專利名稱：：抑制TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及優(yōu)化的抗體和抗體衍生物，其與腫瘤壞死因子ot(TNFoc)結(jié)合并阻斷其功能，并具有診斷和/或治療、預(yù)防或改善與TNFoc相關(guān)的疾病的用途；它們的編碼序列、生產(chǎn)和在藥理學(xué)上合適的組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤壞死因子ot(TNFct，亦稱惡液質(zhì)素)是天然存在的哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子，由許多類型細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素或其他刺激物應(yīng)答產(chǎn)生，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。TNFoc是炎癥、免疫和病理生理反應(yīng)的主要介質(zhì)(Grell，M.，等(1995)Cell,83:793-802)?？扇躎NFoc由跨膜蛋白前體切割形成(Kriegler，等(1988)Cell53:45-53)，分泌的17kDa多肽裝配成可溶同源三聚體復(fù)合物(Smith,等(1987),J.Biol.Chem.262:6951-6954;對(duì)于TNF的綜述，參見Butler，等(1986)，Nature320:584;Old(1986)，Science230:630)。然后這些復(fù)合物與各種細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體結(jié)合。這種結(jié)合產(chǎn)生一系列促炎作用，包括(i)釋放其他促炎細(xì)胞因子，如白介素(IL)-6、IL-8和IL-1，(ii)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和(iU)上調(diào)內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)，通過吸引白細(xì)胞進(jìn)入血管外組織而進(jìn)一步放大炎癥和免疫級(jí)聯(lián)。許多紊亂與TNFot水平升高有關(guān)，其中很多具有顯著的醫(yī)學(xué)重要性。已經(jīng)證明TNFoc在很多人類疾病中被上調(diào)，包括慢性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，炎性腸紊亂包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，膿毒病，充血性心力衰竭，支氣管哞喘和多發(fā)性硬化。人TNFct轉(zhuǎn)基因小鼠組成型產(chǎn)生高水平TNFoc并發(fā)展為類似RA的自發(fā)、有害的多關(guān)節(jié)炎(Keffer等1991，EMB0J.，10,4025-4031)。因此TNFot被稱為促炎細(xì)胞因子?，F(xiàn)在TNFoc已被充分確立為RA發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵因素，RA是慢性、進(jìn)行性和使人衰弱的疾病，其特征是多關(guān)節(jié)炎癥和破壞，伴發(fā)熱、不適和疲勞的全身癥狀。RA還引起慢性滑膜炎，經(jīng)常進(jìn)展為關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞。在遭受RA的患者的滑膜液和外周血液中都發(fā)現(xiàn)TNFoc水平增加。當(dāng)將TNFot阻斷劑給予遭受RA的患者時(shí)，它們減輕炎癥、改善癥狀和延遲關(guān)節(jié)損害(McKown等(1999)，ArthritisRheum.42:1204-1208)。在生理學(xué)上，TNFa還與保護(hù)不受特殊感染的危害相關(guān)(Cerami.等(1988)，Immunol.Today9:28)。TNFcc由被革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖激活的巨噬細(xì)胞釋放。這樣，TNFoc可能是與細(xì)菌膿毒病相關(guān)內(nèi)毒素性休克的發(fā)展和發(fā)病機(jī)理中涉及的中心環(huán)節(jié)的內(nèi)源介質(zhì)(Michie，等(1989)，Br.J.Surg.76:670-671.;Debets.等(1989)，SecondViennaShockForum,p.463-466;Simpson,等(1989)Crit.CareClin.5:27-47;Waage等(1987).Lancet1:355-357;Hammerle.等(1989)SecondViennaShockForump.715-718;Debets.等(1989)，Crit.CareMed.17:489-497;Calandra.等(1990)，J.Infect.Dis.161:982-987;Revhaug等(1988)，Arch.Surg.123:162-170)。如同其他器官系統(tǒng)一樣，TNFot也被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和自身免疫紊亂中，包括多發(fā)性硬化、Guillain-Barre綜合征(傳染性神經(jīng)元炎)和重癥肌無力，和在神經(jīng)系統(tǒng)的退行性紊亂中，包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥和杭廷頓氏病。TNFoc還參與視網(wǎng)膜和肌肉相關(guān)系統(tǒng)的紊亂，包括視神經(jīng)炎、黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病、皮肌炎、肌萎縮性側(cè)索硬化和肌營養(yǎng)不良，以及神經(jīng)系統(tǒng)的損害，包括外傷性腦損傷、急性脊髄損傷和中風(fēng)。肝炎是另一個(gè)與TNFct相關(guān)的炎癥性紊亂，除了其他觸發(fā)物之外，它可以由病毒感染引起，包括EB病毒、巨細(xì)胞病毒和A-E型肝炎病毒。肝炎引起門脈和小葉區(qū)急性肝炎，隨后是纖維化和肺瘤發(fā)展。TNFot可以在癌癥中介導(dǎo)惡病質(zhì)，后者引起多數(shù)癌癥發(fā)病和死亡(TisdaleM.J.(2004)，LangenbecksArchSurg.389:299-305)。TNFoc在炎癥、細(xì)胞免疫反應(yīng)和很多疾病的病理過程中所起的關(guān)鍵作用導(dǎo)致人們探尋TNFot拮抗劑。TNFa是重要的細(xì)胞因子，它的全身阻斷帶來臨床上明顯感染的頻率和嚴(yán)重性增加的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是潛伏性結(jié)核的重新活化和可能的其他風(fēng)險(xiǎn)，包括誘發(fā)淋巴瘤、脫髄鞘疾病和心力衰竭。設(shè)計(jì)用于治療TNFot介導(dǎo)的疾病的一類TNFa拮抗劑是特異性結(jié)合TNFoc并由此阻斷其功能的抗體或抗體片段?？筎NFcx抗體的使用表明阻斷TNFa可以逆轉(zhuǎn)歸因于TNFot的作用，包括IL-1、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和組織破壞減少(Feldmann等(1997)，Adv.Immunol.-1997:283-350)。已經(jīng)提議針對(duì)TNFoc的抗體用于預(yù)防和治療內(nèi)毒素性休克(Beutler等(1985)Science:234，470-474)。Bodmer等于1993年(CriUcalCareMedicine,21:441-446,1993)、Wherry等于1993年(CriticalCareMedicine,21:436-440)和Kirschenbaum等于1998年(CriticalCareMedicine,26:1625-1626)論述了抗TNFoc抗體在治療膿毒性休克中的應(yīng)用。US2003147891中已經(jīng)>^開了一種通過給予抗TNFoc單克隆抗體或其TNFot結(jié)合片段治療人類中神經(jīng)變性疾病的方法。WO0149321教導(dǎo)了TNFcx阻斷劑，包括抗TNFot抗體治療由TNFoc引起的神經(jīng)疾病和相關(guān)紊亂的用途。它提供了一種通過給予TNFot拮抗劑來治療所述紊亂的方法。WO03047510公開了針對(duì)TNFoc的各種類型的單克隆和改造的抗體，它們的生產(chǎn)、包含它們的化合物和在藥物中的應(yīng)用。對(duì)治療TNFoc介導(dǎo)的疾病有用的抗體通常是單克隆抗體(mAB)或改造的抗體，前者通過雜交瘤技術(shù)從天然來源，通常是小鼠而產(chǎn)生。后者相應(yīng)于天然存在的抗體，因?yàn)樗鼈儼L重鏈和輕鏈，或相應(yīng)于也可以由天然抗體蛋白水解分裂產(chǎn)生的Fab片段，或相應(yīng)于單鏈scFv抗體，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)的片段通過肽接頭連接?？贵w的重鏈和輕鏈都包含恒定區(qū)和可變區(qū)。由于非人抗體具有免疫原性，因此在所謂的"雜種"抗體中，抗體中人樣序列的量常常增加，該抗體包含人IgG恒定區(qū)和與動(dòng)物抗體序列匹配的可變區(qū)，該動(dòng)物抗體在多數(shù)情況下是具有期望特異性的鼠抗體。然后這些可變區(qū)可以通過誘變進(jìn)一步被改動(dòng)變得更類似于典型的人抗體，產(chǎn)生"人源化，，抗體。在又一個(gè)可供選擇的方法中，僅僅抗原結(jié)合部分，即小鼠抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)與人抗體的構(gòu)架區(qū)結(jié)合，產(chǎn)生"CDR移植"抗體?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了針對(duì)TNFoc的單克隆抗體。Meager等IO87(Hybridoma6:305-311)描述了針對(duì)重組TNFot的鼠單克隆抗體。Shimamoto等于1988年(ImmunologyLetters17:311-318)描述了針對(duì)TNFot的鼠單克隆抗體在預(yù)防小鼠內(nèi)毒素性休克中的應(yīng)用。US5919452-i^開了抗TNFoc嵌合抗體以及它們?cè)谥委熍cTNFa存在相關(guān)的病理改變中的應(yīng)用。Feldman等于(1998)年(TransplantationProceedings30:4126-4127)、Adorini等于1997年(TrendsinImmunologyToday18:209-211)和Feld咖nn等于1997年(AdvancedImmunology64:283-350)論述了抗TNFa抗體在治療RA和克羅恩病中的應(yīng)用。這種療法中使用的TNFoc的抗體一般是嵌合抗體，如US5919452中描述的抗體。US20003187231>&開了具有結(jié)合提高的特征的含至少一個(gè)非人CDR區(qū)的人源化抗TNFa抗體。此外，在國際專利申請(qǐng)W092/11383中公開了對(duì)TNFa特異性的重組抗體，包括CDR移植抗體。Rankin等于(1995)'(BritishJ.Rheumatology34:334-342)描述了這種CDR移植抗體在RA治療中的應(yīng)用。W09211383^Hf了一種對(duì)TNFcc特異性的重組的人源化CDR移植抗體，其來源于鼠單克隆抗體61E7、hTNFI、hTNF3或101.4，并且它教導(dǎo)了所述抗體的生產(chǎn)和在診斷和/或治療與TNFcx相關(guān)的紊亂中的應(yīng)用。在僅僅最近才成為市場(chǎng)上可買到的TNFa的特異性抑制劑當(dāng)中，已經(jīng)證明針對(duì)TNFoc的單克隆、嵌合小鼠-人抗體(英夫利昔單抗，Remicade;CentocorCorporation/Johnson&Johnson)在治療RA中的臨床功效(Elliottet.al.1994,Lancet344:1105-1110;Mani等(1998)，Arthritis&Rheumatism41:1552-1563).也已經(jīng)證明英夫利昔單抗在治療炎性腸紊亂克羅恩病中的臨床功效(Baert等，1999，Gastroenterology116:22-28.)。US22002037934^公開了通過給予抗TNFot抗體如英夫利昔單抗治療肝炎。US6428787教導(dǎo)了用抗TNFoc抗體治療神經(jīng)疾病和與TNFoc相關(guān)的疾病，包括英夫利昔單抗、CDP571和D2E7。業(yè)已開發(fā)了一種人抗TNFot單克隆抗體(Abbott)D2E7(Adalimumab)治療RA和克羅恩病(W09729131)。Celltech正在開發(fā)一種人源化單克隆抗TNFotIgG4抗體CDP571(EP0626389)來治療克羅恩病，和一種人源化單克隆抗TNFoc抗體片段CDP870來治療RA。US2003185826中>^開了局部給予治療局部紊亂的所述抗體。產(chǎn)生了針對(duì)眾多不同抗原的很多單鏈抗體(scFvs)，特別是因?yàn)槭褂眉夹g(shù)，例如噬菌體展示或核糖體顯示可以容易地選擇高結(jié)合能力的抗體。而且，可以在微生物系統(tǒng)中生產(chǎn)scFv抗體，這與生產(chǎn)治療性全長抗體相比費(fèi)用較低有關(guān)。除常規(guī)細(xì)胞外和體外應(yīng)用之外，scFvs也已經(jīng)成功用于細(xì)胞內(nèi)(Worn等2000，JBC，28;275(4):2795-2803;AufderMaur等2002，JBC，22;277(47):45075-45085;StocksMR，2004，DrugDiscovToday.15;9(22):960-966);因此，已經(jīng)開發(fā)了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原的scFvs。通常，功能性scFvs的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)受到它們的不穩(wěn)定性、不溶性和形成聚集體傾向的限制。因?yàn)檫@個(gè)原因，使用所謂的"質(zhì)量控制"篩選已經(jīng)成功開發(fā)了體內(nèi)篩選scFv抗體的系統(tǒng)，其在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(例如核、細(xì)胞質(zhì))典型的還原條件下特別可溶和穩(wěn)定(W00148017;AufderMaur等(2001)，F(xiàn)EBSLett.508:407-412;AufderMaur等(2004)，Methods34:215-224)，并且已經(jīng)致使鑒定到了為了這種目的的特別穩(wěn)定和可溶的scFv構(gòu)架序列(WO03097697)。此外，這些構(gòu)架在天然氧化條件下細(xì)胞外環(huán)境中亦顯示出異常的表達(dá)水平以及穩(wěn)定性和可溶性性能增加。因此，這些有利的生物物理和生化特性轉(zhuǎn)化為有利的高產(chǎn)量和使這些抗體片段一旦對(duì)準(zhǔn)特異性抗原就能夠作為蛋白治療劑在特定治療區(qū)域進(jìn)行局部和/或全身應(yīng)用。由于scFv抗體和Fab片段與全長抗體相比缺少被單核細(xì)胞例如天然殺傷細(xì)胞的Fc受體識(shí)別的Fc部分，因此它們不引起依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)并因此不會(huì)引起由于與非靶細(xì)胞上Fc受體結(jié)合造成的無特異性的毒性。因此，需要用于治療與TNFa相關(guān)的紊亂如RA的新的有效形式的抗體，尤其是通過局部給藥可以提供持續(xù)、可控制療法且副作用程度低的治療。本發(fā)明提供了有效和連續(xù)治療關(guān)節(jié)炎及其他TNFot介導(dǎo)的紊亂的炎性過程或病理生理機(jī)制，尤其是各種形式疼痛的抗體、組合物和方法。本文引用的全部出版物和參考文獻(xiàn)以它們的整體在此引入作為參考。發(fā)明公開內(nèi)容因此，本發(fā)明的一般目的是提供在體外和體內(nèi)特異性結(jié)合TNFot的穩(wěn)定和可溶的抗體或抗體衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體衍生物是scFv抗體或Fab片段?，F(xiàn)在，為了實(shí)施本發(fā)明的這些目的和隨著描述的進(jìn)行會(huì)變得更顯然的其它目的，所述抗體或抗體衍生物表現(xiàn)出以下特征它包含是或衍生自序列SEQIDN0:1的輕鏈可變域，其與是或衍生自序列SEQIDNO:2的重鏈可變域組合，其中在衍生序列的情況下，所述序列在所述VL域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)具有最多達(dá)到5個(gè)改變和/或在所述VH域的構(gòu)架內(nèi)具有最多達(dá)到9個(gè)改變。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是所述抗體或抗體衍生物，其中在構(gòu)架區(qū)中任何位置導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，優(yōu)選在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位置VL域的4、46、65、67、70和83位，和/或在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位置VH域的ll、16、28、43、48、68、70、71、72、73、76、77、79、93和112位。更優(yōu)選，至少一個(gè)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生在SEQIDNO:3(對(duì)于VL)和/或SEQIDNO:4(對(duì)于VH)中存在的氨基酸，和甚至更優(yōu)選總共存在最多13個(gè)轉(zhuǎn)變。最優(yōu)選，所述抗體或抗體衍生物包含序列SEQIDNO:1的VL域和/或序列SEQIDNO:2的VH域或衍生自該序列SEQIDNO:2的VH域，或序列SEQIDNO:11的VL域和序列SEQIDNO:4的VH域。