專利名稱：：檢測鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種檢測豬肉中克倫特羅的試劑盒及其制備方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：鹽酸克倫特羅(clonbuterol，CLB)，俗稱"豬肉精"，對人的肝、腎及神經(jīng)有毒副作用。目前，檢測CLB的方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和ELISA方法。曾有人研究過采用固相萃取GC-MS檢測肉類樣品中鹽酸克倫特羅的殘留量和采用HPLC手性固定相分析克倫特羅對映體。HPLC-MS和GC-MS兩種方法所需的設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，通常作為大規(guī)模篩選樣品。但目前常用的顯色ELISA的檢出限一般在O.lug/L左右，而CLB的允許的最大殘留量也在O.lug/L，因此，顯色ELISA的方法難以達(dá)到檢測要求。目前，國內(nèi)外尚沒有開發(fā)生產(chǎn)豬肉精定量化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，所存在的主要技術(shù)難點是化學(xué)發(fā)光新技術(shù)的掌握和應(yīng)用，如何提高靈敏度和特異性等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠高靈敏、特異的檢出豬肉中鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的首先，本發(fā)明提供了一種能夠分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系的微生物保藏號CGMCCN0.2017;保藏時間是2007年4月25日；分類命名為Balb/c雜交瘤細(xì)胞；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所..用上述的雜交瘤細(xì)胞系注射2-4月齡的雌性裸鼠或同系小鼠(優(yōu)選為BALB/c小鼠)腹腔，收集腹水，離心，收柒上清液，純化、鑒定即得抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體。用上述所制備的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體用酶標(biāo)記后，與其它必要試劑相組合，即得到可檢測動物肉中鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒，該試劑盒主要包括以下組分用CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板；鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液；酶標(biāo)抗鹽酸克倫特羅抗體；化學(xué)發(fā)光液；洗滌液。其中，所述的CL-BSA預(yù)包被發(fā)光黑色檢測板可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，作為參考，可參照以下方法制備得到將CL-BSA稀釋到200ug/L，將發(fā)光黑色檢測板的每孔加100ul200ug/L的CL-BSA稀釋液，4。C過夜；用pH7.2的10隱PBS包被液加0.02%TWeen-20洗一遍；10mmPBS包被液(pH7.2)+0.5。/oBSA封閉，37°C2小時;再用水和保護(hù)劑的混合液吸干封閉液；37。C干燥，即得。所述的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液為10個不同濃度梯度的溶液，其濃度分別為0.Ong/ml，0.01ng/ml,0.02ng/ml，0.04ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，分別分裝為10瓶，每瓶6ml;鹽酸克倫特羅可通過商業(yè)途徑購買得到，例如購自Sigraa等；上述的試劑盒中，用以標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的酶可以是辣根過氧化物酶(服P，純度為A430/A275〉3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛腸堿性磷酸酶(AKP)，或大腸干菌P—D—半乳糖苷酶，以服P最為常用。所述的化學(xué)發(fā)光液可以從商業(yè)途徑購買得到，例如可以購自Sigma公司。所述的洗滌液可以是ELISA試劑盒中常用的洗滌液，例如可以是100mMPBST洗滌液。本發(fā)明試劑盒的使用方法如下1、向CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板的孔中加入待檢測樣品(豬的尿液)和鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液(稀釋一系列克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液O.0，0.01,0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20,50ng/ml)50ul，同時做空白對照；2、加入酶標(biāo)標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體50ul，37。