專利名稱：診斷人類乳頭狀病毒(hpv)感染的熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在臨床樣品中診斷人乳頭狀病毒(HPV)感染并區(qū)別出一組高危型HPV的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)及熒光檢測方法，屬于生命科學(xué)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法特別涉及一種利用多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)熒光檢測方法，以及利用所述方法在單一管PCR反應(yīng)管中同時檢測多種高危HPV基因型的熒光檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
研究表明，人乳頭狀病毒(HPV)與宮頸癌有著密切關(guān)系，是重要的致癌因子，同時也是引發(fā)宮頸癌的必要條件之一。分子流行病學(xué)已經(jīng)清楚證明一定類型的HPV(被稱之為高危型HPV)是引起宮頸癌的主要原因。宮頸癌已成為世界上女性癌癥的第二號殺手。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)報告，全球每年宮頸癌造成28.8萬婦女死亡(http://www.who.int/vaccine_research/diseases/hpv/)，全球每年新增加發(fā)病例約51萬，其中80％發(fā)生在發(fā)展中國家(非洲6.8萬人，拉丁美洲7.7萬人，亞洲24.5萬人)。我國宮頸癌的發(fā)病率占世界的1/4(約13.5萬)，每年新發(fā)病例數(shù)超過13萬，約2萬人因此而死亡。所以，預(yù)防、診斷和治療宮頸癌對維護婦女健康具有十分重要的意義。
宮頸癌的發(fā)生經(jīng)歷一系列的癌前病變過程，即宮頸上皮不典型增生(病理上稱宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN))，根據(jù)嚴重程度分成三級宮頸上皮內(nèi)輕度瘤變(CIN I)、宮頸上皮內(nèi)中度瘤變(CIN II)和宮頸上皮內(nèi)高度瘤變(CIN III)，這些癌前病變均有可能發(fā)展為宮頸浸潤癌。CIN被認為主要由HPV感染引起，并不是所有的HPV感染者和CIN都會進展為癌，進展的幾率與感染的HPV型別和細胞病變程度有關(guān)，特定類型的HPV感染能提高侵染性疾病的發(fā)生機率。已鑒別有90多種HPV基因型中，有40多種可感生殖腔(de VilliersE-M.Taxonomic classification of papillomaviruses.Papillomavirus Rep 2001；1257-63)。目前將能感染生殖腔的HPV分為兩類與宮頸癌低相關(guān)(低危)型和高度相關(guān)(高危)型。低危型HPV主要在生殖器官表面疣中發(fā)現(xiàn)，高危型常與浸潤性腫瘤伴生。據(jù)近期的研究結(jié)果揭示，高危型HPV有13到19個型，其中只有11個型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56和58型)已被一致確定為高危型。Nubia 等人2003年發(fā)表的研究結(jié)果認為有15種高危型(新增加的為59，68，73，82型)及三種可能的致癌型(26，53和66型)(Nubia ，et al，Epidemiologic Classification of Human PapillomavirusTypes Associated with Cervical Cancer，The new england journal of medicine 2003，5t8-527)。其它幾種也被認為是高危型并加以檢測HPV基因型有HPV67(Martin Moberg，et al，Real-Time PCR-BasedSystem for Simultaneous Quantification of Human Papillomavirus Types Associated with High Riskof Cervical Cancer JOURNAL 0F CLINICAL MICROBIOLOGY，July 2003，p.3221-3228 Vol.41，No.7)、HPV69(Bosch FX，et al，Prevalence of Human papillomavirus in cervical cancera worldwideperspectlve.International Biological Study on Cervical Cancer(IBSCC)Study Group.J Natl CancerInst 1995，87796-802)、HPV70(Eileen M.Burd，Human Papillomavirus and Cervical CancerCLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS，2003，1-17.)