如果本發(fā)明抗體的VH域包含SEQIDN0:1的VL域，在優(yōu)選實(shí)施方案中，VH序列衍生自SEQIDNO:2使得在68位苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼帷⒘涟彼?、異亮氨酸或纈氨酸。VH內(nèi)外加的改變是任選的。這個(gè)類型的scFv抗體在SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36和SEQIDNO:37中給出。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體或抗體衍生物衍生自具有VL序列SEQIDNO:1和VH序列SEQIDNO:2的抗體，并且包含至少一個(gè)在至少一個(gè)CDRs中轉(zhuǎn)變?yōu)閂L序列SEQIDNO:5和/或VH序列SBQIDNO:6或SEQIDNO:25的相應(yīng)CDR中存在的殘基的氨基酸殘基。在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述抗體或抗體衍生物中，VLCDR2、VLCDR3、VHCDR2或VHCDR3中至少一個(gè)CDR轉(zhuǎn)變?yōu)閂L序列SEQIDNO:5和/或VH序列SEQIDNo:25或SEQIDNO:6的相應(yīng)CDR。最優(yōu)選，所述抗體或抗體衍生物包含下列VL/VH序列組合VLSEQIDNO:7/VHSEQIDNO:2、VLSEQIDNO:8/VHSEQIDNO:2、VLSEQIDNO:1/VHSEQIDNO:9、VLSEQIDNO:1/VHSEQIDNO:25、VLSEQIDNO:1/VHSEQIDNO:28、VLSEQIDNO:1/VHSEQIDNO:29、VLSEQIDNO:26/VHSEQIDNO:30、VLSEQIDNO:27/VHSEQIDNO:30。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體衍生物對(duì)人TNFa具有特異性。優(yōu)選，抗原結(jié)合的特征是Kd為"100nM或更低。更優(yōu)選，抗體的Ka為10nM或更低，最優(yōu)選lnM或更低。根據(jù)本發(fā)明的抗體衍生物是例如Fc融合體、毒素融合體、與酶活性的融合體、不同形式如微抗體(minibodies)、雙功能抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體片段，特別是scFv和Fab片段。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目的是scFv抗體，其VL和VH域通過接頭連接，優(yōu)選以VL-接頭-VH序列方式排列。更優(yōu)選所述接頭具有序列SEQIDNO:10。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目的是衍生自SEQIDNO:40(TB-A)的scFv抗體。這種抗體可以通過誘變獲得，和在構(gòu)架區(qū)、CDR和/或接頭序列中包含三個(gè)或更少突變。優(yōu)選，scFv抗體具有序列SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:38.本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目的是Fab片段，其包含與人IgK鏈恒定區(qū)融合的VL域，和與人IgG的CHI域融合的VH域，兩個(gè)融合多肽通過鏈間二硫鍵連接。在又一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體或抗體衍生物，例如抗體片段被標(biāo)記或化學(xué)l務(wù)飾。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明任何抗體或抗體衍生物的DM序列，以及含所述DMA序列的克隆或表達(dá)載體。此外，提供了用所述DNA序列轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，優(yōu)選是大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，提供了生產(chǎn)本發(fā)明抗體或抗體衍生物的方法，包括在允許物的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從所述培養(yǎng)物中回收所述分子。優(yōu)選，所述方法提供了從大腸桿菌純化的scFv抗體或Fab片段。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明提供的抗體或抗體衍生物作為體外診斷的診斷工具和/或作為藥物的用途。特別優(yōu)選這個(gè)用途是在本文任何與TNFot相關(guān)的狀況中。本發(fā)明還包括一種組合物，其包含本發(fā)明抗體或抗體衍生物與藥物可接受栽體、稀釋劑或賦形劑組合，所述組合物待用作治療與TNFa相關(guān)的疾病的藥物。在本發(fā)明的更多方面提供了組合制劑，其包含本發(fā)明的抗體或抗體衍生物，優(yōu)選與不是對(duì)TNFa特異性的抗體或抗體衍生物的第二個(gè)化合物組合。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，包含編碼本發(fā)明scFv抗體的DNA序列的載體用于基因治療。與TNFoc相關(guān)的疾病的治療通過由于TNFoc與抗體或抗體衍生物之間的強(qiáng)烈相互作用導(dǎo)致阻斷TNFot來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選，考慮自身免疫、急性或慢性炎癥狀況、癌癥相關(guān)疾病、疼痛、神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)變性紊亂、傳染病和心血管疾病的治療。附圖簡述當(dāng)考慮了下列詳細(xì)說明后，將更好地理解本發(fā)明并且除上面列出的目的之外的目的將變得很顯然。這種說明參考附圖，其中圖l顯示了具有TB-A和TB-B序列的scFv抗體的方案，劃定了最頻繁變異的范圍。星號(hào)指示本發(fā)明抗體構(gòu)架區(qū)中這一位置容許氨基酸改變。CDRs(灰色背景強(qiáng)調(diào)CDRs)下面指出的氨基酸可以用在各自的CDRs中。圖2顯示了Fab片段表達(dá)的示例性方案。圖3顯示了當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)scFvs的產(chǎn)量。A.表達(dá)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。B.TB-A和TB-wt的分析型凝膠過濾，顯示了TB-A優(yōu)異的可溶性。圖4顯示了ELISA測(cè)定的不同scFv抗體對(duì)TNFoc親和力的比較。圖5顯示了在小鼠L929成纖維細(xì)胞中，人TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制。A.TB-A與TB-wt和英夫利昔單抗(infliximab)相比的濃度依賴性抑制，顯示了ICs。值。B.TB-A衍生物阻斷TNFoc誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的比較。C.TB-A的scFv和Fab形式的比較。圖6顯示了抗體治療對(duì)人TNFoc誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)腫脹的作用(實(shí)驗(yàn)5.3.、實(shí)驗(yàn)l)。圖7顯示了組織病理炎癥得分的評(píng)分方案。圖8顯示了抗體治療對(duì)人TNFa誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用(實(shí)驗(yàn)5.3.、實(shí)驗(yàn)l)。圖9顯示了抗體治療對(duì)人TNFoc誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)腫脹的作用(實(shí)驗(yàn)5.3.、實(shí)驗(yàn)2)。圖10顯示了抗體治療對(duì)人TNFct誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用(實(shí)驗(yàn)5.3.、實(shí)驗(yàn)2)。圖ll顯示了TB-A在不同體液中的穩(wěn)定性。本發(fā)明的實(shí)施方式已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含所謂的"質(zhì)量控制(qualitycontrol)"篩選(W00148017)中鑒定的構(gòu)架區(qū)的抗體或抗體衍生物的特征是普遍高穩(wěn)定性和/或可溶性，并因此在細(xì)胞外應(yīng)用范圍如中和TNFot中可能也有用。本發(fā)明提供了以穩(wěn)定性和可溶性增加為特征的、特異性識(shí)別和結(jié)合TNFa并由此適于體內(nèi)阻斷TNFoc功能的抗體或抗體衍生物。所述抗體或抗體衍生物的特征為EP1479694中公開的由針對(duì)具有不依賴于其抗原結(jié)合部位的特別穩(wěn)定和可溶構(gòu)架區(qū)的抗體進(jìn)行篩選的"質(zhì)量控制"篩選得到的特殊構(gòu)架區(qū)。如果篩選中使用的構(gòu)架區(qū)是人抗體構(gòu)架區(qū)，它們可以被認(rèn)為是應(yīng)用于人的非免疫原性構(gòu)架區(qū)。本發(fā)明抗體的CDRs與以高親和力(Kd-0.4nM)特異性結(jié)合人TNFoc并可以阻斷TNFa與它的受體結(jié)合的鼠單克隆抗體Di62的CDRs(D6ring等，1994)相同或衍生自它們。此外，在小鼠L929細(xì)胞中，Di62抑制人TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。將來自該小鼠抗體的CDRs移植到顯然最合適的、抗原結(jié)合性能不明確的人受體構(gòu)架區(qū)(其中所述構(gòu)架區(qū)具有VL序列SEQIDNO:5和VH序列SEQIDNO:6，所迷序列通過(GGGGS)4接頭(SEQIDNO:10)連接)上的顯然步驟產(chǎn)生了下述序列的scFv抗體DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKRL工YSAFNRYTG.'VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTHYGMNWVROAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:3+SEQIDNO-10+SEQIDNO:4)所述scFv抗體被成作TB-B。TB-B在蛋白表達(dá)中得到好的產(chǎn)量(圖3a)，但是不能特異性結(jié)合TNFoc(圖4a)。因此，為獲得下述特性的抗體或抗體衍生物(i)對(duì)結(jié)合TNFcx具有足夠的特異性，(ii)是足夠可溶的，以允許有效生產(chǎn)和純化并體內(nèi)阻斷TNFoc，(iii)足夠穩(wěn)定以致可有效作為藥物，不會(huì)經(jīng)受快速降解和(iv)足夠的非免疫原性，通過改變構(gòu)架區(qū)和CDRs尋求最好的可溶性和最好的抗原結(jié)合特性之間的折衷。本發(fā)明提供了為標(biāo)準(zhǔn)(i-iv)的組合而優(yōu)化的VL和VH的序列。包含通過(GGGGS)4接頭與所述VH(SEQIDNO:2)連接所述VL(SEQIDNO:1)的scFv抗體被稱為TB-A。SEQIDNO:40給出了TB-A的序列。這個(gè)抗體仍然相當(dāng)穩(wěn)定和可溶以致當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)和純化時(shí)獲得滿意的產(chǎn)量(圖3A)，并且它不聚集(圖3B)。它對(duì)TNFoc的結(jié)合特性是優(yōu)異的，具有0.8riM的Kd。本發(fā)明還公開了以多種方式衍生自TB-A中存在的序列的VL和VH序列。首先，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在VL構(gòu)架區(qū)的不超過五個(gè)位置和/或在VH構(gòu)架區(qū)的不超過九個(gè)位置的點(diǎn)突變是可接受的，尤其是致使構(gòu)架區(qū)更像TB-B的點(diǎn)突變，即對(duì)于VL更像SEQIDN0:3或?qū)τ赩H更像SEQIDNO:4。包含通過(GGGGS)4接頭連接的序列SEQIDNO:11的VL域和序列SEQIDN0:4的VH域的scFv抗體被稱為TB-BR46L,因?yàn)樗cTB-B僅在VL第46位不同。與TB-B相比，這個(gè)抗體仍然對(duì)TNFot具有好的結(jié)合性能(Kd"100nM)。這提示TB-BR46L相對(duì)于TB-A改變的數(shù)量代表了可變域構(gòu)架區(qū)改變的近似上限。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，僅單個(gè)或兩個(gè)點(diǎn)突變引入TB-A的VL和/或VH構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選的突變的構(gòu)架區(qū)殘基對(duì)于VL是在第4、46、65、67、70和83位，和對(duì)于VH是在第ll、16、28、43、48、68、70、71、72、73、76、77、79、93和112位。所述位置根據(jù)序列表中的編號(hào)來編號(hào)。氨基酸置換優(yōu)選"保守的"，或使得替換的氨基酸與TB-B序列中存在的相應(yīng)氨基酸更相似或優(yōu)選甚至與其相同。例如，TB-A中VH的A76可以轉(zhuǎn)變?yōu)?76，如同TB-B中存在的那樣，但是它也可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨频募捶菢O性側(cè)鏈的另一個(gè)氨基酸，如V或L。這是"保守性"氨基酸置換的一個(gè)實(shí)例?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)定義了適于本文使用的"保守性"置換的具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(K、R、H)、酸性側(cè)鏈(D、E)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(Q、N、S、T、Y、C)、非極性側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P、F、M、W)、P分支側(cè)鏈(T、V、I)和芳香側(cè)鏈(Y,F、W、H)。一個(gè)優(yōu)選保守性改變是VL在83位的改變，因?yàn)閂轉(zhuǎn)變?yōu)镕(SEQIDNO:26)或A(SEQIDNO:27)。然而，在SBQIDNO:32中，VL中的非保守性改變是V8犯，其與CDR1的改變即N31D組合，和在VH具有V79A改變。另一個(gè)特別的TB-A變體是SEQIDNO:33，它在VH中具有保守性F68L交換，其與VL通過接頭連接，接頭第2位攜帶R，替換了G。非常優(yōu)選的單個(gè)氨基酸交換是VL中RMS或YWS,和VH中KWQ或F68交換為V、L或A。非常優(yōu)選的雙交換是VH中F70L/L"R或A76I/S77G。包含具有所述改變的TB-A序列的ScFv抗體顯示抑制LM9的細(xì)胞毒性。它們中的一些結(jié)果在圖5B中顯示它們的序列如下SEQIDNO:18=TB-AH一K43Q(TB-AH43)SEQIDNO:19=TB-AH—F68V(TB-AH68)SEQIDNO:20=TB-AH—F70L/L72R(TB-AH70/72)SEQIDNO:21=TB-AH_A76I/S77G(TB-AH76/77)jSEQIDNO:22=TB-AI>—!L46R(TB-A!L46)SEQIDNO:23=TB-AL一R65S《TB-AL65)SEQIDNO:24=TB-AL_Y67S.(TB—AL67)在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述任何VH域可以與上述任何VL域組合。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TB-A和TB-B的VL和VH域被改組，使得TB-A的VL域(SEQIDNO:1)與TB-B的VH域(SEQIDNO:4)組合，或TB-B的VL域(SEQIDNO:4)與TB-A的VH域(SEQIDNO:2)組合。在很優(yōu)選的實(shí)施方案中，scFv中獲得的該改組形式與序列SEQIDNO:10的(GGGGS)4接頭連接，分別產(chǎn)生scFv抗體TB-AB(SEQIDNO:12)或TB-BA(SEQIDNO:13)。所述(GGGGS)4接頭可以具有甘氨酸變?yōu)楦H水的，即具有極性或甚至帶電荷氨基酸的氨基酸交換，這可使得該抗體更可溶。這些變異當(dāng)中，優(yōu)選具有序列GRGGS-(GGGGS)3(SEQIDNO:39)的那個(gè)。TB-B樣序列的VL或VH域與TB-A樣序列的VH或VL域組合也在本發(fā)明范圍內(nèi)，這里TB-B/TB-A樣序列是指該序列與這個(gè)相比與另一個(gè)更接近。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TB-AVL和/或VH序列的CDR區(qū)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被改變?yōu)榕c所選SEQIDN0:5的VL序列和/或SEQIDNO:6或SEQIDNO:25的VH中存在的相應(yīng)氨基酸匹配。很優(yōu)選的是VLCDRs(VLCDR2或VLCDR3)和/或VHCDRs(CDR2或CDR3)之一中的改變，最優(yōu)選的改變分別產(chǎn)生VL序列SEQIDNO:7或SEQIDNO:8和/或VH序列SEQIDNO:25或SEQIDNO:9。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VL序列SEQIDNO:26或SEQIDN0:27與VH序列SEQIDNO:30組合。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VL序列SEQIDNO:1與VH序列SEQIDNO:28或SEQIDNO:29組合。