C濕盒中孵育30分鐘;3、用洗滌液洗滌每孔3次，加入化學(xué)發(fā)光液；4、化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測吸光度。本發(fā)明鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒，其特異性、靈敏度和穩(wěn)定性較現(xiàn)有的檢測試劑盒都有質(zhì)的提高，其最低檢出值為O.02ng/L，可完全滿足鹽酸克倫特羅殘留量的檢測要求。圖l敏感度和線性范圍的檢測結(jié)果。圖2穩(wěn)定性的檢測結(jié)果。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。具體實施例方式一、分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系和酶標(biāo)單克隆抗體的制備1.完全抗原體的制備1.1試驗材料1.1.l鹽酸克倫特羅(購自Sigma)1.1.2牛血清白蛋白(BSA)1.1.3冷鹽酸1,1.4NaN031.2制備過程取1.0mg/ml的鹽酸克倫特羅的溶液660ul，用冷鹽酸調(diào)至pH2.5，加入NaN03，使鹽酸克倫特羅偶氮化，將偶氮化的鹽酸克倫特羅加入BSA、OVA溶液中，置4"C冰箱過夜，次日取透析，以上操作都在4'C避光陰暗的環(huán)境下進(jìn)行，透析結(jié)束后，測定濃度，稀釋至1.0mg/ml分裝，置一2(TC凍存?zhèn)溆?，其中CLB-BSA包被抗原，CLB-OVA為免疫抗原用。克倫特羅加入亞硝酸鈉后發(fā)生偶氮化反應(yīng)，溶液顏色變黃，與載體蛋白反應(yīng)經(jīng)后透析，黃色不褪去說明偶氮化克倫特明偶聯(lián)獲得成功2、免疫方案2.l試劑與儀器2.1.170%乙醇2.1.2生理鹽水(90g/LNaCl)2.1.3注射器(小鼠1ml，家兔2-5ml)2.1.4針頭(小鼠26-G)2.1.5聚丙烯離心管2.1.6束縛固定裝置2.2操作步驟免疫抗原的處理將CLB-OVA抗原與福氏佐劑等量混合，混合物通過不同注射方法來免疫動物。所有的給藥方法都使用26-G針頭。2.2.1第一次對每一小鼠注射500nl抗原與完全福氏佐劑l:1的混和液(ip)。共注6支BALB/c雌性小鼠(抗體的實際需用量見表2);2.2.2第14天后，再次注射，但改用抗原與不完全福氏佐劑混合液；2.2.3第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經(jīng)PBS1:5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對照，用點雜交(Dotblot)法進(jìn)行測定；2.2.4第35天，所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不完全福氏佐劑混合液；2.2.5第45天，取尾靜脈血，用點雜交法再次檢測。所有血清樣品均通過與在體同位素標(biāo)記的抗原進(jìn)行免疫沉淀法檢測；2.2.6第56天，對免疫應(yīng)答最好的小鼠再靜脈注射100wl及腹腔注視100ul不完全福氏佐劑抗原混合液，而對所有其余小鼠僅腹腔注射不完全福氏佐劑抗原混合液；3.單克隆抗體的制備3.l有關(guān)實驗動物所需條件1.免疫用注視器和針頭2.通風(fēng)櫥3.濕度維持5-8%、37。C的C02孵箱4.倒置顯微鏡(具有XIO及X20物鏡，X10-15目鏡)用于細(xì)胞記數(shù)的光學(xué)顯微鏡5.紅細(xì)胞記數(shù)器6.37。C水浴箱7.洗細(xì)胞用低溫離心機(jī)8.—次性塑料培養(yǎng)板(24孔和96L)及培養(yǎng)瓶15及50ml消毒的聚丙烯錐形管消毒l，2，5及10ml的吸管及吸液器低溫冰箱(-80°C)及液氮罐。3.2試劑和設(shè)備1.生長培養(yǎng)基RPMI1640或DMEM+2mraol/L谷氨酰胺+1mmol/L丙酮酸鈉+1mmol/L非必需氨基酸+10%FCS(要測試可支持克隆生長)，青霉素100U/ml，鏈霉素IOOug/ml2.選擇培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基+1XHAT*(購自GIBC0)3.50XHAT溶液或粉劑(購自GIBC0)4.4g/L臺酚藍(lán)PBS液5.*HAT培養(yǎng)基中有三種特殊成分次黃嘌呤(Hypoxanthine，H);氨基喋呤(aminopterin，A);胸腺嘧啶(Thymidine,"，HAT即代表三個成分的字頭6.培養(yǎng)基A:RPMI1640+2mmol/L谷氨酰胺+l醒ol/L丙酮酸鈉+1mmol/L非必需氨基酸+青霉素100U/ml，鏈霉素IOOiig/ml(有的實驗室也加入10y。NCTC109培養(yǎng)基)7.培養(yǎng)基B:培養(yǎng)基A+3%FCS(見后說明)8.培養(yǎng)基C:培養(yǎng)基A+IXHAT+20%FCS(500ml)9.50XHAT液或粉劑10.PEG1500(有商品，可即用)11.lmol/L硫酸銅液12.17raol/LNH4C1水溶液(消毒，用于紅細(xì)胞溶解)13.培養(yǎng)皿(直徑IOO或60mm)14.