等。HPV-16主要在宮頸鱗狀上皮細胞癌中發(fā)現(xiàn)，而HPV-18主要見于宮頸腺癌。研究資料表明，HPVl6型就與50％以上的宮頸癌相關(guān)，最常見的高危型HPV16、HPV18只占可導(dǎo)致宮頸癌HPV的50-70％，而已知的13種型別高危型HPV(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等)，HPV單獨及合并感染可導(dǎo)致98％以上的宮頸癌。基于以上研究，通過鑒別HPV感染的分子生物學(xué)特征，發(fā)明能夠快速、準確的全面檢測包含13種以上高危型HPV的方法，對于診斷和預(yù)防宮頸癌具有重要意義。
為在宮頸癌發(fā)病的早期進行診斷，應(yīng)用最廣泛的是傳統(tǒng)宮頸細胞學(xué)檢查法-巴氏涂片(thePapanicolaou-stained(Pap)smear)。該法是最早的宮頸細胞學(xué)檢查法，1949年由病理學(xué)家GeorgePapanicolaou發(fā)明，方法是收集子宮頸表面的最外層細胞，涂抹在載玻片上，經(jīng)過染色處理后，在顯微鏡下觀察包括中空細胞、上皮細胞內(nèi)核周孔環(huán)的形成在內(nèi)的組織病理學(xué)特征并作出診斷。巴氏涂片法的優(yōu)點是方法簡便，患者無痛苦，成本較低，是廣泛使用的常規(guī)宮頸癌篩查方法。自20世紀40年代開始用于宮頸癌篩查，通過巴氏涂片的篩查，已使宮頸癌的發(fā)病率及死亡率降低了1/2甚至2/3之多。該方法的缺點是取材、制片、染色、閱片等受人為主觀因素的影響很大，假陰性率大于10％-20％甚至更高(20％-30％)。由于這些缺點的限制，應(yīng)用其它的更為可靠的診斷方法如陰道鏡檢查是很必要的。
為了減少傳統(tǒng)巴氏涂片法人取材、制片、染色、閱片等為因素的影響，先后衍生出改進的細胞學(xué)檢查法電腦輔助宮頸細胞學(xué)檢測系統(tǒng)(X Song，1998)是美國人研制的一種被稱為“腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬系統(tǒng)”，用于掃描傳統(tǒng)的巴氏涂片，簡稱CCT檢查。但統(tǒng)計研究表明，該系統(tǒng)初篩的敏感性反而低于有經(jīng)驗的專業(yè)人員，所以美國食品和藥物管理局(FDA)只批準它用于實驗室的質(zhì)量控制。膜式液基薄層細胞學(xué)技術(shù)(TCT)是目前最先進的宮頸細胞學(xué)檢測技術(shù)，中國已有多家大醫(yī)院引入該系統(tǒng)，方法是醫(yī)生將采集到的細胞放入裝有細胞保存液的標本瓶中送達實驗室，制片過程由計算機程序控制。其優(yōu)點是清除了雜質(zhì)，形成一個清晰的細胞單層涂片，病理醫(yī)生可以一目了然。該法使宮頸癌尤其是癌前病變的診斷率顯著提高，因費用較高，通常只在高危人群中使用。
陰道鏡檢查法陰道鏡是一種內(nèi)窺鏡，可直接觀察宮頸和下生殖道上皮的病變，放大倍數(shù)可達10-40倍，是早期診斷宮頸癌及癌前病變的重要輔助方法之一。當(dāng)臨床可疑或細胞學(xué)檢查異常時往往建議進行陰道鏡檢查，陰道鏡與細胞學(xué)合用可以減少假陰性的發(fā)生。陰道鏡檢查對HPV感染的檢出率高達70％，盡管陰道鏡檢查在歐洲作為篩查方法被較多的使用，但大多數(shù)發(fā)達國家認為其特異性較低而不宜作篩查方法，在發(fā)展中國家則因其設(shè)備消費和成本較高，陰道鏡檢查的準確性通常受其自身及檢查者的經(jīng)驗和技術(shù)水平影響，又需要一定經(jīng)驗的專門技術(shù)人員，而無法作為篩查方法廣泛應(yīng)用。
上述幾種方法的共同缺點是需要技術(shù)熟練的操作人員，并且不能鑒別HPV脫氧核糖核酸(DNA)的存在，更不能識別高風(fēng)險和低風(fēng)險的HPV感染基因型。所以一直以來努力發(fā)展可以檢出HPV并且鑒定HPV基因型的各種技術(shù)，以對巴氏涂片法和陰道鏡檢查進行很好的補充。
