些。由該結果可知，根據本發(fā)明，能夠不
進行脈沖照射而進行TOFMS。并且由于能夠減小束的量，例如，能夠實現 裝置的小型化。 實施例6
除了使二次離子飛行的飛行管的長度變化以外，與上述實施例4相同， 將6MeV的銅離子束(95keV/amu)照射于三甘氨酸(Gly-Gly-Gly)薄膜 并進行質量分析。其質譜分析的結果如圖13所示。
由同一圖中所示的光譜分析，長的飛行管的分辨率為M/AM^20，短 的飛行管的分辨率為M/AM=40，得到根據長度分辨率增加約3倍的結果。 由該結果，通過使飛行管的長度變長，BP,通過使飛行距離變長，能夠進 一步提高分辨率。
在Si基板上配置正方形的鉍平板，而制作如圖15 (A)那樣的格子狀 的槽(寬30um)。將下述肽(1154u)的溶液滴于該槽并形成薄膜，照射 6MeV的銅離子束(95keV/amu)并進行質量分析，基于其結果進行成像。 其它的質量分析的條件與實施例1相同，使用的肽為與下述結構的半胱胺 酸天冬氨酸蛋白酶-3相對的消光性熒光基質(肽研究所社制)。
MOCAc畫Asp-Glu-Val-Asp-Ala陽Pro畫Lys (Dnp) -NH2
上述肽中，MOCAc表示(7-甲氧基香豆素-4-基)乙?；?(7-Methoxycounarin-4-yl) Acetyl), Dnp表示二石肖基苯酚(Dinitrophenyl)。 圖14表示質譜分析的結果的一個例子，圖15 (2)表示成像的結果。
如這些圖所示，即使對分子量超過1000的分子也能夠良好地檢測。另外，
成像的空間分辨率為5um。 實施例8
使用以規(guī)定的比例混合的卵磷脂(PC)和肌醇磷脂(PI)的脂質混合 物(分別為Avanti Polar-Lipids社制)并在Si基板上形成膜，照射6MeV 的銅離子束(95keV/amu)并進行質量分析。其它的質量分析的條件與實施 例1相同。其結果如圖16和下列表所示。在以往的SIMS中，當被分析試 料為脂質的混合物時，不能夠檢測出它們的區(qū)別，但是根據本發(fā)明的二次 離子質量分析方法，如同一圖和下列表所示，表示能夠對混合的多個脂質 分子進行定量分析。
組成比1: 12: 14: 1
PC: PI
PI量10.670.4
實驗值10.620.34
工業(yè)實用性
如上所述，根據本發(fā)明的SIMS，例如，即使被分析試料為蛋白質或多 糖類等生物體關聯物質，也能夠抑制如以往的SIMS那樣的上述生物體關 聯物質的破壞，提高離子化效率。因此，根據本發(fā)明，能夠以高靈敏度分 析蛋白質等生物體關聯物質。并且，由于不需要如以往的LSIMS或MALDI 那樣的基體，所以能夠實現高橫向分辨率。并且，根據本發(fā)明，由于能夠 以高靈敏度對生物體關聯物質進行質量分析，所以能夠根據得到的分析進 行圖像顯示。如果能夠進行圖像顯示，則能夠容易地確認生物體關聯物質 的有無及其分布，因此，本發(fā)明作為生物體關聯物質的新的分析方法，在 例如臨床、新藥研制等醫(yī)學領域或生物學等各領域中極為有用。
權利要求
1、一種二次離子質量分析方法，是一種提高了靈敏度的二次離子質量分析方法，其特征在于，包括準備被分析試料的工序，該被分析試料的分析對象分子以埃摩爾(amol)或亞埃摩爾級存在于照射一次離子束的區(qū)域中；向被分析試料照射一次離子束的工序；以及對二次離子進行質量分析的工序，該二次離子通過上述一次離子束的照射而從上述被分析試料產生，上述一次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。
2、 如權利要求1所述的二次離子質量分析方法，其特征在于，使用飛 行時間型離子質量分析計實施對上述二次離子進行質量分析的工序，將檢 測到從上述被分析試料產生二次電子作為分析開始信號，將檢測到之后產 生二次離子束作為分析結束信號。