細(xì)胞粗濾器(篩孔40ym)3.3.操作步驟3.3.1脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞制備第59天由免疫應(yīng)答最好的小鼠取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合3.3.1.l脾細(xì)胞制備1.分離取出脾臟，置于含7ml培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中(在動物房進(jìn)行)，將培養(yǎng)皿移入垂直氣流的通風(fēng)櫥中；2.將脾臟移入另一含7ml培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，用鑷子撕開脾臟，使大多數(shù)脾細(xì)胞釋出；3.用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4。C沉降5min;4.將細(xì)胞懸液移入另一50ml聚丙乙烯管，200Xg離心12min，棄上清；5.用冰冷的O.17mol/LNH4C1水溶液(2-3ml/每個脾臟)懸起沉淀，在室溫下培養(yǎng)5-10min，以溶解紅細(xì)胞，然后緩慢加入45ml培養(yǎng)基A;6.200Xg離心7min，棄上清；7.沉淀再懸入10ml培養(yǎng)基A中。3.3.1.2骨髓瘤細(xì)胞的制備1.在對數(shù)生長期收獲107-108的骨髓瘤細(xì)胞；2.200Xg離心7min，棄上清；3.輕輕震動試管以松動沉淀，將細(xì)胞懸于20ml培養(yǎng)基A中；4.200Xg離心7min，棄上清；5.細(xì)胞懸于IOml培養(yǎng)基A中，取適量進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；6.200Xg離心7min，棄上清；7.沉淀再懸于IOml培養(yǎng)基A中。3.3.2細(xì)胞融合1.以2:1混合脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞；2.加入培養(yǎng)基A到25ml;3.在室溫下，200Xg離心7min，棄上清；4.輕輕震動試管使松動沉淀，后置入37X:水浴；5.用1000ul的加樣器，緩慢(超過lmin)逐滴加入700u1經(jīng)37。C預(yù)溫的PEG1500，并用吸頭攪拌；6.經(jīng)過lmin后，緩慢(超過3min)加入5ml培養(yǎng)基A;7.再過lmin，加入7ml37"C預(yù)溫的培養(yǎng)基A;8.隔lmin，再加入7ml37。C預(yù)溫的培養(yǎng)基A(以達(dá)逐步稀釋)；9.室溫下，200Xg離心10min，棄上清；10.再將沉淀小心地懸浮于培養(yǎng)基C，使細(xì)胞終濃度為lX106脾細(xì)胞/ml;11.在已加100ul培養(yǎng)基C/孔的2-3塊96孔板中，再加入100w1/孔細(xì)胞懸液；12.置入含5-8。/。C02的37。C培養(yǎng)箱中；13.—周后，每孔吸出100ul上清，再加入100ul培養(yǎng)基C，繼續(xù)每周換液l-2次；3.3.3陽性雜交瘤克隆的篩選及通過有限性稀釋法再克隆3.3.3.l試劑與設(shè)備一般設(shè)備見前第一部分；1.培養(yǎng)基A:ROMI1640+20%FCS+2mmol/L谷氨酰胺+lmmol/L非必需氨基酸+100U/ml丙酮酸鈉+100ug/ml鏈霉素2.培養(yǎng)基B:培養(yǎng)基A+IXHAT3.培養(yǎng)基C:培養(yǎng)基A+1XHT(有商品供應(yīng))4.50XHAT溶液或粉劑(有商品供應(yīng))5.50XHT溶液或粉劑(有商品供應(yīng))6.4g/L臺盼藍(lán)PBS液7.lmol/L硫酸銅液8.選擇的篩選實驗所需的試劑和儀器設(shè)備9.為收集上清需用的96孔組織培養(yǎng)板10.24孔組織培養(yǎng)板11.如果需要克隆和亞克隆，可準(zhǔn)備3個含有飼養(yǎng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，見前)的96孔組織培養(yǎng)板3.3.3.2操作步驟3.3.3.2.l繼續(xù)細(xì)胞融合實驗1.細(xì)胞融合后l周，在倒置顯微鏡下確定含有生長中雜交瘤的孔，用細(xì)頭標(biāo)記筆做好記號；2.每孔吸出一半體積并加入2滴培養(yǎng)基B;3.細(xì)胞融合后第12-14天，當(dāng)孔中細(xì)胞長滿，培養(yǎng)基變成黃色時，從每孔吸出100ul，注意不要影響孔底的雜交瘤細(xì)胞。將上清移入包被CI-BSA的96孔板，檢測有無分泌抗體存在；如果有多個雜交瘤生長的孔，對各孔有無抗體生成及是否污染都進(jìn)行測定，這樣能更快得以判斷以確保安全；4.各孔加入2滴培養(yǎng)基C;5.將陽性細(xì)胞移入24孔板，并加入lml培養(yǎng)基A;6.—般細(xì)胞在48小時后長滿，每孔取出100yl或更多上清，進(jìn)行第二次篩選試驗；7.每孔加入3-4滴培養(yǎng)基A;8.如果陽性孔已確定，立即進(jìn)行第一次克??；9.盡快將其余的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行擴(kuò)增并將其凍存(方法見前---)。