通常，公開的任何VL序列可以與v^開的任何VH序列組合。本發(fā)明的目的是抗體和抗體片段，尤其是VL或VH多肽、單鏈抗體(scFv)或Fab片段。在scFv抗體的情況下，選擇的VL域可以與選擇的VH域通過柔性接頭以二者之一任何方向連接。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)現(xiàn)狀接頭由重復(fù)的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用序列IDNO:10的(GGGGS)4接頭或其衍生物SEQIDNO:39，但是也可能是l-3個(gè)重復(fù)的變體(Holliger等(1993)，Pro"Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。Alfthan等(1995.)，ProteinEng.8:725-731，Choi等(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等(1996)，CancerRes.56:3055-3061，Klpriyanov等(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等(2001),CancerImmunol.Immunother.50:51-59描述了本發(fā)明可以使用的其他接頭。排列可以是VL-接頭-VH或VH-接頭-VL,前一方向是優(yōu)選的。在Fab片段的情況下，選擇的輕鏈可變域VL與人Igkappa鏈恒定區(qū)融合，而適當(dāng)?shù)闹劓溈勺冇騐H與人IgG的第一個(gè)(N-末端)恒定區(qū)CHI融合。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，人Ct域具有序列SEQIDNO:14和用于構(gòu)建Fab片段的CHI域具有序列SEQIDNO:15。圖2顯示了Fab片段的一個(gè)實(shí)例，其中使用TB-A的VL和VH域，使得VL域直接與人kappa恒定域連接，產(chǎn)生序列WSRFSGRGYGTDFTLTISSIiQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEIKRTVAAPS.VFIFPPSDEQLKSGTASWCLL卵FYPREAKVQ訴VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSIiSSTI/TiLSKADYEKHKVYACEVTHQGiLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO'-l+SEQIDNO:14)而VH域與第一個(gè)恒定域(CH1)融合，產(chǎn)生序列qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgytfthygmnwvrqapgkglewmgwintytgeptyadkfkdrftfsletsastvymeltsltsddtavyycarergdamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfsepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssg:lys:lsswtvpsss:lgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscts(seqidno:2+seqidno:15).在C末端，兩個(gè)恒定域之間形成鏈間二硫鍵。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物能夠具有對(duì)人TNFot的親和力，解離常數(shù)Kd范圍是0.8-10，000nM。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，Kd<10nM。抗體對(duì)抗原的親和力可以4吏用合適的方法(Berzofsky等"Antibody—AntigenInteractions",inFundamentalImmunology,Paul,W.E.，Ed，RavenPress:NewYork,NY(1992);Kuby，J.Immunology,W.H.FreemanandCompany:NewYork,NY)和其中描述的方法用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗體或抗體衍生物，特別是scFv或Fab片段是標(biāo)記的。TNFoc特異性抗體或抗體衍生物的可檢測(cè)標(biāo)記可以通過將它與酶免疫測(cè)定(EIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中使用的酶連接來完成，這些測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如CurrentProtocolsProtocolsinImmunology,Coliganetal等Eds,JohnWiley&Sons,2005)。通過放射性標(biāo)記TNFct特異性抗體或抗體衍生物，有可能通過使用放射免疫測(cè)定(RIA)檢測(cè)TNF-ot(參見例如Work等，LaboratoryTechniquesandBiochemistryinMolecularBiology,NorthHollandPublishingCompany,N.Y.(1978)。放射性同位素可以通過使用Y粒子計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影術(shù)來檢測(cè)。特別有效的同位素是311、131I、35S、14C，和優(yōu)選1251。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物還可以用熒光標(biāo)記化合物來標(biāo)記，如熒光素、異硫氰酸鹽、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺，或用化學(xué)發(fā)光化合物如魯米諾、異魯米諾、theromaticacridiniumester、imidazolacridinium鹽和草酸酉旨。標(biāo)記和檢測(cè)方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，它們可以從UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.I(Harlow,E.andLane，D.，1998)獲得。標(biāo)記的本發(fā)明的抗體或抗體衍生物在診斷目的中有用，尤其是檢測(cè)從患者取出的生物樣品中的TNFot?？梢允褂煤蠺NFoc的任何樣品，例如生物流體像血液、血清、淋巴、尿、炎癥滲出液、腦脊液、羊水、組織提取液或勻漿等等，或用于原位檢測(cè)的組織學(xué)樣品。藥物制劑定義術(shù)語"藥物制劑，，是指處于允許抗體或抗體衍生物的生物活性明確有效的形式，并且不含對(duì)將給予該制劑的受試者有毒的另外組分的制劑。"藥物可接受"賦形劑(栽體、添加劑)是可以合理給予受試哺乳動(dòng)物以提供有效劑量的所采用活性成分。"穩(wěn)定的"制劑是在貯藏時(shí)，其中的抗體或抗體衍生物保持它的物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的制劑。測(cè)定蛋白穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得的，并且在例如PeptideandProteinDrugDelivery,247-301，VincentLeeEd.，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y,，Pubs.(1991)和Jones,A,Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中綜述。穩(wěn)定性可以在選定溫度選定時(shí)間段進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選，該制劑在室溫(約30C)或40匸至少1個(gè)月是穩(wěn)定的和/或在2-8匸至少1年或至少2年是穩(wěn)定的。此外，優(yōu)選該制劑在制劑的水凍(至例如-70X:)和融解后是穩(wěn)定的。如果顏色和/或透明度的肉眼檢查，或通過紫外線燈散射或大小排阻層折測(cè)定，它沒有聚集、沉淀和/或變性的跡象，則抗體或抗體衍生物在藥物制劑中"保持它的物理穩(wěn)定性，，。如果給定時(shí)間內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性使蛋白被認(rèn)為仍然保持它的如下限定的生物活性，則抗體或或抗體衍生物在藥物制劑中"保持它的化學(xué)穩(wěn)定性，，?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可以通過檢測(cè)和定量化學(xué)上改變的蛋白形式來估計(jì)?；瘜W(xué)改變可以包括大小修飾(例如修剪)，其可以使用例如大小排阻層析、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助的激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)語(MALDI/T0PMSMS)來估計(jì)。其他類型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如作為脫酰胺結(jié)果而發(fā)生)，這可以通過例如離子交換層析估計(jì)。如果用例如抗原結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定，在給定時(shí)間內(nèi)抗體的生物活性是在藥物制劑制備時(shí)顯示的生物活性的約10%內(nèi)(在試驗(yàn)誤差之內(nèi))，則抗體或抗體衍生物在藥物制劑中"保持它的生物活性"。其他的抗體"生物活性"試驗(yàn)在此下面詳述。"等滲的"意思是感興趣制劑具有基本上與人血液相同的滲透壓。等滲制劑通常具有約250至350mOsm的滲透壓。等滲性可以使用例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓力計(jì)來測(cè)定。"多元醇"是具有多個(gè)羥基的物質(zhì)，包括糖(還原和和非還原糖)、糖醇和糖酸。本文優(yōu)選的多元醇具有小于約600kD的分子量(例如在約120至約400kD的范圍內(nèi))。"還原糖"是含有可以還原金屬離子或與蛋白中的賴氨酸及其他氨基共價(jià)反應(yīng)的半縮醛基的糖，和"非還原糖"是不具備還原糖這些性能的糖，還原糖的實(shí)例是果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非還原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、蘇糖醇、山梨醇和甘油是糖醇的實(shí)例。至于糖酸，這些包括L-葡糖酸和它的金屬鹽。在期望制劑是凍融穩(wěn)定的制劑的情況下，優(yōu)選多元醇是不在水凍溫度(例如-2ox:)時(shí)結(jié)晶致使制劑中抗體不穩(wěn)定的多元醇。非還原糖如蔗糖和海藻糖是本文優(yōu)選的的多元醇，海藻糖比蔗糖優(yōu)選，因?yàn)楹Ｔ逄莾?yōu)異的溶液穩(wěn)定性。在此使用的"緩沖液"是指通過其共軛酸堿組分的作用來抵抗pH改變的緩沖溶液。本發(fā)明的緩沖液具有約4.5至約6.0范圍的pH;優(yōu)選約4.8到約5.5;和最優(yōu)選具有約5.0的pH。控制pH在這個(gè)范圍之內(nèi)的緩沖液實(shí)例包括醋酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(如琥銷酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽及其他有機(jī)酸緩沖液。在期望凍融穩(wěn)定的制劑的情況下，緩沖液優(yōu)選不是磷酸鹽。在本發(fā)明上下文中，在藥理學(xué)意義上，抗體或抗體衍生物的"治療有效量"是指有效預(yù)防或治療抗體或抗體衍生物有效治療的紊亂的量。"疾病/紊亂"是將受益于用該抗體或抗體衍生物治療的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括易于使該哺乳動(dòng)物引起所述紊亂的那些病理狀況。"防腐劑"是可以包括在制劑中以實(shí)質(zhì)性地降低其中的細(xì)菌作用，由此例如利于生產(chǎn)多用途制劑的化合物，有潛力的防腐劑實(shí)例包括氯化十八烷基二甲基千銨、氯化二甲雙銨、苯扎氯銨(氯化烷基千基二甲基銨的混合物，其中烷基是長鏈化合物)和千索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳醇類如苯酚、丁基和苯甲基醇、對(duì)羥苯甲酸烷基酯如對(duì)羥苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間曱酚。本文最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇。本發(fā)明還提供了包含一種或多種抗體或抗體衍生物化合物，和至少一種生理學(xué)可接受的栽體或賦形劑的藥物組合物。藥物組合物可以包含例如一種或多種下述物質(zhì)水、緩沖液(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、乙醇、礦物油、植物油、二甲亞砜、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白、助劑、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽和/或防腐劑。如上所述，其他活性成分可以(但不必須)包括在本文提供的藥物組合物中。載體是可以在給予患者前與抗體或抗體衍生物結(jié)合的物質(zhì)，常常為了控制該化合物的穩(wěn)定性或生物利用率。在這種制劑內(nèi)使用的栽體通常是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。栽體包括例如單價(jià)或多價(jià)分子如血清白蛋白(例如人或牛的)，卵白蛋白、肽、聚賴氨酸和多糖如氨基葡聚糖和polyamidoamines。載體還包括固相支持材料如珠子和微粒，包含例如聚乳酸、聚羥乙酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、膠乳、淀粉、纖維素或葡聚糖。載體可以以各種方式承載化合物，包括共價(jià)鍵合(直接或通過接頭基團(tuán))、非共價(jià)作用或混合。藥物組合物可以配制成用于任何適合的給藥方式，包括例如局部、口服、鼻內(nèi)、直腸或腸胃外給藥。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選以適于口服使用的形式的組合物。這種包括例如丸劑、片劑、錠劑、糖錠、水或油懸浮劑、可分散性粉劑或粒劑、乳劑、硬或軟膠嚢或糖漿或酏劑。又在其它實(shí)施方案中，本文提供的組合物可以凍干物配制。本文使用的術(shù)語胃腸外包括皮下、皮內(nèi)、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌內(nèi)、脊柱、顱內(nèi)、鞘內(nèi)和腹膜內(nèi)注射，以及任何相似的注射或輸注技術(shù)。為用于口服使用的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的制備藥物組合物的任何方法來制備，和為了提供吸引人和可口的制劑，可以含有一種或多種試劑，如甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。片劑含有與適于制備片劑的生理學(xué)可接受賦形劑混合的活性成分。這種賦形劑包括例如惰性稀釋劑(例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉)、成粒劑和崩解劑(例如玉米淀粉或藻酸)、粘合劑(例如淀粉、明膠或阿拉伯膠)和潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉)。該片劑可以是無包衣的或它們可以通過已知技術(shù)被包衣，以延遲崩解和在胃腸道吸收，由此提供較長時(shí)間的持續(xù)作用。例如，可以使用時(shí)間延遲材料如單硬脂酸甘油脂或二硬脂酸甘油脂?？诜褂玫闹苿┮部梢砸杂裁髂z膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如碳酸釣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或以軟明膠膠嚢存在，其中活性成分與水或油性介質(zhì)(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。水懸劑含有抗體或抗體衍生物，與適于制備水懸劑的賦形劑混合。這種這種賦形劑包括懸浮劑(例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠)；和分散或濕潤劑(例如天然存在的磷脂如卵磷脂，亞烷基氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚氧化乙烯硬脂酸，乙烯氧化物與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，如heptadecaethyleneoxycetanol,環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物如聚氧化乙烯山梨醇一油酸酯，或環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物如聚乙烯失水山梨醇一油酸酯)。水懸劑也可以包含一種或多種防腐劑，例如間羥基苯酸乙基或正丙基酯，一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑和和一種或多種甜味劑如蔗糖或糖精。糖漿和酏劑可以與甜味劑一起配制，如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。這種制劑也可以包含一種或多種緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑和/或著色劑。