3、 如權利要求1或2所述的二次離子質量分析方法，其特征在于，上 述分析對象分子為生物體高分子。
4、 一種成像方法，該成像方法使用了二次離子質量分析，其特征在于， 包括向被分析試料照射一 次離子束的工序；對二次離子進行質量分析的工序，該二次離子通過上述一次離子束的 照射而從上述被分析試料產生；以及基于得到的二次離子的質量分析結果進行圖像處理的工序， 上述一次離子束為1.25keV/amu以上的重離子束。
5、 如權利要求4所述的成像方法，其特征在于， 使一次離子束掃描并照射于上述被分析試料的XY平面， 分別對從上述被分析試料的各照射區(qū)域產生的二次離子進行質量分析，以及，基于上述二次離子的質量分析結果得到上述被分析試料的各照射區(qū)域 的圖像信號，并將與上述各照射區(qū)域相對應的上述圖像信號顯示在與上述被分析試料的XY平面相當的XY坐標上。
6、 如權利要求5記載的成像方法，其特征在于，使上述一次離子束掃 描的方法是使上述一次離子束偏轉掃描的方法，或者，是使被分析試料移 動的方法。
7、 如權利要求4至6中的任意一項所述的成像方法，其特征在于，像 素的大小為5nmX5nm 20X20lim。
8、 如權利要求4所述的成像方法，其特征在于，將一次離子束照射于上述被分析試料并使二次離子面狀地產生；在維持了上述被分析試料的面 上的二次離子的相對位置關系的狀態(tài)下進行質量分析；以及基于上述二次離子的分析結果得到圖像信號，并將其與上述位置關系 相對應地作為離子像投影于顯示部。
9、 如權利要求4至8中的任意一項所述的成像方法，其特征在于，上 述一次離子束的離子種類是從Au、 Ar、 Ga、 In、 Bi、 02、 Cs、 Xe、 SF5、 C60、 Ag、 Si、 C、及Cu所構成的群中選擇的至少一種。
10、 如權利要求4至9中的任意一項所述的成像方法，其特征在于， 上述二次離子質量分析的分析對象分子為生物體高分子。
11、 一種成像裝置，該成像裝置包括對被分析試料進行二次離子質 量分析的二次離子質量分析單元、以及基于得到的二次離子的質量分析結 果進行圖像處理的圖像處理單元，其特征在于，上述二次離子質量分析單元具有離子源、將一次離子束照射于被分 析試料表面的照射單元、以及對通過上述一次離子束的照射而從上述被分 析試料產生的二次離子進行質量分析的質量分析單元，上述離子源是產生1.25keV/amu以上的重離子束的離子源， 上述照射單元具有將從上述離子源產生的一次離子束控制在 1.25keV/amu以上的控制單元。
12、 如權利要求ll所述的成像裝置，其特征在于，上述二次離子質量 分析單元包括使一次離子束掃描并照射于分析試料的XY平面的掃描單元，上述圖像處理單元包括基于上述二次離子的質量分析結果得到上述 被分析試料的各照射區(qū)域的圖像信號的圖像信號制作單元、以及將與上述 各照射區(qū)域相對應的上述圖像信號顯示于與上述被分析試料的XY平面相當的XY坐標上的顯示單元。
13、如權利要求12所述的成像裝置，其特征在于，在上述被分析試料 和上述二次離子質量分析單元之間，或在上述二次離子質量分析單元和上 述圖像處理單元之間，還具有放大離子光學系統。
全文摘要
提供一種以優(yōu)良的靈敏度分析蛋白質或環(huán)境荷爾蒙等有機分子的新方法。將重離子束用于一次離子束的二次離子質量分析方法具有高靈敏度，例如，能夠檢測出亞埃摩爾級的生物體關聯物質。據此，能夠進行良好的生物體關聯試料的成像。
文檔編號G01N27/62GK101467033SQ200780021959
公開日2009年6月24日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2006年6月13日
發(fā)明者松尾二郎 申請人:國立大學法人京都大學