這可避免在克隆過程中遇困難，而失去需要的雜交瘤細(xì)胞。3.3.3.2.2用限定性稀釋法進(jìn)行克隆1.在進(jìn)行克隆的前一X，準(zhǔn)備3個含有100ul詞養(yǎng)細(xì)胞的96孔板。如不用飼養(yǎng)細(xì)胞(參照后述實驗要點及說明)，則在加入種植細(xì)胞前每孔先加100"1培養(yǎng)基A;2.將細(xì)胞再懸浮，用血細(xì)胞il數(shù)器計數(shù)，并用苔酚藍(lán)法計算細(xì)胞死亡率；3.加入培養(yǎng)基A制備含200個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液15ml;4.用此上清進(jìn)行一定倍比稀釋(見圖2-3-2)。即三培養(yǎng)塊板，各板以六條(列)為單位，逐次進(jìn)行l(wèi):1稀釋，在第一板第單位(前六列)每孔加入含200個細(xì)胞/ml的培養(yǎng)液100yl，其它各單位每孔均加入含不同稀釋度細(xì)胞的培養(yǎng)液100u1;5.在含5-8%C02的37"濕性孵箱中培養(yǎng)10-12天，注意觀察；6.大約第五天開始在倒置顯微鏡鏡下可見單個克隆(1克隆/孔)；7.大約7-10天可見克隆長滿；8.如下測定20-40孑L:(1)稀釋度為l，2，及3的單位測定2-10個孔；(2)稀釋度為4的單位測定10-15個孔；(3)稀釋度為5的單位測定5-10個孔；(4)稀釋度為6的單位測定5孑L;9、重復(fù)克隆操作，直至每孔均測出陽性。3.3.4細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇1.陽性雜交瘤細(xì)胞同時雙分傳代，并盡早液氮凍存(將所得到的陽性雜交瘤細(xì)胞系提交保藏，微生物保藏號是CGMCCN0.2017;保藏時間是2007年4月25日；分類命名為Balb/c雜交瘤細(xì)胞)，每種細(xì)胞株至少凍存5-10支管。2.定期(如一年)進(jìn)行復(fù)蘇檢査其再生情況，傳代后再凍存。3.凍存細(xì)胞保護(hù)劑可參照第一章細(xì)胞培養(yǎng)的凍存和復(fù)蘇方法部分。3.4腹水法規(guī)模的抗體制備3.4.l試劑及設(shè)備1.2-4月齡的雌性裸鼠或同系小鼠(常用BALB/c)2.PBS3.降植院(Prisane，2，6，10，14-tetramethylpentadecane)4.lml注射器5.20-22G注射用針頭6.18G針頭用丁抽取腹水3.4.2在體內(nèi)產(chǎn)生腹水1.動物按正規(guī)要求飼養(yǎng)；2.在細(xì)胞注入前1-2周，通過腹腔注射0.5ral降植烷免疫小鼠(裸鼠或具有與雜交瘤同樣H-2型單原型B細(xì)胞的小鼠)；3.雜交瘤細(xì)胞在其培養(yǎng)基中生長(川25ml或75m的培養(yǎng)瓶)；4.在細(xì)胞的對數(shù)生長期收獲細(xì)胞，通過苔酚藍(lán)排除實驗檢測細(xì)胞的成活率，需達(dá)〉90%。5.1000Xg在20。C離心10min。用PBS洗兩次，并調(diào)節(jié)到細(xì)胞數(shù)為2-10X107/ml;6.腹腔注射0.5mlPBS(含1-5X106細(xì)胞)/小鼠，1-2周后發(fā)展成癌性腹水;7.用18號針頭插入腹腔、用15ml試管接取腹水，如有凝塊形成，可用消毒牙簽挑出，棄之；8.在37'C培養(yǎng)1小時，置4"C過夜；9.腹水3000Xg在4t:離心10min，除去細(xì)胞及碎片，收集澄清的上清液(棄除油脂)，10.每3-4天一次，此小鼠在死前可放腹水2-3次；11.加入0.05%疊氮鈉，分裝小管，為長期保存可迅速凍存于-7(TC,在應(yīng)用中可置4"保存。3.5單克隆抗體純化3.5.1初純硫酸銨沉淀法3.5.1.l試劑及儀器組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等硫酸銨(NH4)S04飽和硫酸銨溶液(SAS)蒸餾水PBS(含0.2g/L疊氮鈉)透析袋超速離心機(jī)pH計磁力攪拌器3.5.1.2實驗步驟以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹杭體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相問。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為33%—50%。l.配制飽和硫酸銨溶液(SAS)將767g(NH4)2S04邊攪拌邊慢慢加到l升蒸餾水中。用氨水或硫酸調(diào)到pH7.0。此即飽和度為100%的硫酸銨溶液(4.1raol/L，25°C);2.沉淀1)、樣品(如腹水)20000Xg離心30min，除去細(xì)胞碎片；2)、保留上清液并測量體積；3)、邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS到上清液中，終濃度為l:1(v/v);4)、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時或攪拌過夜(4°C)，使蛋白質(zhì)充分沉淀。3、透析1)、蛋白質(zhì)溶液IOOOOXg離心30min(4°C)。棄上清保留沉淀；2)、將沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對PBS-0.2g/L疊氮鈉透析24-48小時(4'C)，每隔3-6小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；3)、透析液離心，測定上清液中蛋白質(zhì)含量。