油懸劑可以通過將活性成分懸浮于植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油如液體石蠟中來配制。油懸劑可以含有增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢蕴砑犹鹞秳┤缟狭谐龅哪切?，和/或調(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這種懸劑可以通過添加抗氧化劑如抗壞血酸來保存。適于添加水制備水懸劑的可分散性粉劑和粒劑提供了與分散或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。合適的分散或濕潤劑和懸浮劑由上面已經(jīng)提及的來舉例。也可以存在另外的賦形劑例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。藥物組合物也可以是水包油乳劑。該油相可以是植物油(例如橄欖油和花生油)、礦物油(例如液體石蠟)或它們的混合物。合適的乳化劑包括天然存在的樹膠(例如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂和來源于脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯)、酐(例如失水山梨糖一油酸酯)和來源于脂肪酸和己糖醇的偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物(例如聚氧化乙烯失水山梨糖一油酸酯)。乳劑也可以包含一種或多種甜味劑和/或調(diào)味劑，藥物組合物可以制備成無菌注射水懸劑或油懸劑，根據(jù)使用的栽體和濃度，其中的調(diào)節(jié)劑懸浮或溶于該栽體?？梢愿鶕?jù)已知技術(shù)，使用合適的分散、濕潤劑和/或懸浮劑如上述的那些，配制這種組合物?？梢允褂玫目山邮茌d體和溶劑是水、1，3-丁二醇、Ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，可以使用無菌固定油類作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，可以使用任何溫和固定油類，包括合成的甘油單或二酯。此外，可注射組合物的制備中可以使用脂肪酸如油酸，且助劑如局部麻醉劑、防腐劑和/或緩沖劑可以溶于該栽體。藥物組合物可以配制成持續(xù)釋放制劑(即制劑如膠嚢，給藥后引起調(diào)節(jié)劑緩慢釋放)。這種制劑制劑通?？梢允褂檬熘夹g(shù)來制備，和通過例如口服、直腸、皮下植入，或通過植入期望乾部位來給予。這種制劑中使用的載體是生物相容的，和也可以是生物可降解的；優(yōu)選該制劑提供相對(duì)恒定水平的調(diào)節(jié)劑釋放。持續(xù)釋放制劑中含有的抗體或抗體衍生物的量取決于例如植入部位、釋放速度和預(yù)期持續(xù)時(shí)間和待治療或預(yù)防的疾病/紊亂的性質(zhì)。本文提供的抗體或抗體衍生物通常以在體液(例如血液、血漿、血清、CSF、滑膜液、淋巴、細(xì)胞間液、淚液或尿液)中達(dá)到足以可檢測(cè)地結(jié)合TNFot和預(yù)防或抑制與TNFa相關(guān)的疾病/紊亂的濃度的量給予。如果一種劑量產(chǎn)生如本文描述的可辨別的患者益處，則該劑量被認(rèn)為是有效的。優(yōu)選的全身劑量范圍從每天每公斤體重約0.1mg至約140mg(每天每一患者約0.5mg至約7g)，口服劑量通常比靜脈內(nèi)劑量高大約5-20倍?？赡芘c載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單一劑型的抗體或抗體衍生物的量將根據(jù)治療的宿主和特定給藥方式而變化。劑量單位形式通常將含有從約1邁g至約500mg之間的活性成分。藥物組合物可以為治療對(duì)針對(duì)TNF-cx的抗體或抗體衍生物反應(yīng)的狀況而進(jìn)行包裝。包裝的藥物組合物可以包括容納有效量的至少一種本文描述的抗體或抗體衍生物和說明書(例如標(biāo)簽)的容器，所述說明書標(biāo)明含有的組合物將用于治療給予患者后對(duì)一種抗體或抗體衍生物反應(yīng)的疾病/紊亂。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物還可以被化學(xué)修飾。優(yōu)選的修飾基團(tuán)是聚合物，例如任選取代的直或支鏈聚烯烴、polyalkenylene或聚氧化亞烷基聚合物或分支或不分支多糖。這種效應(yīng)基團(tuán)可以增加抗體在體內(nèi)的半衰期。合成聚合物的具體實(shí)例包括任選取代的直或支鏈聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或它們的衍生物。具體天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或它們的衍生物。聚合物的大小可以根據(jù)需要變化，但是通常是范圍從500Da至50000Da的平均分子量。對(duì)于設(shè)計(jì)抗體穿透組織的局部應(yīng)用，優(yōu)選的聚合物分子量是大約5000Da。聚合物分子可以與抗體連接，尤其是通過共價(jià)連接的鉸鏈肽與Fab片段重鏈C末端連接，如WO0194585所述。對(duì)于PEG部分的連接，參考Poly(ethyleneglycol)Chemistry,BiotechnologicalandBiomedicalApplications",1992，J.MiltonHarris(編),PlenumPress,NewYork和"BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedicalSciences",1998，M.Aslam和A.Dent,GrovePublishers,NewYork。制劑的制備制備了如上所述的感興趣抗體或抗體衍生物后，制備含有它的藥物制劑。待配制的抗體沒有經(jīng)受在先的凍干，在此的感興趣制劑是含水制劑。優(yōu)選制劑中的抗體或抗體衍生物是抗體片段，如scFv。制劑中存在的抗體的治療有效量通過考慮例如期望的劑量體積和給藥方式來確定。從約0.1mg/ml至約50mg/ml,優(yōu)選約0.5mg/ml至約25mg/ml和最優(yōu)選約2mg/ml至約10mg/ml是制劑中示例的抗體濃度。在pH緩沖溶液中制備包含抗體或抗體衍生物的含水制劑。本發(fā)明的緩沖液具有約4.5至約6.0范圍的pH，優(yōu)選約4.8到約5.5，和最優(yōu)選具有約5.0的pH?？刂苝H在這個(gè)范圍之內(nèi)的緩沖液實(shí)例包括醋酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽及其他有機(jī)酸緩沖液。緩沖液濃度可以從約1mM至約50mM，優(yōu)選從約5mM至約30mM，根據(jù)例如緩沖液和期望的制劑等滲性而定。優(yōu)選緩沖液是乙酸鈉(約10mM))，pH5.0。發(fā)揮促進(jìn)張力(tonicifier)作用并可以穩(wěn)定抗體的多元醇包括在制劑中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，制劑不含促進(jìn)張力(tonicifying)量的鹽，如氯化鈉，因?yàn)檫@可能引起抗體或抗體衍生物沉淀和/或可以導(dǎo)致低pH下氧化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多元醇是非還原糖，如蔗糖或海藻糖。多元醇以可以相對(duì)于期望的制劑等滲性而變化的量添加至制劑。優(yōu)選含水制劑是等滲的，在這種情況下制劑中多元醇的合適濃度是例如約1%至約Hw/v，優(yōu)選約2%至約10%w/v。然而，高滲或低滲制劑也可能是合適的。添加的多元醇的量也可以相對(duì)于多元醇分子量而改變。例如，可以添加與二糖(如海藻糖)相比量降低的單糖(例如甘露糖醇)。表面活性劑也添加至抗體或抗體衍生物制劑中。示例的表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚山梨酯(polysorbates)(例如聚山梨酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的表面活性劑的粒的形成和/或降低吸附。例如，表面活性劑可以在制劑中以從約0.001%至約0.5%，優(yōu)選約0.005%至約0.2%和最優(yōu)選約0.01%至約0.1%的量存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑含有上述說明的試劑(即抗體或抗體衍生物、緩沖液、多元醇和表面活性劑)和基本上無一種或多種防腐劑，如苯甲醇、苯酚、間曱苯酚、氯丁醇和節(jié)索氯銨。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑中可以包括防腐劑，尤其是制劑是多劑量制劑時(shí)。防腐劑濃度可以從約0.1%至約2%，最優(yōu)選約0.5%至約1%。一種或多種其他藥物可接受栽體、賦形劑或穩(wěn)定劑如Remington'sPharmaceuticalSciences21stedition,Osol，A.Ed.(2006)中描述的那些可以包括在制劑中，只要它們不會(huì)不利地影響制劑的期望特性。可接受的栽體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在使用的劑量和濃度下對(duì)受體無毒的，和包括另外的緩沖劑；助溶劑；抗氧化劑包括抗壞血酸和曱硫氨酸；螯合劑如EDTA;金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白復(fù)合物)；可生物降解的聚合物如聚酯；和/或成鹽平衡離子如鈉。用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這通過在制劑制備前或后通過無菌過濾膜過濾而容易地實(shí)現(xiàn)。制劑的給藥該制劑根據(jù)已知方法給予需要用該抗體治療的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，如靜脈內(nèi)給藥，一次大劑量或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)、腦脊髄內(nèi)(intracerobrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該制劑通過靜脈內(nèi)給藥給予哺乳動(dòng)物。為了這種目的，可以例如使用注射器或通過IV途徑注射該制劑。合適的劑量("治療有效量")的抗體將依賴于例如待治療的狀況、狀況的嚴(yán)重性和過程、為預(yù)防還是為治療目的給予抗體、先前的治療、患者臨床病史和對(duì)抗體的反應(yīng)、使用的抗體類型和主治醫(yī)師的辨別力。抗體或抗體衍生物一次或經(jīng)一系列治療合適地給予患者，和可以在從診斷起任何時(shí)間給予患者?？贵w或抗體衍生物可以作為唯一的治療給予或與對(duì)所討論的狀況有用的其它藥物或療法一起給予。作為一般的建議，給予的抗體或抗體衍生物的治療有效量在每7>斤患者體重約0.1至約50mg/kg的范圍內(nèi)，無論是一次還是多次給藥，使用抗體的典型范圍是例如每天給予約0.3至約20mg/kg，更優(yōu)選約0.3至約15mg/kg。然而，其他劑量方案可能有效。這種治療的進(jìn)展通過傳統(tǒng)方法可容易地監(jiān)測(cè)。制備的產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備的產(chǎn)品，包含容納本發(fā)明的含水藥物制劑的容器和任選提供它的使用說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶和注射器。容器可以用各種材料制成，如玻璃或塑料。示例容器是3-20cc—次性使用的玻璃小瓶?？晒┻x擇地，對(duì)于多劑量制劑，容器可以是3-100cc玻璃小瓶。容器容納制劑而容器上或與容器結(jié)合的標(biāo)簽可以標(biāo)明使用指示。制備的產(chǎn)品可以進(jìn)一步包括從商品化和用戶立場(chǎng)期望的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和帶使用說明書的包裝插入物。本發(fā)明的抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。已知多肽的序列，可以通過基因合成產(chǎn)生編碼它們的cDNAs(www.genscript.com)。這些cDNAs可以克隆入合適的載體質(zhì)粒。一旦獲得了編碼VL和/或VH域的DNA，可以進(jìn)行定向誘變獲得各種衍生物，例如通過使用誘變引物的PCR。最好的"開始"序列可以根據(jù)VL和/或VH序列中期望改變的數(shù)量來選擇。優(yōu)選序列是TB-A序列和它的衍生物，例如scFv序列或Fab融合肽序列可以選擇作為PCR驅(qū)動(dòng)誘變和/或克隆的模板。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)克隆和誘變技術(shù)連接接頭、改組結(jié)構(gòu)域或構(gòu)建融合物，用于生產(chǎn)Fab片段。公開本發(fā)明的一般方法的基本方案在MolecularCloning,ALaboratoryManual(Sambrook&Russell,3rded.2001)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，1999)中描述。將承載基因的DNA序列一一該基因編碼scFv多肽，或在Fab片段的情況下，對(duì)于VL-Ck和VH-CH1融合物，編碼兩個(gè)分開的基因或包含兩個(gè)基因的雙順反子操縱子(圖2)——克隆在合適的表達(dá)載體中，優(yōu)選具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)栽體。必須注意每個(gè)基因的前面存在確保翻譯的合適核糖體結(jié)合位點(diǎn)(圖2中的RBS)。應(yīng)理解本發(fā)明的抗體包含公開的序列而不是由它們組成。例如，克隆策略可能要求構(gòu)建體由在N末端存在一個(gè)或幾個(gè)另外殘基的抗體構(gòu)成。具體地說，在沒有被翻譯后切割的情況下，在最終蛋白中可以存在來源于起始密碼子的甲硫氨酸。大部分scFv抗體的構(gòu)建體在N末端產(chǎn)生另外的丙氨酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇在大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)的表達(dá)載體(Krebber，1997)。所述載體在可切割信號(hào)序列前包含啟動(dòng)子。然后抗體肽的編碼序列符合讀框地與可切割信號(hào)序列融合。這允許表達(dá)的多肽把向至細(xì)菌周質(zhì)，在其中信號(hào)序列被切割。然后抗體折疊。在Fab片段的情況下，VL-Ck和VH-CH1融合肽必須與輸出信號(hào)連接。肽到達(dá)周質(zhì)后，在C末端半胱氨酸處形成共價(jià)S-S鍵。如果優(yōu)選抗體在胞質(zhì)表達(dá)，則通?？梢詮陌w獲得高產(chǎn)量所述抗體，包涵體可以容易地與其他細(xì)胞碎片和蛋白分開。在這種情況下，將包涵體溶于變性劑如鹽酸胍(GndHCl)，然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的復(fù)性步驟重折疊。表達(dá)scFv或Fab多肽的質(zhì)粒被引入合適的宿主，優(yōu)選細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選合適的大腸桿菌菌林，對(duì)于周質(zhì)表達(dá)，如JM83，或?qū)τ谝园w表達(dá)，如BL21。可以從周質(zhì)或包涵體收獲多肽并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的離子交換層析、反相層析、親和層析和/或凝膠過濾。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以用產(chǎn)量、溶解度和體外穩(wěn)定性表征。對(duì)TNFoc,優(yōu)選對(duì)人TNFoc的結(jié)合能力可以通過ELISA或表面等離子體共振(BIACore)使用重組人TNFot(如W09729131所述)，進(jìn)行體外檢測(cè)，后一方法也允許測(cè)定k。ff速度常數(shù)，其應(yīng)該優(yōu)選小于1(T3S—\優(yōu)選Kd值《10nM。本發(fā)明抗體或抗體衍生物的體內(nèi)中和活性可以使用L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)估計(jì)。人重組TNFoc以濃度依賴性方式對(duì)培養(yǎng)的小鼠L929成纖維細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。這種TNFct誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性可以通過TNFoc中和抗體抑制(D(jring，1994)。優(yōu)選的相對(duì)于最大抑制濃度一半的iC5。值《ioong邁r。TNFoc在各種人類疾病中具有被證實(shí)的病理生理作用，尤其是炎癥性紊亂、免疫和免疫調(diào)節(jié)的紊亂、引起膿毒性、內(nèi)毒素性和心血管性休克的感染、神經(jīng)變性疾病和惡性病。由于懷疑TNFct在穩(wěn)定增長數(shù)量的另外人類疾病中起著與疾病相關(guān)的作用，因此難以給出也確保TNFa抑制劑未來臨床應(yīng)用范圍的完整說明的指征全面列表。因此，本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以應(yīng)用于治療下列目錄中所列疾病，其不被認(rèn)為是完整或排他的列表。也包括沒有具體提及的直接或間接受TNFcx影響的其他疾病。