HPV已被確認為宮頸癌的主要致病因子，HPV病毒特別難于在體外培養(yǎng)，不是所有的感染者有可檢測的抗體反應(yīng)。因此，DNA檢測是的非介入式測定HPV感染存在的具有最高靈敏度的檢測方法。美國FDA已批準細胞學(xué)檢查與HPV檢測聯(lián)合使用作為宮頸癌篩查方法，表明檢測HPV作為預(yù)防宮頸癌的方法已得到公認。HPV DNA的檢測方法主要有HPV的DNA檢測方法基于使用核酸探針的分子生物學(xué)技術(shù)。HPV的DNA檢測方法主要分為三類(Roger A.Hubbard，Human Papillomavirus Testing Methods ARCH PATHOL LAB MED2003127，940-945)第一類是直接探針結(jié)合法，如有HPV類型特異性探針的Sourthern印跡和點印跡，原位雜交過濾(FISH)等法，由于其低靈敏度、操作繁瑣費時及需要大量純化的HPV探針，而且這些方法不能檢測所有的致癌HPV基因型，現(xiàn)已很少采用，所以并沒有廣泛的推廣。
第二類是信號放大法，如雜交捕獲(Hybrid Capture kit，Digene Diagnostics，Silver Spring，MD，USA，http://www.digene.com)法(Digene公司)和bDNA法(Bayer公司)。雜交捕獲(Hybrid Capture)法是美國Digene公司的檢測HPV DNA的技術(shù)，是目前美國唯一獲得FDA批準可在臨床使用的一種檢測HPV DNA的檢測技術(shù)，HC2可以檢測從高危型到低危型的各種HPV，該試劑盒用的是一套核酸雜交信號擴增系統(tǒng)雜交捕獲二代試驗(HC2)HPV DNA檢測試劑，能同時檢測13種高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。在上述方法中，利用Hybrid Capture的液體雜交和普通引物PCR之后線性探針測試被認為是針對于診斷目的最合適的方法。商業(yè)化的Hybrid Capture試劑盒無須PCR擴增即可檢出臨床樣品中的HPV DNA，并且可區(qū)別出高危型和低危型。但是，使用RNA探針可能會影響試劑盒的穩(wěn)定性，并且也不能排除交叉反應(yīng)的可能。
第三類方法是基于PCR的靶序列片段擴增技術(shù)(文獻3-13)，應(yīng)用PCR對特異型HPV靶序列片段進行擴增，用型特異性的寡核苷酸探針鑒別HPV型別。
HPV DNA檢測法的優(yōu)點是取樣簡便，檢測及結(jié)果報告人為因素影響極少，適合在宮頸癌高危人群中進行大規(guī)模的初篩。該類目前主要檢測方法有型特異性PCR(Type-specific PCR)法該法根據(jù)E6、E7基因的變異區(qū)設(shè)計型特異性的引物進行PCR分析(Walboomers，1999)，其靈敏度大約在10-200個HPV拷貝每反應(yīng)，隨HPV型別不同而稍有差異。但這一方法目前主要局限于研究領(lǐng)域，因為每份樣本都需要同時作多份PCR限制了高通量的使用。
簡并/通用引物PCR 通過針對高保守的L1基因設(shè)計引物(Kleter等1999，Gravitt PE，2000)，可以在一管反應(yīng)中同時檢出多個HPV型別，隨后使用型特異性探針雜交確切分型，可區(qū)分大約40種型別。常用的引物包括簡并引物MY09/11(Bosch，1995)及其改進型PGMY09/11(Gravitt PE，1998)，SPF1/2(Reesink-Peters N，2001)，通用引物GP5/6(De Roda Husman AM，1995)和GP5+/6+(Hutchinson，1994)，SPF1/2的靈敏度達到0.5-10fg(10-200個拷貝)，PCR產(chǎn)物還可通過多種手段進行進一步分析例如序列分析，限制性長度多態(tài)性分析(RFLP，Wang TS，1999)，以及使用特異性的探針進行斑點雜交(LaconiS，2001)等。
Amplicor微孔板檢測(Microtiter Well Plate)是Roche公司的代表產(chǎn)品，該產(chǎn)品使用非簡并的系列引物混合物特異性擴增13種高危型L1區(qū)長度為170bp的片段，產(chǎn)物被固定在微孔板上的相應(yīng)捕獲分子所捕獲，隨后通過底物與酶的顯色使產(chǎn)物得以檢測。這一方法使用了TaqGold DNA聚合酶，減少了非特異性擴增并使反應(yīng)的靈敏度大為提高。由于其針對的片段更短，這一檢測手段對于檢測保存不善的樣本尤為有效，據(jù)報道(Thomas Iftner，2003)相對PGMY09/11(針對450bp的片段)其對宮頸涂片的檢出率可提高13％。