3.5.2精純親和層析純化法(蛋白A或蛋白G法)3.5.2.l試劑及儀器含IgG的樣品PBS緩沖液裝有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型層析柱(有商品供應(yīng))透析袋(MWCO10,000)結(jié)合緩沖液0.lmol/LTris-HC1pH7.5+0.15mol/LNaCl分步收集器(可按需要選用)洗脫緩沖液O.lmol/LGly-HC1pH2.8+0.15raol/LNaCl中和緩沖液:lmol/LTris-HClpH8.0蠕動泵(可按需要選用)UV監(jiān)測器pH計3.5.2.2操作步驟*樣品(可為血清、腹水、含有IgG的單克隆和多克隆抗體的細(xì)胞上清液)。1.樣品在4'C,對結(jié)合緩沖液透析過夜，或?qū)⑵渑c至少l:1稀釋的結(jié)合緩沖液混合；2.如果條件充許，將層析柱與蠕動泵、分步收集器和UV監(jiān)測器相連；3.至少用10ml結(jié)合緩沖液，以lml/min速度，洗滌柱中的2ml親和層析介質(zhì)；4.上樣；5.—旦樣品進(jìn)入凝膠，用結(jié)合緩沖液洗柱(至少IO個柱體積)，直至A280nm小于O.03;6.用洗脫緩沖液洗脫所結(jié)合的IgG，分布收集2ml/管；7.收集過程中，每管立即加入O.lml中和緩沖液，以中和洗脫所得的IgG液。8.含IgG的各管對PBS透析，其后根據(jù)抗體的穩(wěn)定性，加入防腐劑(0.020g/L疊氮鈉)，置4X:或冷凍保存。4.抗體的酶標(biāo)記4.l試劑及儀器1.親和純化的多克隆抗體或生物化學(xué)純的單克隆抗體(5fflg/nilPBS液或0.lmol/L磷酸緩沖液pH6.8)2.用以標(biāo)記的酶(EIA級，有商品供應(yīng))辣根過氧化物酶(服p，純度為A430/A275〉3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛腸堿性磷酸酶(AKP)，或大腸干菌e—D—半乳糖苷酶均可選用，但以HRP最為常用。3.25%戊二醛液(電鏡級)4.0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(p服.8)5.PBS6.2mol/L甘氨酸液7.蒸溜甘油8.透析袋(分子量6000-8000)9.電磁攪拌器和攪拌棒4.2操作步驟4.2.l抗體與過氧化物酶偶聯(lián)1.將5mg抗體與10mg酶在總體積lml的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(p服.8)混合；2.在4。C對0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)透析過夜；3.用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(p朋.8)稀釋戊二醛至lo/。；4.向透析混合液中加入50"1稀釋過的戊二醛，在室溫下輕輕攪拌3小時；5.加入2mol/L甘氨酸液使最終濃度達(dá)到O.1mol/L，混合液室溫放置2小時，以封閉殘存的醛基6.混合液在4"對PBS透析過夜；7.10000Xg4。C離心30分；8.將上清移入另一管中，按體積l:1加入甘油，使終濃度達(dá)50%;9.置-2(TC保存。4.2.2酶標(biāo)物的純化二、試劑盒制備和檢測方法的優(yōu)化1.試劑盒的制備1.l材料和設(shè)備鹽酸克倫特羅，Sigma產(chǎn)品發(fā)光黑色檢測板(購自Seebio)化學(xué)發(fā)光檢測儀(美國Maxwell)10mmPBS包被液pH7.2PBST洗滌液100麗，pH7.4，0.02%TWeen-20化學(xué)發(fā)光液(Sigma)1.2試劑盒制備1.2.1CLB-BSA包被發(fā)光黑色檢測板的制備1.2.1.1CLB-BSA包被發(fā)光黑色檢測板將CLB-BSA稀釋到濃度200ug/L，每孔加100ulCLB-BSA稀釋液，4。C過夜；1.2.1.2洗滌10畫PBS包被液PH7.2+0.02%TWeen-20洗一遍；1.2.1.3封閉10隨PBS包被液PH7.2+0.5。/oBSA封閉，37°C，2小時；1.2.1.4保護(hù)加入5%蔗糖溶液，吸干液體；1.2.1.537。C干燥1.2.1.6內(nèi)包裝1.2.2酶標(biāo)抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體分裝按4000倍稀釋，稀釋液為1(MMPBS包被液PH7.2+20%小牛血清+防腐劑+穩(wěn)定劑1.2.3化學(xué)發(fā)光液分裝每瓶6ML1.2.4鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液0.0，0.01，0.02,0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml分裝，每瓶6ML。3.本發(fā)明試劑盒的制備或檢測條件的優(yōu)化3.1最佳競爭時間的確定競爭時間分別IO、20、30、40、50、60，測定光強(qiáng)度。