自身免疫或慢性炎癥一般的炎癥慢性和/或自身免疫狀態(tài)、一般的免疫介導(dǎo)的炎性紊亂、炎性CNS病、影響眼睛、關(guān)節(jié)、皮膚、粘膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般的眼色素層炎狀態(tài)、視網(wǎng)膜炎、HLA-B27+眼色素層炎、Behcet氏病、干眼綜合征、青光眼、干燥綜合征(Sjdgrensyndrome)、糖尿病(包括糖尿病神經(jīng)病變)、胰島素抵抗、一般的關(guān)節(jié)炎狀態(tài)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和瑞特氏綜合征(Reiter'ssyndrome)、少年關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、多發(fā)性硬化、格林-巴利綜合征(Gui1lain-Barresyndrome)、重癥肌無力、肌萎縮性側(cè)索硬化、結(jié)節(jié)病、腎小球性腎炎、慢性腎病、膀胱炎、銀屑病(包括牛皮癬關(guān)節(jié)炎)、化膿性汗腺炎、脂膜炎、壞疽性膿皮病、SAPHO綜合征(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥大和骨炎)、痤瘡、Sweet綜合征、天皰瘡、克羅恩病(包括腸外表現(xiàn))、潰瘍性結(jié)腸炎、支氣管津喘、過敏性肺炎、一般的變態(tài)反應(yīng)、過敏性鼻炎、過敏性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺部纖維化、Wegener肉芽腫病、川崎綜合征、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、Churg-Strauss血管炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、燒傷、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物反應(yīng)、器官或骨髄移植后排斥發(fā)作、一般的全身或局部血管炎狀態(tài)、系統(tǒng)性和盤狀紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子癇、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎。急性炎癥和/或預(yù)防術(shù)后或外傷后炎癥和疼痛預(yù)防一般的術(shù)后炎癥、眼手術(shù)(例如白內(nèi)障(眼晶體置換)或青光眼手術(shù))、關(guān)節(jié)手術(shù)(包括關(guān)節(jié)鏡手術(shù))、關(guān)節(jié)相關(guān)結(jié)構(gòu)(例如韌帶)的手術(shù)、口腔和/或牙科手術(shù)、最低限度的介入心血管程序(例如PTCA、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)(atherectomy)、放置支架)、腹腔鏡和/或內(nèi)窺鏡腹內(nèi)和婦科程序、內(nèi)窺鏡泌尿科程序(例如前列腺手術(shù)、輸尿管鏡檢查、膀胱鏡檢查、間質(zhì)性膀胱炎)、一般的手術(shù)前后炎癥(預(yù)防)。神經(jīng)病和神經(jīng)變性疾病阿爾茨海默病(Alzheimerdisease)、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、貝爾麻痹(Bell'palsy)、克-雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)。癌癥癌癥相關(guān)骨質(zhì)溶解、癌癥相關(guān)炎癥、癌癥相關(guān)疼痛、癌癥相關(guān)惡病質(zhì)、骨轉(zhuǎn)移。疼痛急性和慢性形式的疼痛，無論這些是由TNFot的中樞還是外周作用引起的和無論它們被分為炎性、傷害性還是神經(jīng)性形式的疼痛、坐骨神經(jīng)痛、腰背痛、腕管綜合征、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征(CRPS)、痛風(fēng)、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、纖維肌痛、局部疼痛狀態(tài)、由于轉(zhuǎn)移性腫瘤引起的慢性疼痛綜合征、dismenorrhea。感染細(xì)菌、病毒或真菌性膿毒病、結(jié)核、AIDS。心血管疾病動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈病、高血壓、血脂障礙(dyslipidemia)、心功能不全和慢性心力衰竭。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎或眼色素層炎或炎癥性腸病。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含本發(fā)明的抗體或抗體衍生物分子與藥物可接受賦形劑、稀釋劑或栽體結(jié)合。該藥物組合物優(yōu)選應(yīng)包含治療有效量的本發(fā)明抗體，即治療、改善或預(yù)防與TNFot相關(guān)的疾病或狀況，或顯示可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果所需要的量的所述抗體。治療有效劑量可以以細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)或動(dòng)物模型來估計(jì)，通常以嚙齒類、兔、狗、豬或靈長類動(dòng)物。動(dòng)物模型也可以用于測(cè)定合適的濃度范圍和給藥途徑。觀察本發(fā)明抗體或抗體衍生物作用的合適動(dòng)物模型是大鼠急性單關(guān)節(jié)炎(monoarthritis)模型(Bolon等(2004)，Vet.Pathol.41:235-243。人TNFa通過關(guān)節(jié)內(nèi)注入大鼠膝關(guān)節(jié)，在注射關(guān)節(jié)引起急性、自限性單關(guān)節(jié)炎?？筎NFoc抗體(衍生物)的生物活性可以通過降低TNFot誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)腫脹和或降低炎癥組織學(xué)參數(shù)來定量。由于本發(fā)明的抗體或抗體衍生物是高度可溶的，因此高抗體濃度(60mgm〃或更高)允許應(yīng)用的體積小。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以應(yīng)用在期望降低存在于人或動(dòng)物體中的具有生物活性的TNFa水平的任何治療中。TNFot可以在體內(nèi)循環(huán)或以不期望的高水平局限性存在于體內(nèi)特殊部位。本發(fā)明提供了一般全身以及局部應(yīng)用的方式，它包括但不限于下列那些口服應(yīng)用、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、玻璃體內(nèi)、真皮內(nèi)、或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)注射、氣霧劑吸入、局部應(yīng)用于皮膚、粘膜或眼睛、通過可植入微型泵全身或局部釋放或通過通過允許延遲釋放的可植入制劑/裝置局部釋放、局部應(yīng)用于漿膜表面、鞘內(nèi)或室內(nèi)應(yīng)用、以允許在胃腸道所選部分的控制管腔內(nèi)釋放的制劑口服、從足夠的制劑/裝置(例如支架)局部血管內(nèi)釋放、局部輸送至尿囊腫、局部管腔內(nèi)釋放(例如釋放入膽道、輸尿管)，或通過內(nèi)窺鏡裝置局部輸送，或從隱形眼鏡釋放(接觸)。優(yōu)選的應(yīng)用是局部應(yīng)用，如關(guān)節(jié)內(nèi)注射或局部應(yīng)用，例如應(yīng)用至眼睛中。對(duì)于二種優(yōu)選應(yīng)用，本發(fā)明的抗體需要處于溶液中。本發(fā)明也揭示本發(fā)明抗體或抗體衍生物用于生產(chǎn)治療與TNFot相關(guān)疾病的藥物的用途。在這種情況下，抗體或抗體衍生物包含在治療組合物中。所述組合物用作藥物，最優(yōu)選用于預(yù)防或治療與TNFoc相關(guān)的疾病。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的scFv抗體用于基因治療，尤其是過繼性(adoptive)細(xì)胞基因治療。自身免疫紊亂表示對(duì)準(zhǔn)自身組織的不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。抗原特異性004+T細(xì)胞和抗原呈遞樹突細(xì)胞(DCs)是自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理中重要的介質(zhì)，并因此是過繼性細(xì)胞基因治療、離體治療性基因轉(zhuǎn)移方法的理想候選物。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和螢光素酶生物發(fā)光，Tarner等(2003，Ann.N.Y.Acad.Sci.998:512-519)證明了在多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎和糖尿病動(dòng)物模型中，原代T細(xì)胞、T細(xì)胞雜交瘤和DCs快速和優(yōu)先到達(dá)炎癥部位。用驅(qū)動(dòng)各種"調(diào)節(jié)蛋白"如白介素和抗TNFscFv表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)的這些細(xì)胞將這些免疫調(diào)節(jié)蛋白輸送至發(fā)炎損害部位，對(duì)于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和非肥胖糖尿病小鼠提供治療。本發(fā)明抗體或抗體衍生物的穩(wěn)定和可溶構(gòu)架區(qū)特別適于胞內(nèi)遞送抗原，例時(shí)。過繼性細(xì)胞基因治療引起抗TNFocscFv局部表達(dá)和分泌。Smith等(2003)證明了來源于TNFa中和單克隆抗體的scFvs(i)可以體外中和TNFoc和(ii)改變細(xì)胞因子在罹患膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的小鼠關(guān)節(jié)局部而不是全身的表達(dá)模式?？晒┻x擇地，允許抗TNFocscFv抗體連續(xù)表達(dá)的合適栽體(例如病毒)直接全身或局部注射被認(rèn)為是另一種可能的基因治療方法。本發(fā)明的序列是下列序列SEQIDNO:ltb-a的vlDIVMTQSPSSLSASVGDRVTIjTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKlliysafnrytgvpsrfsgrgygtdftltisslqpedvavyycqqdynsprtfgqgtklevkrseqidho:2tb_a的vhqvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgytfthygmnwvrqapgkglewmgwintytgeptyadkfkdrftfsletsastvyme:lts:ltsddtavyycarergdamdywgqgt遊vss.seqidno:3tb-b的vldivltqspsslsasvgdrvtltctasqsvsndwwyqqrpgkapkrl工ysafnrytgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedvavyycqqdynsprtfgqgtklevkrSEQ工DNO:4TB-B的VHQVQKVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTHYGMIWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTLTRDTSIGTVYMEIjTSiLTSDDTAVyYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:5FW2,3的VLDIVLTQSPSSLSA.SVGDRVTIiTCRASQGIRNEIiAWYQQRPGKAPKKLIYAGSIILQSGVPSRFSGSGSGTE-FTLTISSIjQPEDVAVYYCQQYYSIjPYMFG.QGTKLEVKRSEQ工DNO:6FW2.3的VHQVQLVQSGA^VKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTIYAGKFGDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGty!ldpwdyfdywgggtlvtvssSEQIDNO:7TB—L2的VLDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKIi!L工YAGS加SGVPSliFSGfeGYGTDFTI/TISS!LQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRSEQIDNO:8TB一L3的VLDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLL工YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDETLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKLEVKR.SEQ工DNO:9TB一H2的VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRFTFSIiETSASTVYMEIjTSIiTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTltVTVSSSEQID'NO:10接頭GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDHO:11TB-BR46L的VLDIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLT工SSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRSEQIDNO:12TB-ABDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSJ^NRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTHYGMNWVRQAPGQGIjEWMGW工NTYTGEPTYADKFKDRVT!LTRDTSIGTVYME!LTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSD工VLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKRLIYSAFNRYTG.VPSRF5GSGSGTEFTIiTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQIiVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGM麗VRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASWYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:14Fab的CkTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSIiSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN;SEQ工DNO:15Fab的CHIastkgpsvfplapsskstsggtaa;lgc:lvkdyfsepvtvswnsga.i/tsgvhtfpaviiqssgiiysiisswtvpsssiigtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksCTSSEQID-NO:1-6.TB-wt的VLDIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDWWYQQKPGQSPKMLM.YSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCCK2DYNSPRTFGGGTKLEIKRSEQIDNO:17TB-wt的VHQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGW工NTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSSEQID'UO:18TB-AH—K43Q,也稱TB-AH43DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWyQQRPGKAPKLL.IYSAFNRYTGVPSRFgGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYrcOQDYNSPpTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWRQAP印GLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSI/TSPDTAYYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSgEQIDNO:19TB-AH_F68V,也稱TB-AH68DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTI/riSSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQG.TKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH■^MNWVRQAPGKGliEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTSseqidno:20!tb-a.h一f70l/l72r,也稱tb-ah70/72divmtqspgslsasvgdrvtltctasqsvsndwwyqqrpgkapklliysafnrytgvpsrfsgrcjygtdftltlsslqpedvavyycqqdynsprtreqgtklevkrggggsggggsggggsggggsgvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgytfthygmnwvrqapgkglewmgwintytgeptyadkfkdrftlsretsastvymeltsi/rsddtavyycarergdamdywgqgt:lvtvssseqidn0:21,tb-ah一a76i/s77g,也稱tb-ah76/77divmtqspsslsasvgdrvtltctasqsvsndvvwyqqrpgkapklliysafnrytgvpsrfsgrgygtdfti/tisslqpedvavyycqqdynsprtfgqgtklevkrggggsggggsggggsggggsqvqwqsgaevkkpgasvkvsctasgytfthYGMNWV]RQAPGKG;LEWMG河INTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSIGTVYMEMSIiTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSseqidno:22TB-A'L一L46R,也稱TB-AL46DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKRL工YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSIiQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTETHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADK沐.DRFTFSIiETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSseqidno:23TB-AL一R65S,也稱TB-AL65D工VMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGkGLEWMGWiNTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS.DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTIiVTVSSs邁qid1Sfc:24TB-AL—Y67S,也稱TB-AL67DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGSGTDFTLT工SSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRtTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQG.TLVTVSSseqidno:25含D66G的TB-A的VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGJ^WVRQAPGKGIjEWMGWINTYTGEPTYADKFKGRFTFSiETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARBRGDAMDYWGQGTIaVTVS.Sseqidho:26含V83F的TB—A的VLDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKKLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTI/TISSIjQPEDFAVyYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRseqidno:27含v83a的tb-a的vlDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLL工YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSIiQPEDAAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRseqidno:28tb-a的vhh43/70/71/73/77QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGQGLEWMGW工NTYTGEPTY"ADKFKDRFTLTLDTSAGTVYMEIiTSIjTSDDTAVYYCARERGDamdywgqgt;lvtvsss邁qidno:29tb-a的vhh43/70/71qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgytfthygmnwvrqapgqglewmgwintytgeptyadkfkdrft;ltIiEtsastvyme:lts:ltsddtavyycarergd'AM咖GQGTIiVTVSSseqidno:30TB-A的VHHll/16/43/66/70/71/73/77/93/112QVQLVQSGAEDKKPGGSVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTXTGEPTYADKFKGRFTLTLDTSAGTVYMEI/rSI/rSDDTATYYCARERGDAMDYWGQGTSVTVSSseqidno:31TB-AH—M48L/F68工DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKIilYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTljTISSIiQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKIiEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQIiVQSGAEVKKP.GASVKVSCTASGYT加YGMNWVRQAPGKGIjEWIiGWINTYTGEPTYADKFKDRITFSiLETSASTVYMEKrSIiTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSseqidno:32TB-AL一V83EH一V79ADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKKLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDEAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGM卿VRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTAYMELTSLT臺(tái)'DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSseq工dho:33TB-A接頭一G2RH一F68LDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLL工YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGRGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQIiVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRLTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:34TB-AH一K43R/F68工D工VMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGRGIjEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRITFSIjETSASTVYMELTSLTSDDTAVYTCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:35TB-AH_F68LDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKliEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVQIiVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGIiEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRl/rFSIiETSASTVYMEIjTSiLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSS邁QIDNO:36TB-AH—F68ADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRTTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWRQAPGKGLEWMGW工NTYTGEPTYADKFKDRATFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:37TB-AH一F68V/F70LDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLE^RGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTLSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:38TB-AH_F70LDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTIiTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTIiSLETSASTVYMEIiTSIiTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTIiVTVSSSEQ.IDNO:39接頭G2RGRGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQ工DNO:40TB-ADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTI/riSSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWRQAPGKGLEWMGWIMTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDWGQGTLVTVSS參考下列實(shí)施例將更充分理解本發(fā)明。然而它們不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。所有參考文獻(xiàn)和專利引證在此引入作為參考。實(shí)驗(yàn)l:scFv抗體的構(gòu)建用于產(chǎn)生人源化抗人TNFoc抗體或抗體衍生物，如單鏈片段(scFv)或Fab片段的起始原料是鼠單克隆抗體Di62。D6ring等(1994，Mol.Immunol.31:10"-1067)中公開了輕鏈和重鏈可變區(qū)的序列。在同一出版物中也探討了這個(gè)單克隆抗體的性能。簡言之，Di62以濃度依賴性方式特異性結(jié)合人TNFoc。它是高親和力抗體(Kd-O.4nM)并可以阻斷TNFot結(jié)合其受體。此外，在小鼠L929細(xì)胞中，Di62抑制人TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。根據(jù)它的公開序列，構(gòu)建VL-接頭-VH方向的單鏈抗體衍生物(scFv)形式的Di62，其中接頭序列包含四個(gè)重復(fù)的四個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸殘基(Gl^Ser)4。在此，這個(gè)scFv被稱為TB-wt，VL是SEQIDNO:16而VH是SEOIDNO:17。為了a)使抗體衍生物與人序列更相似以減小潛在的免疫原性，和b)使它更穩(wěn)定和可溶的目的而人源化這個(gè)抗體衍生物，為此，TB-wtCDR序列移植在穩(wěn)定和可溶的人構(gòu)架區(qū)上(AufderderMaur等(2001)，F(xiàn)EBSLett.508:407-412;AufderMaur等(2004)，Methods34:215-224).人VL-ka卯a(chǎn)亞型I和VH亞型I被鑒定為最接近人的亞族。從人VL和VH序列庫選擇合適的受體構(gòu)架區(qū)，選擇有利的生物化學(xué)和生物物理學(xué)性能，例如穩(wěn)定性、溶解度和表達(dá)性能的那些(AufderMaur，等(2001)，F(xiàn)EBSLett.508:407-412;AufderMaur，等(2004)，Methods34:215-224)。誦3097697/EP1506236中描述了這些抗體構(gòu)架區(qū)的分離和性能。從這個(gè)庫，抗原結(jié)合性能不明確的單鏈抗體構(gòu)架區(qū)被確定為合適的受體。這個(gè)受體由人VL-kappaI結(jié)構(gòu)域(SEQIDIDNO:14)與人VHI結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:15)結(jié)合組成，在本文中，這個(gè)受體構(gòu)架區(qū)被稱為FW2.3。81個(gè)VL構(gòu)架區(qū)殘基當(dāng)中，TB-wt和FW2.3共享55個(gè)相同的氨基酸殘基，折合67%同一性。在87個(gè)VH構(gòu)架區(qū)殘基當(dāng)中，TB-wt和FW2.3具有55個(gè)相同的殘基，折合63%同一性。這兩個(gè)單鏈抗體衍生物都具有相同的CDR長度，除了VH-CDR3，它在FW2.3中較長。對(duì)于兩個(gè)scFvs，CDR殘基內(nèi)的氨基酸組成是不同的。描述了將抗體可變域人源化的各種方法(Riechmann等(1998)，Nature332:323-327;Padlan，E.A.(1991).Mol.Immunol.28:489-498;Roguska等(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973;Gonzales等(2005)，TumorBiol.26:31-43;Ewert,S.，等(2004)，Methods34:184-199)。首先進(jìn)行最低限度的方法，即全部小鼠CDR環(huán)從TB-wt保守性轉(zhuǎn)移到FW2.3上。產(chǎn)生的scFv被稱為TB-B并具有SEQIDNO:3的VL序列和SEQIDNO:4的VH序列。根據(jù)Rabat編號(hào)方案定義TB-wt中的CDR-環(huán)(Kabat等(1991)，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd，Natl.Inst.Health,Bethesda，MD)并限定下列殘基(見圖l):CDR1:L24-L34(相同的Kabat編號(hào))CDR2:L50-L56(相同的Kabat編號(hào))CDR3:L89-L97(相同的Kabat編號(hào))VHCDR1:H31-H35(相同的Kabat編號(hào))CDR2:H50-H66(Kabat編號(hào)H50-H65)CDR3:H99-H106(Kabat編號(hào)H95-H102)。這個(gè)抗體不能有效地結(jié)合TNFoc(圖4A)。下一步是測(cè)定這些組分的哪個(gè)殘基或哪些殘基應(yīng)被置換以優(yōu)化產(chǎn)生的人源化抗體的性能。由于用其他氨基酸置換人氨基酸殘基應(yīng)該減至最少，因?yàn)橥鈦戆被嵝蛄械囊朐黾涌贵w或抗體衍生物在人中的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)(Gonzales等(2005)，TumorBiol.26:31-43,因此構(gòu)建幾個(gè)變體。構(gòu)建所述變體之一在此稱為TB-BL46(VLSEQIDNO:11;VHSEQIDNO:4)，旨在將免疫原性風(fēng)險(xiǎn)降至最小，但仍顯示出足夠的結(jié)合活性。這個(gè)變體基于TB-B并在VL第46位含有一個(gè)單氨基酸改變，即R—L。這個(gè)氨基酸位于輕鏈上部核心內(nèi)并參與二聚體界面。它參與限定L-CDR1的構(gòu)象并對(duì)VH/VL包裝有影響。據(jù)報(bào)導(dǎo)亮氛酸殘基在這個(gè)特殊位置有利(PCT/US03/19333)。與TB-B相比，scFvTB-BL46保留了一些TNFot特異性結(jié)合(圖4A;Kd"100nM)。為了進(jìn)一步提高TNFot-結(jié)合活性，在VL殘基4、46、65、67、70和/或VH殘基28、43、68、70、71、72、73、76、77中一個(gè)或多個(gè)位置進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)更多交換。在此，在全部位置具有交換的變體被稱為TB-A(VLSEQIDNO:1;VHSEQIDNO:2)。此外，關(guān)于本發(fā)明的特定抗TNFot抗體，用來源于L-CDR1和L-CDR2的肽進(jìn)行的竟?fàn)幵囼?yàn)表明兩個(gè)CDR環(huán)對(duì)于scFv與抗原的結(jié)合都是重要的(D5ring等(1994)，Mol.Immunol.31:1059-1067)。在旨在將保留結(jié)合所需非人殘基數(shù)量減至最少和優(yōu)化生物物理學(xué)性能(穩(wěn)定性和溶解度)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用系統(tǒng)誘變和結(jié)構(gòu)域改組，以闡明小鼠和人源化VL和VH域之間的功能差異。通過結(jié)構(gòu)域改組獲得兩個(gè)變體。第一個(gè)變體包含來自TB-A的VL域，通過甘氨酸絲氨酸接頭(SEQIDNO:10)與來自TB-B的VH域連接，產(chǎn)生TB-AB(SEQIDNO:12)。第二個(gè)變體，TB-BA是第一個(gè)變體的反向，即，VL域來自TB-B，與TB-A的VH域結(jié)合(SEQIDN0:13)。通過TB-A的系統(tǒng)誘變產(chǎn)生另外的變體。圖l顯示了TB-A和TB-B的VL和VH序列的序列比較。TB-A和TB-B之間總共14個(gè)構(gòu)架區(qū)殘基不同(星號(hào))。它們中僅五個(gè)一一VL殘基4和70和VH殘基28、71和73在大小和性能上顯示出較小的差異，因此在這一點(diǎn)上沒有考慮用來誘變。