CLB標(biāo)準(zhǔn)溶液和一抗添加到酶標(biāo)板后，測定不同競爭時間(1060min)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ED50(medianeffectdose)和最大光強(qiáng)度(LUmax)等參數(shù)值隨競爭時間的變化。可以看到，反應(yīng)時間在1030min內(nèi)，LUmax隨時間延長而增大，而ED50隨時間延長而減??；反應(yīng)時間超過30min，LUmax變化趨于平穩(wěn)，而ED50卻增加；因此，本系統(tǒng)的最佳競爭反應(yīng)時間為30min，此時，ED50最小，LUmax/ED50最大。3.2最佳TWeen-20最優(yōu)濃度的確定。0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%分別測定光強(qiáng)度。Tween220濃度小于O.05%時，LUmax和ED50均減小;大于O.05%時，LUmax減小，而ED50變化不大；等于O.05%時，ED50較小，LUmax/ED50最大，另外，此時測定非特異吸附也比較小，因此選擇O.05y。為Tween220的最優(yōu)濃度3.3最佳PBS離子強(qiáng)度的確定10、50、100、200、500、1000MM分別確定光強(qiáng)度PBS的離子強(qiáng)度對ic2CLEIA的影響結(jié)果?？梢钥吹?，PBS濃度對CLB的ic2CLEIA的影響明顯。LUmax和ED50均隨著PBS溶液的離子強(qiáng)度增加而減小。PBS濃度為200mmol/L時，LUmax/ED50最大，所以選擇0.2mol/L為PBS的最佳濃度。3.4最佳PBS的pH值得確定p朋.O、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5分別測定光強(qiáng)度，由于pH可以影響CLB標(biāo)準(zhǔn)溶液和其它試劑的離子化，因此，pH對非共價結(jié)合的抗原抗體反應(yīng)和ELA測定靈敏度有影響。圖4為不同pH對ic2CLEIA影響的曲線。從圖中可以看到，pH小于8.5時，隨pH增大，ED50下降很快(從3.l下降到l.25),LUmax有下降趨勢，但下減幅度不是很大。pH小于6.0時，反應(yīng)被完全抑制。pH等于8.5時，LUmax為1.02，同時LUraax/ED50最大，8.5為PBS和CLB標(biāo)準(zhǔn)溶液的最佳pH。三、試劑盒的檢測方法及檢定l.試劑盒的檢測步驟瘦肉精克倫特羅化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒使用目的檢測標(biāo)本中的瘦肉精克倫特羅試驗原理本試劑盒采用采用偶聯(lián)到BSA包被板化學(xué)發(fā)光板，并配以辣根過氧化物酶標(biāo)記瘦肉精克倫特羅，采用競爭法，與同樣處理的瘦肉精克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)比較，通過化學(xué)發(fā)光儀測定光強(qiáng)度，計算標(biāo)本中痩肉精克倫特羅的含量主要組成CLB-BSA預(yù)包被板l塊(8X12);克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液0.00，0.01，0.02，0.04,0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml分裝，每瓶6ml。酶標(biāo)抗體6ml化學(xué)發(fā)光液6ml10x濃縮洗滌液50ml適用儀器1化學(xué)發(fā)光儀428nm波長。2微孔板清洗器(也可手工洗板)。樣本要求新鮮。如果樣本不立即使用，置4'C保存7日內(nèi)應(yīng)用。檢測步驟(1)向CLB-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板的孔中加入待檢測樣品(豬的尿液)和鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液(稀釋一系列克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液O.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5,10，20，50ng/ml)50ul，同時做空白對照；(2)、加入酶標(biāo)標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體50ul，37。C濕盒中孵育30分鐘；(3)、用洗滌液洗滌每孔3次，加入化學(xué)發(fā)光液；(4)、化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測吸光度。(5)、采取方陣滴定，見表l。CLB-BSA包被由A-D和由l-4包被濃度20ug/L;由A-D和由58包被濃度200ug/L;由E-H和由1-4包被濃度400ug/L，由E-H和由5-8包被濃度800ug/L，克倫特羅1-4和5-8分別濃度0.Olng/L-0.08ng/L;酶標(biāo)抗體的稀釋濃度A-D和E-H分別為l:500、1000、2000、4000;表l方陣滴定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(6)數(shù)據(jù)處理采用四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線公式Y(jié)=(a—d)/(1+(X/C)b]+dY各標(biāo)本擬合的吸光度A為O標(biāo)準(zhǔn)時的吸光度D為空白對照的吸光度X各標(biāo)準(zhǔn)的濃度cEDs。