下列構(gòu)架區(qū)位置被來自TB-B的相應(yīng)氨基酸取代。TB-A的這些單或雙突變體如下TB-AH43K—Q交界面(SEQIDNO:18)TB-AH68F—V外環(huán)VH(SEQIDNO:19)TB-AH70/72F—L，L—R外環(huán)VH(SEQIDNO:20)TB-AH76/77A—I，S—G外環(huán)VH(SEQIDNO:21)TB-AL46L—R交界面(SEQIDNO:22)TB-AL65R—S外環(huán)VL(SEQIDNO:23)TB-AL67Y—S外環(huán)VL(SEQIDNO:24)很多因素可以影響抗體或抗體衍生物的免疫原性(Gonzales等(2005)，TumorBiol.26:31-43)。為進(jìn)一步降低人源化TB-AscFv可變區(qū)的非人內(nèi)容，用來自FW2.3的相應(yīng)的人CDR環(huán)交換鼠VLCDR2和CDR3環(huán)和鼠VHCDR2環(huán)。所產(chǎn)生的構(gòu)建體在此分別稱為TB-L2(SEQIDNO:7)、TB—L3(SEQIDNO:8)和TB—H2(SEQIDNO:9)。通過基因合成產(chǎn)生編碼鼠單鏈形式單克隆抗體Di62和兩個(gè)人源化形式TB-B和TB-A的cDMs(www.genscript.com)。標(biāo)準(zhǔn)克隆程序后通過PCR驅(qū)動(dòng)的位點(diǎn)定向誘變引入其他變異體中的全部點(diǎn)突變(TB-BL46、TB-AH43、TB-AH67、TB-AH69/71、TB-AH75/76、TB-AL46、TB-AL65、TB-AL67、TB-AV83F、TB-AV83A、TB-AD66G)。使用PCR和目前技術(shù)狀況克隆程序完成用來自FW2.3的人CDR環(huán)交換TB-A的鼠CDR環(huán)。通過完全的基因合成獲得編碼SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30中公開的所有VHTB-A變體的cDNA。SEQIDNO:31至SEQIDNO:38中公開了一些更優(yōu)選的TB-A。發(fā)現(xiàn)這些抗體特別穩(wěn)定和可溶，如下面表I所示。全部scFv片段克隆入表達(dá)栽體用于在大腸桿菌進(jìn)行周質(zhì)生產(chǎn)(Krebber等(1997)，J.Immunol.Methods201:35-55)。除了如上所述的單鏈抗體衍生物(scFvs)，如下產(chǎn)生相應(yīng)的Fab片段。選擇的輕鏈可變域(VL)與人Igkappa鏈恒定區(qū)融合，同時(shí)適當(dāng)?shù)闹劓溈勺冇?VH)與人IgG的第一個(gè)(N-末端)恒定區(qū)(CHI)融合。通過PCR從人脾cDNA文庫擴(kuò)增這兩個(gè)人恒定域，產(chǎn)生CK的序列SEQIDNO:14和CHI的SEQIDNO:15。實(shí)驗(yàn)2:人源化scFv或Fab抗體的表達(dá)、生產(chǎn)和穩(wěn)定性編碼TB-wt、其人源化衍生物或Fab片段的質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌林(例如JM83)進(jìn)行周質(zhì)表達(dá)。scFv變體也以包涵體表達(dá)，例如在BL21大腸桿菌菌林中。通過包涵體的再折疊和隨后通過例如凝膠過濾純化獲得了功能性單鏈抗體。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件(dYT培養(yǎng)基，在301C誘導(dǎo)大約3小時(shí)，以200pm振蕩)常規(guī)搖瓶下，scFvs周質(zhì)表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)量在每升培養(yǎng)物0.5mg至12mg之間。通常，我們注意到，如我們預(yù)先對(duì)為穩(wěn)定性和可溶性所選構(gòu)架區(qū)的分析所預(yù)期的那樣(AufderMaur，等(2004)，Methods34:215-224)，人源化衍生物的序列與受體構(gòu)架區(qū)序列(FW2.3)越接近，在細(xì)菌中表達(dá)獲得的產(chǎn)量越高。例如，TB-B表達(dá)獲得的產(chǎn)量比TB-A表達(dá)獲得的產(chǎn)量高得多。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，降低TB-A中存在的不同氨基酸的數(shù)量對(duì)表達(dá)產(chǎn)量具有積極作用(圖3A)。本發(fā)明抗體或抗體衍生物的另一個(gè)重要特征是它們的可溶性。圖3B顯示了構(gòu)架區(qū)TB-A就在磷酸鹽緩沖鹽水中的溶解度而言優(yōu)于供體構(gòu)架區(qū)(TB-wt)的優(yōu)勢(shì)。在分析性凝膠過濾中，TB-A主要以單體狀態(tài)遷移(峰值在70ml)，而TB-wt顯示出形成聚集體的強(qiáng)烈傾向(峰值在50ml)。除了這些，通過PEG沉淀法估計(jì)TB-A及其某些衍生物的最大可溶性(AthatDH.等JBC.1981，256;23.12108-12117).簡言之，在聚乙二醇3000(PEG3000)存在下測(cè)定測(cè)試蛋白的表觀溶解度。通過測(cè)定離心的蛋白-PEG300混合物的上清液中蛋白濃度來測(cè)定溶解度曲線。所有曲線顯示出logS(mg/ml)與PEG3000濃度W，w/v)之間的線性相關(guān)。線性回歸向(^PEG的外推法估計(jì)測(cè)試蛋白的最大溶解度(SJ(表I)。對(duì)于TB-A，計(jì)算S咖,是大約70mg/ml。所有測(cè)試蛋白顯示出極好的溶解度。在第二個(gè)方法中，應(yīng)用被稱為自身相互作用層析(SIC)的方法估計(jì)1mg/ml濃度的TB-A(SEQIDNO:40)、TB-Alinker—G2RH一F68L(SEQIDNO:33)、TB-AH—K43R/F68I(SEQIDNO:34)和TB-AH-F68L(SEQIDNO:35)在PBS(50mM磷酸鹽pH6.5，150mMNaCl)中的分子間引力/排斥力。在這個(gè)方法中，感興趣蛋白固定在多孔固定相上并裝填入柱。游離(流動(dòng)相)和固定的蛋白之間的相互作用被檢測(cè)為保留體積的變動(dòng)。根據(jù)Tessier，PM等.BiophysJ.2002，82:1620-1632計(jì)算蛋白o(hù)smoticsecondvirion系數(shù)B22，其是分子間引力/排斥力的尺度(表D。B22正數(shù)越高，測(cè)試蛋白的分子間引力越低，因此它的溶解度越高。由于測(cè)試蛋白序列的高度相似性，假定不同蛋白的B22值可以直接彼此比較。表I:TB-A衍生物的溶解度特性序列PlLogS隨B22值(SIC)TB-A7.81.81±0.13-24.5x10一4±3.8xl(TTB-AH-M48L/F68I7.8ndndTB-AL—V83EH一V79A6.58ndndTB-Alinker一G2RH-F68L8.21.91土0.091.59xl0—3土5.9x10—5TB-AH一K43R/F6817.81.86士0.021.28xlO-3土3.0xi(T4TB-AH一F68L7.81.88±0.071.06x10_4±2.9xl(T5TB-AH一F68A7.8ndndTB-AH一F68V/F70L7.8ndndTB-AH一F70L7.8ndnd本發(fā)明抗體或抗體衍生物的另一個(gè)相關(guān)特征是它們的高穩(wěn)定性。通過經(jīng)圃二色光鐠和光散射在218和292nm測(cè)定伸展開始的溫度，評(píng)價(jià)TB-A、TB-AH-M48L/F68I(SEQIDNO:31)、TB-ALinker_G2RH-F68L(SEQIDNO:33)、TB-AH—K43R/F68I(SEQIDNO:34)和TB-AH-F68L(SEQIDNO:35)的蛋白穩(wěn)定性(表II)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，TB-A在53t:的溫度開始伸展，而它的衍生物TB-AH—M48L/F68I(SEQIDNO:31)、TB-ALinker-G2RH-F68L(SEQIDNO:33)、TB-AH-K43R/F68I(SEQIDNO:34)和TB-AH_F68L(SEQIDNO:35)顯示出熱穩(wěn)定性增加(56t:和58X:)。所有的測(cè)試蛋白在伸展時(shí)顯示出不可逆變性作用和沉淀，使得不可能測(cè)定熔解溫度。為了測(cè)定可逆過程中轉(zhuǎn)變(transition)中點(diǎn)，用鹽酸胍(GdnHCl)誘導(dǎo)伸展以保持伸展蛋白在溶解狀態(tài)。在這個(gè)方法中，熒光發(fā)射最大通過熒光測(cè)定法測(cè)定，以跟蹤伸展。在這個(gè)設(shè)置中，TB-A再次顯示出好的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)變中點(diǎn)在2.07MGdnHCl。與熱力伸展引起的結(jié)果一致，衍生物TB-ALinker_G2RH—F68L(SEQIDNO:33)和TB-AH—K43R/F68I(SEQIDNO:34)顯示出穩(wěn)定性增加，因?yàn)轱@示出較高的轉(zhuǎn)變中點(diǎn)，分別是2.33和2.3MGdnHCl。表II:TB-A衍生物的穩(wěn)定性特性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>通過在各個(gè)體液或作為陽性對(duì)照的試驗(yàn)緩沖液(TBSTM)中37C孵育3天后測(cè)定TB-A的TNFoc結(jié)合活性，檢測(cè)TB-A在人血清、人尿液、豬玻璃體液和豬前房液中的穩(wěn)定性。TB-A在體液中稀釋為lOpM的終濃度。孵育期后，為了測(cè)定TB-A的結(jié)合常數(shù)Kd，用ELISA檢測(cè)系列稀釋樣品(圖ll)。當(dāng)體液樣品與陽性對(duì)照TBSTM樣品比較時(shí)，l向更高濃度變化表明孵育期間活性蛋白減少。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)中，沒有檢測(cè)到這樣的變化，表明由于抗體的高穩(wěn)定性，完全活性的TB-A量在每種體液試驗(yàn)中保持恒定。實(shí)驗(yàn)3:人源化抗體衍生物的結(jié)合特性在ELISA中，測(cè)試所有人源化scFv變體與重組人TNFot的結(jié)合性能。所有變體的解離常數(shù)'(Kd)位于0.8至10'000nM以上的范圍內(nèi)。似乎在與人受體構(gòu)架區(qū)的同源性等級(jí)和各個(gè)結(jié)合物的親和力之間存在反向相關(guān)性(圖4A)。然而，含有朝向TB-B序列突變的一些TB-A變體顯示出與TB-A相當(dāng)?shù)呐c人TNFcx的親和性水平。圖4B顯示了在ELISA中比較時(shí)顯示出與TB-A相似親和力的兩個(gè)表達(dá)產(chǎn)量提高的TB-A衍生物(比較圖3A)。TB-A代表表達(dá)產(chǎn)量和親和力明顯權(quán)衡之間好的折衷。在親和力方面，單鏈和Fab片段形式的TB-A之間沒有檢測(cè)到顯著的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。通過表面等離子共振(BIACore)也測(cè)定了TB-A對(duì)TNFoc的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)，得到離解常數(shù)Kd=0.8nM，k附解離速率-4.4x10—和k。n結(jié)合速率-5xl05s_1M—\實(shí)驗(yàn)4:L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)抗體或抗體衍生物在體內(nèi)中和TNFot的作用可通過測(cè)定抑制TNFa對(duì)培養(yǎng)的小鼠L929成纖維細(xì)胞或作為替代方案對(duì)人KYM-1骨髄肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性來檢測(cè)(表III)。Di62的人源化scFv衍生物在L929試驗(yàn)中顯示出不同的功效，如圖5B所示。一些scFv衍生物顯示出5ng/ml范圍內(nèi)的IC5Q(達(dá)到50%抑制的抑制濃度)值，而其他的在L929試驗(yàn)中沒有效果。ELISA數(shù)據(jù)和L929試驗(yàn)的結(jié)果并不總是相關(guān)。然而，KYM-1數(shù)據(jù)和L929結(jié)果極好地相關(guān)，唯一的不同是重組人TNF的濃度高很多和因此看到作用所需的拮抗劑濃度也高很多。因此HM-1主要用于證實(shí)L929結(jié)果。為了測(cè)試蛋白的直接比較，用對(duì)TB-A標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)值(EC5。X/EC5。TB-A)表示效能。然而結(jié)合者的序列與人受體構(gòu)架區(qū)(FW2.3)越接近，通常IC50值再次變得更高。圖5比較了TB-A不同衍生物阻斷TNFot誘導(dǎo)的對(duì)小鼠L929成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效力。在45Onm的吸光度與細(xì)胞存活率相關(guān)。TB-A和抗hTNFotIgGInfliximab⑧(英夫利昔單抗)在L929試驗(yàn)中顯示出相似的IC50值，而TB-wt阻斷人TNFoc誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的效力顯著較低(圖5A)。當(dāng)TB-A衍生物與TB-A比較它們阻斷TNFot誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效力時(shí)，這些衍生物中大多數(shù)在L929中都具有降低的功效，除了TB-H43(圖5B)。表III:TB-A衍生物的功能特性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>與ELISA數(shù)據(jù)一致，scFv和Fab形式的TB-A之間在阻斷TNFoc誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力上沒有顯著差異(圖5C)。TB-AFab形式的IC5。值是TB-AscFv形式的ICs。值的大約2倍(圖5C)，最可能是Fab片段分子量更高的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)5.用抗TNFot抗體衍生物進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)5.1.實(shí)驗(yàn)說明為了測(cè)試ESBATech's抗TNFa抗體衍生物(scFv和Fab)在體內(nèi)情況下功能性中和人TNFa生物活性的功效，使用最近公開的大鼠急性單關(guān)節(jié)炎模型。Bo1on和同事們已經(jīng)廣泛描述了這個(gè)模型(參見Bo1on等(2004)，Vet.Pathol.41:235-243)。簡言之，在這個(gè)動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型中，人TNFot通過關(guān)節(jié)內(nèi)注入雄性Lewis大鼠膝關(guān)節(jié)。人TNFa的注射引起被注射關(guān)節(jié)的急性、自限性單關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎可以根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹和組織學(xué)得分的測(cè)定結(jié)果來定量。因此，各個(gè)TNFoc拮抗劑的生物活性可以通過TNFot誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹的降低和/或炎癥的組織學(xué)參數(shù)的降低來定量。5.2.材料和方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)當(dāng)前的研究被設(shè)計(jì)用于研究如上所述抗體系列中的代表性scFv抗體和代表性Fab抗體與市售抗體英夫利昔單抗(!^111^&(16@)抑制適當(dāng)?shù)膭?dòng)物關(guān)節(jié)炎模型中人TNFoc生物活性的各自潛力。Bolon和同事們已經(jīng)表明10微克重組人TNFoc通過關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用于大鼠膝關(guān)節(jié)激起可通過標(biāo)準(zhǔn)宏觀和微觀分析定量的急性、自限性單關(guān)節(jié)炎。因此這個(gè)動(dòng)物模型充當(dāng)估計(jì)局部應(yīng)用抗體衍生物的治療作用的理想系統(tǒng)。系列完成了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)(表IV和V)，l)估計(jì)抗體阻斷人TNFcx誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎的總體潛力的基本功效研究；和2)估計(jì)抗體衍生物彼此之間相對(duì)功效的劑量反應(yīng)研究。細(xì)胞因子和抗體衍生物都是通過分開注射給予一次，如下所述。使用的細(xì)胞因子劑量基于Bolon和同事們的出版物，而抗體衍生物的劑量范圍基于可利用的細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)和有根據(jù)的推測(cè)。根據(jù)一般的動(dòng)物管理準(zhǔn)則實(shí)施實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物和飼養(yǎng)將年輕的、成年雄性Lewis大鼠(6-7周和175-200g)隨機(jī)分配至處理組(n-3/組)并根據(jù)Bolon等(2004)，Vet.Pathol.41:235-243關(guān)養(yǎng)。細(xì)胞因子和抗體滴注如Bolon和同亊們的描述實(shí)行麻醉和細(xì)胞因子注射。為了不超過50微升的關(guān)節(jié)內(nèi)注射總體積，細(xì)胞因子和抗體衍生物以兩個(gè)分開的關(guān)節(jié)內(nèi)注射滴入，借此10微克重組人TNFot在IO微升過濾除菌的磷酸緩沖鹽水(PBS)中注射而各個(gè)抗體的各自劑量在40微升過濾除菌的磷酸緩沖鹽水中注射。