的濃度b為EDs。的斜率注意事項1、試劑盒28"C保存，有效期內(nèi)使用。2、嚴(yán)格按說明書操作，反應(yīng)溫度和時間必須嚴(yán)格控制，不同批號試劑請勿混用。3、請將拆封后未用完的包被板放人塑料袋內(nèi)封緊保存。包裝、規(guī)格盒裝，96人份/盒貯存冷藏28'C有效期12月2.半成品檢定2.1包被黑色發(fā)光板的檢測取正常豬尿稀釋100ug/LCLB標(biāo)準(zhǔn)儲液，配成O.lng/ml(低濃度)，2ng/ml(中濃度)和8ng/ml(高濃度)。以質(zhì)量已確定的酶標(biāo)抗體進(jìn)行每個濃度6次重復(fù)，分別計算批間(連續(xù)測定4d)和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率。批內(nèi)批間的變異系數(shù)CV。/。都小于10。/。，說明本發(fā)光板的準(zhǔn)確性在實驗誤差范圍之內(nèi)。而平均回收率在98120%之間也表明本發(fā)光板的平行性和準(zhǔn)確性較高，能夠用于實際尿樣的檢測2.2酶標(biāo)抗體的檢測取正常豬尿稀釋100Pg/LCLB標(biāo)準(zhǔn)儲液，配成O.lng/ml(低濃度)，2ng/ml(中濃度)和8ng/ml(高濃度)。以質(zhì)量己確定的發(fā)光板進(jìn)行每個濃度6次重復(fù)，分別計算批間(連續(xù)測定4d)和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率。批內(nèi)批間的變異系數(shù)(^%都小于10%，說明酶標(biāo)抗體的準(zhǔn)確性在實驗誤差范圍之內(nèi)。而平均回收率在98120。/。之間也表明ic2CLEIA的平行性和準(zhǔn)確性較高，能夠用于實際尿樣的檢測2.3標(biāo)準(zhǔn)液的檢測取正常豬尿稀釋100ug/LCLB標(biāo)準(zhǔn)儲液，配成O.lng/ml(低濃度)，2ng/ml(中濃度)和8ng/ml(高濃度)。以質(zhì)量已確定的發(fā)光板和酶標(biāo)抗體進(jìn)行每個濃度6次重復(fù)，分別計算批間(連續(xù)測定4d)和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率。批內(nèi)批間的變異系數(shù)(^%都小于10%，說明自行配制的標(biāo)準(zhǔn)在實驗誤差范圍之內(nèi)。而平均回收率在98120%之間也表明自行配制的標(biāo)準(zhǔn)的平行性和準(zhǔn)確性較高，能夠用于實際尿樣的檢測2.4化學(xué)發(fā)光液的檢測四、本發(fā)「'in式劑盒各項性能的檢測結(jié)果1精確性和準(zhǔn)確性的檢測取正常豬尿稀釋100ug/L，將CLB標(biāo)準(zhǔn)儲液配成O.lng/ml(低濃度)，2ng/ml(中濃度)和8ng/ml(高濃度)。每個濃度6次重復(fù)，分別計算批間(連續(xù)測定4d)和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率。批內(nèi)批間的變異系數(shù)cvy。都小于i()y。，說明本ic2CLEIA的準(zhǔn)確性在實驗誤差范圍之內(nèi)。而平均回收率在98120%之間也表明1C2CLEIA的平行性和準(zhǔn)確性較高，能夠用于實際尿樣的檢測。2敏感度和線性范圍的檢測稀釋一系列克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液O.0,0.01，0.02，0.04，0.1，0.5,5，10，20，50ng/ml，按常規(guī)方法操作，檢測發(fā)光強(qiáng)度分別為0.001、0.001、0.002、0.003、0.006、0.029、0.302、0.612、1.205、1.76;在O.02ng/L和30ng/L，成線性范圍y=0.0593xR2=0.9997，最小檢測值為0.02ng/L(圖l)。3穩(wěn)定性的檢測37°C，7天檢測敏感度和線性范圍。稀釋一系列克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液O.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20,50ng/ml，按常規(guī)方法操作，發(fā)光強(qiáng)度分別為O.0010.0010.0020.0030.0060.030.2990.6011.1881.54在O.02ng/L和28ng/L，成線性范圍y=0.0568x，R2=0.9977，最小檢測值為O.02ng/L(圖2)。4陽性和陰性標(biāo)本的符合率將本發(fā)明試劑盒與國外知名廠家的化學(xué)電發(fā)光試劑盒分別檢測98份臨床樣品。其中63份瘦肉精的尿(其中包括添加瘦肉精10ng/L的5份)，應(yīng)用本發(fā)明化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測陽性為62份，符合率98.4%(62/63)，35份陰性尿樣檢測全部陰性，符合率為100%。本試劑盒檢測上述樣品，陽性和陰性符合率分別為98.4%和IOO。