腹膜內(nèi)應(yīng)用英夫利昔單抗/Remicade⑧處理的動(dòng)物在關(guān)節(jié)內(nèi)注射人TNFoc前3小時(shí)通過腹膜內(nèi)注射抗體衍生物。在關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用抗體治療處理的所有動(dòng)物中，注射人TNFot前5分鐘注射各個(gè)抗體劑量。對(duì)照動(dòng)物注射無人TNFoc的IO微升PBS,實(shí)驗(yàn)中使用的英夫利昔單抗/Remicade⑧購自瑞士官方藥房。在大腸桿菌中表達(dá)抗人TNFoc特異性scFv和Fab(TB-A)抗體以及在劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中用作非特異性對(duì)照抗體的天然scFv抗體構(gòu)架區(qū)并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。所有制劑中內(nèi)毒素污染低于每毫克蛋白10EU，因?yàn)橹嗵浅煞质怯辛Φ腡NFoc誘導(dǎo)劑。重組人TNFot購自PeproTechBCLtd。關(guān)節(jié)直徑的測(cè)定在注射分別通過腹膜內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的抗體衍生物之前或在對(duì)照動(dòng)物的情況下，在注射PBS或TNFoc之前即刻用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)徑器測(cè)定被注射的膝關(guān)節(jié)直徑。注射TNFot(或在對(duì)照動(dòng)物是PBS)后48小時(shí)和殺死動(dòng)物之前即刻再次測(cè)定注射膝關(guān)節(jié)的直徑并用第一個(gè)直徑測(cè)定值減去第二個(gè)直徑測(cè)定值來計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹(圖6和9)。組織處理注射TNFa(或在對(duì)照動(dòng)物的情況下是PBS)48小時(shí)后，殺死動(dòng)物。尸體解剖時(shí)，將注射的膝蓋與足和股分開，浸入70%乙醇中固定完好并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精和伊紅(HE)染色，如Bolon和同事們所述。形態(tài)學(xué)分析如Bolon和同事們的描述進(jìn)行測(cè)定關(guān)節(jié)炎癥的組織學(xué)評(píng)分分析，應(yīng)用根據(jù)Bolon和同事們的評(píng)定關(guān)節(jié)炎癥的組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(圖7、8和10)。5.3.結(jié)果在第一組實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)下表IV，將代表性的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的ESBATechscFv抗體,TB-A，和相應(yīng)的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的ESBATechFab抗體阻斷誘導(dǎo)急性單關(guān)節(jié)炎的能力和關(guān)節(jié)內(nèi)和腹膜內(nèi)應(yīng)用的英夫利昔單抗/Remicade⑤進(jìn)行比較表IV:注射方案實(shí)驗(yàn)l<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>圖6呈現(xiàn)了獲得的關(guān)于處理對(duì)膝直徑改變的影響(作為對(duì)TNFot誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹的影響的指示)的結(jié)果。所有抗體完全阻斷了TNFoc誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹。為評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎癥的治療效果，實(shí)行HE染色組織玻片的組織學(xué)評(píng)分。通過下列標(biāo)準(zhǔn)為關(guān)節(jié)炎癥打分(參見圖7中代表性評(píng)分實(shí)例)得分0:正常得分1:滑膜襯里層輕微增厚得分2:滑膜襯里層增厚和襯里下層輕微炎癥得分3:滑膜襯里層增厚和襯里下層中等炎癥圖8顯示了獲得的關(guān)于對(duì)組織病理炎癥得分的治療效果的結(jié)果。觀察到所有治療對(duì)組織病理炎癥得分具有相類似的效果。在第二組實(shí)驗(yàn)中，比較了對(duì)評(píng)價(jià)的抗體衍生物的相對(duì)劑量反應(yīng)。根據(jù)表V，將實(shí)驗(yàn)1的代表性的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的ESBATechscFv抗體TB-A和相應(yīng)的關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)用的Fab抗體與關(guān)節(jié)內(nèi)和腹膜內(nèi)應(yīng)用的英夫利昔單抗/Remicade⑧和缺乏任何與人TNFoc的結(jié)合活性的無關(guān)scFv抗體在比實(shí)驗(yàn)l更寬和不同的劑量范圍內(nèi)相比。表V:注射方案實(shí)驗(yàn)2<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>圖9顯示了獲得的關(guān)于處理對(duì)膝直徑改變的影響(作為對(duì)TNFoc誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹的影響的指示)的結(jié)果。圖IO提供了獲得的關(guān)于對(duì)組織病理炎癥得分的治療效果的結(jié)果?？傊硇缘腅SBATech抗TNFascFv和代表性的ESBATech抗TNFaFab抗體二者在局部(關(guān)節(jié)內(nèi))給藥后阻斷人TNFot誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎方面都非常有效。盡管顯示和描述了目前本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但是會(huì)清楚地理解本發(fā)明不限于它們，而是可以在下列權(quán)利要求范圍內(nèi)另外進(jìn)行各種實(shí)施和實(shí)踐。權(quán)利要求1.特異性結(jié)合TNFα的穩(wěn)定和可溶的抗體或抗體衍生物，所述抗體或抗體衍生物包含是或衍生自序列SEQIDNO1的輕鏈可變域(VL)，其與是或衍生自序列SEQIDNO2的重鏈可變域(VH)組合，其中在衍生序列的情況下，所述序列在所述VL域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)具有最多達(dá)到5個(gè)改變和/或在所述VH域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)具有最多達(dá)到9個(gè)改變。2.權(quán)利要求1的抗體或抗體衍生物，其中VL的改變是在第4、46、65、67、70和/或83位中的一個(gè)或多個(gè)位置，而VH的改變是在第11、16、28、43、68、70、71、72、73、76、77、93和/或112位中的一個(gè)位置。3.權(quán)利要求1的抗體或抗體衍生物，其中VL的改變是在第4、46、65、67、70和/或83位中的一個(gè)或多個(gè)位置，而VH的改變是在第11、16、28、43、48、68、70、71、72、73、76、77、79、93和/或112位中的一個(gè)或多個(gè)位置。4.在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或抗體衍生物，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生在對(duì)于VL而言，SEQIDNO:3和/或?qū)τ赩H而言，SEQIDNO:4中存在的氨基酸。5.在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或抗體衍生物，其中VL域包含序列SEQIDNO:1。6.權(quán)利要求5的抗體或抗體衍生物，包含序列SEQIDNO:2的VH域。7.權(quán)利要求5的抗體或抗體衍生物，包含衍生自序列SEQIDNO:2的VH域，其中F68轉(zhuǎn)變?yōu)锳、L、I或V。8.權(quán)利要求1的抗體或抗體衍生物，包含序列SEQIDNO:11的VL域和序列SEQIDNO:4的VH域。9.在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或抗體衍生物，其中在至少一個(gè)CDRs中至少一個(gè)氨基酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)閂L序列SEQIDNO:5和/或VH序列SEQIDNO:6或SEQIDNo:25的相應(yīng)CDR中存在的殘基。10.權(quán)利要求9的抗體或抗體衍生物，其中組VLCDR2、VLCDR3、VHCDR2或VHCDR3中的至少一個(gè)CDR轉(zhuǎn)變?yōu)閂L序列SEQIDNO:5和/或VH序列SEQIDNO:25或SEQIDNo:6的相應(yīng)CDR。11.權(quán)利要求10的抗體或抗體衍生物，具有VL序列SEQIDNO:7或SEQIDNO:8和VH序列SEQIDNO:2。12.權(quán)利要求10的抗體或抗體衍生物，具有VL序列SEQIDNO:1和VH序列SEQIDNO:4或SEQIDNO:9或SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。13.權(quán)利要求10的抗體或抗體衍生物，具有VL序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:27和VH序列SEQIDNO:30。14.在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體或抗體衍生物，其對(duì)人TNFoc具有特異性。15.在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體衍生物，其是scFv抗體，其中VL和VH域通過接頭連接。16.根據(jù)權(quán)利要求15的scFv抗體，包含VL-接頭-VH序列排列方式。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的scFv抗體，其中接頭具有序列SEQIDNO:IO或衍生自所述序列。18.權(quán)利要求17的scFv抗體，其中所述接頭的至少一個(gè)G轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性更大或帶電荷的氨基酸。19.權(quán)利要求18的scFv抗體，其中接頭具有序列SEQIDNO:39。20.根據(jù)權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)的抗體衍生物，其是Fab片段，其中VL域與人Igkappa鏈恒定區(qū)融合，VH域與人IgG的CHI域融合，且兩個(gè)融合多肽通過鏈間二硫鍵連接。21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的scFv抗體或Fab片段，其是被標(biāo)記的或被化學(xué)修飾的。22.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物的DM序列。23.含有根據(jù)權(quán)利要求22的DNA序列的克隆或表達(dá)栽體。24.用根據(jù)權(quán)利要求23的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，是原核或真核細(xì)胞，特別是大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。26.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物分子的方法，包括在允許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24或25的宿主細(xì)胞，和從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。27.權(quán)利要求l-21任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物作為藥物。28.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物用于生產(chǎn)治療與TNFa相關(guān)的疾病或作為體外診斷劑檢測(cè)該疾病的藥物的用途，所述疾病特別是骨關(guān)節(jié)炎、眼色素層炎、炎性腸病。29.診斷或治療組合物，包含與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑組合的權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體。30.組合制劑，包含權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體和至少第二種化合物。31.權(quán)利要求30的組合制劑，其中第二種化合物不是對(duì)TNFoc特異性的抗體。32.權(quán)利要求30或31的組合制劑用作藥物。33.權(quán)利要求23的載體作為在人和/或動(dòng)物中基因治療應(yīng)用的藥物。34.治療與TNFa相關(guān)的疾病的方法，其中局部或外用給予權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物。35.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)中限定的任何VL和/或VH序列在表達(dá)載體中的用途。36.穩(wěn)定的含水藥物制劑，包含未經(jīng)受在先凍千的治療有效量的權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物、pH約4.8至約5.5的醋酸鹽緩沖液、表面活性劑和多元醇，其中該制劑缺乏促進(jìn)張力(tonicifying)量的氯化鈉。37.權(quán)利要求36的制劑，其是等滲的。38.權(quán)利要求36或37的制劑，其在約2-81C溫度下至少一年是穩(wěn)定的。39.權(quán)利要求36至38任一項(xiàng)的制劑，其在制劑凍融后是穩(wěn)定的。40.權(quán)利要求36至39任一項(xiàng)的制劑，其在約30t:溫度下至少一月是穩(wěn)定的。41.權(quán)利要求36至40任一項(xiàng)的制劑，其中多元醇是非還原糖。42.權(quán)利要求36至41任一項(xiàng)的制劑，其中非還原糖是海藻糖。43.權(quán)利要求36至42任一項(xiàng)的制劑，其中非還原糖是蔗糖。44.權(quán)利要求36至43任一項(xiàng)的制劑，其中抗體是抗體片段。45.權(quán)利要求44的制劑，其中抗體片段是scFv。46.權(quán)利要求36至45任一項(xiàng)的制劑，其中該抗體結(jié)合TNFot。47.權(quán)利要求36至46任一項(xiàng)的制劑，其在約2-8X:溫度下至少兩年是穩(wěn)定的。48.權(quán)利要求36至47任一項(xiàng)的制劑，其中制劑中抗體的濃度是約0.1至約50mg/ml。49.權(quán)利要求36至48任一項(xiàng)的制劑，其中表面活性劑是聚山梨酯。50.權(quán)利要求45的制劑，其中scFv結(jié)合TNFoc。51.權(quán)利要求36至50任一項(xiàng)的制劑，其中醋酸鹽以約5-30mM的量存在。52.權(quán)利要求51的制劑，其中醋酸鹽以10-30mM的量存在。53.權(quán)利要求50至52任一項(xiàng)的制劑，進(jìn)一步包含防腐劑。54.權(quán)利要求53的制劑，其中防腐劑是苯甲醇。55.權(quán)利要求50至54任一項(xiàng)的制劑，其中抗體以約30-50mg/ml的量存在。56.權(quán)利要求55的制劑，其中緩沖液是10-30mM，pH5的醋酸鈉，多元醇是約2-10%w/v的海藻糖，表面活性劑是約0.01-0.1%v/v的聚山梨酯，其中該制劑進(jìn)一步包含苯甲醇作為防腐劑且其中該制劑在約2-8"C溫度下至少兩年是穩(wěn)定的。57.—種制造的產(chǎn)品，包含容納穩(wěn)定的含水藥物制劑的容器，該制劑包含未經(jīng)受在先凍干的治療有效量的抗體、pH約4.8至約5.5的醋酸鹽緩沖液、表面活性劑和多元醇，其中該制劑缺乏促進(jìn)張力量的氯化鈉。58.權(quán)利要求57的產(chǎn)品，其中抗體是權(quán)利要求l-n任一項(xiàng)的抗體或抗體衍生物。全文摘要本發(fā)明特別地涉及對(duì)TNFα特異性的穩(wěn)定和可溶的scFv抗體和Fab片段，其包含特異性輕鏈和重鏈序列，這些序列針對(duì)穩(wěn)定性、可溶性、體外和體內(nèi)與TNFα的結(jié)合性以及低免疫原性被優(yōu)化。所述抗體被設(shè)計(jì)用于診斷和/或治療與TNFα相關(guān)的紊亂。還公開了表達(dá)本發(fā)明重組抗體的核酸、載體和宿主細(xì)胞，分離它們的方法和所述抗體在藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/53GK101233154SQ200680028415公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2006年6月6日優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日發(fā)明者A·奧夫德莫爾,A·巴爾貝里斯,D·M·烏雷奇,P·利希特萊,S·埃韋特申請(qǐng)人:艾斯巴技術(shù)股份公司