統(tǒng)計學(xué)顯示相關(guān)性好，r=0.995。權(quán)利要求1、分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系的微生物保藏號是CGMCCNO.2017；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2、權(quán)利要求l雜交瘤細(xì)胞系所分泌的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體。3、一種制備權(quán)利要求2抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的方法，包括用權(quán)利要求l的雜交瘤細(xì)胞系注射2-4月齡的雌性裸鼠或同系小鼠腹腔，收柒腹水，離心，收集上清液，純化、鑒定即得。4、一種檢測鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒，包括用CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板，鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液，酶標(biāo)抗體，化學(xué)發(fā)光液，洗滌液；其中所述的酶標(biāo)抗體是將權(quán)利要求2的單克隆抗體用酶標(biāo)記后所得到的酶標(biāo)抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體。5、按照權(quán)利要求4的試劑盒，其特征在于，用于標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的酶是辣根過氧化物酶，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛腸堿性磷酸酶或大腸干菌e一D—半乳糖苷酶。6、按照權(quán)利要求4的試劑盒，其特征在于，所述的用CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板按照以下方法制備得到將CL-BSA稀釋到200ug/L，將發(fā)光黑色檢測板的每孔加100ul200ug/L的CL-BSA稀釋液，4。C過夜；用pH7.2的10腿PBS包被液加0.02%TWeen-20洗一遍；10mmPBS包被液(pH7.2)+0.5。/。BSA封閉，37°C2小時；再用水和保護(hù)劑的混合液吸干封閉液；37'C干燥，即得。7、按照權(quán)利要求4的試劑盒，其特征在于，所述的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液為IO個不同濃度梯度的溶液，單獨(dú)分裝，其濃度分別為0.0ng/ml，0.01ng/ml，0.02ng/ml，0.04ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml,5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml。8、權(quán)利要求4的試劑盒在檢測豬肉中鹽酸克倫特羅殘留中的應(yīng)用，包括(1)、向CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板的孔中加入待檢測樣品和鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液各50ul，同時做空白對照；(2)、加入酶標(biāo)標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體50ul，37。C濕盒中孵育30分鐘；(3)、用洗滌液洗滌每孔3次，加入化學(xué)發(fā)光液；(4)、化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測吸光度。全文摘要本發(fā)明公開了能夠分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，以及用該雜交瘤細(xì)胞系所制備的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體。本發(fā)明還公開了一種檢測鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒，該試劑盒包括用CL-BSA預(yù)包被的發(fā)光黑色檢測板，鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液，酶標(biāo)抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體，化學(xué)發(fā)光液，洗滌液。本發(fā)明鹽酸克倫特羅殘留的試劑盒，其特異性、靈敏度和穩(wěn)定性較現(xiàn)有的檢測試劑盒都有質(zhì)的提高，鹽酸克倫特羅(CLB)殘留最低檢出值為0.02ng/L，完全滿足CLB殘留量的檢測要求。文檔編號G01N33/577GK101307303SQ20071010781公開日2008年11月19日申請日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日發(fā)明者李紹銘申請人:哈爾濱仁皇藥業(yè)股份有限公司