HPV分型診斷芯片 由韓國的生物醫(yī)學(xué)實驗室有限公司(Biomedlab)公司研制(TS Hwang，2003)，目前可以檢測22種HPV，方法是，將型特異性探針及對照探針(Beta球蛋白)固定在芯片上，引物包含針對Beta球蛋白的引物及針對HPV L1區(qū)的引物(在GP5/6基礎(chǔ)上作進一步修改)，PCR體系中含熒光素標記的核苷Cy3或Cy5，經(jīng)PCR擴增的靶序列DNA產(chǎn)物，與芯片雜交，最后可通過激光掃描儀獲得結(jié)果。對于多重感染的樣本，可以檢測到多個雜交信號，盡管這一方法的靈敏度和特異性均很高，但其實用性還有待進一步論證。
以上檢測HPV基因的幾種雜交法方法利用GP5/6或MY11/9通用引物或其改進引物，加上多態(tài)區(qū)的特異型探針序列，都有幾個缺點，例如，進行PCR反應(yīng)后還需要作進一步實驗才能鑒別HPV不同的亞型；而且，如樣品中存在不同的型HPV的混合感染，不同的HPV型有不同的擴增反應(yīng)效率，導(dǎo)致某些型相對于其它型有不均衡的擴增，不均衡的擴增使反應(yīng)平衡趨向于樣品中的高拷貝型，消耗了PCR反應(yīng)的組份，使拷貝數(shù)少的型不易被檢測出。
TaqMan探針熒光PCR技術(shù)(fluoresence PCR，F(xiàn)-PCR)，是由美國PE公司首先研制成功的(美國專利1994 U.S.Patent No.5538848；Holland等PNAS USA 887276-7280(1991))。TaqMan探針是一條兩端分別標記熒光基團的特異性寡核苷酸單鏈，在5′端標記熒光報告基團，在3′端標記熒光淬滅基團。在PCR反應(yīng)開始時，引物與靶序列特異性結(jié)合，Taq酶沿模板自5′端向3′端開始合成，此時探針保持完整，熒光報告基團的熒光被熒光淬滅基團淬滅，不產(chǎn)生熒光信號；當(dāng)Taq酶沿雙鏈DNA模板合成至遇到探針時，將探針5′端剪切掉，游離下來的熒光報告基團會發(fā)出報告熒光；熒光的強度隨PCR循環(huán)次數(shù)增加而增強，且與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。熒光檢測儀器透過PCR管壁能直接檢測到熒光信號的波長和長度變化，因此熒光PCR檢測能實現(xiàn)閉管實時監(jiān)測PCR過程的變化，PCR產(chǎn)物無需后續(xù)檢測和處理。它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，操作快速，結(jié)果直觀，能直接探測PCR過程中的變化，其產(chǎn)物檢測不需要做PCR后處理，無需進行凝膠電泳，完全閉管操作，有效的降低了PCR產(chǎn)物污染，進一步降低假陽性率。
熒光PCR技術(shù)的熒光探針現(xiàn)已發(fā)展成多種類型，如TaqManMGB探針，Beacon探針，F(xiàn)ret探針，Scorpion(蝎子)探針等。Taq-Man探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。TaqManMGB探針方法是在TaqMan方法之后產(chǎn)生的更新的方法，MGB的全稱為Minor GrooveBinder，它在2001年才被推出。與TaqMan探針相比，其原理是TaqManMGB探針一是在探針的3’端標記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子MGB(Minor Groove Binder)修飾基團，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標記，可以大大降低本底信號的強度，同時MGB基團可以將探針的Tm值提高10℃左右，因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。該方法具有如下優(yōu)點1、容易設(shè)計；2、探針短；3、提高配對與非配對模板間的Tm值差異；4、高特異性和高精確性；5、雜交的穩(wěn)定性好；6、低背景，改進了信噪比；7、結(jié)果重現(xiàn)性好。
Taq-Man探針熒光PCR技術(shù)已被用于檢測HPV型，Swan等(Journal of Clinicai Microbiology 35(4)886-891，(1997))用型特異性的引物和多重PCR擴增HPV16，18，31，33，35五個型HPV的L1區(qū)DNA片斷，用型特異熒光探針檢測一定PCR循環(huán)反應(yīng)后終點的反應(yīng)信號，但是該法不是實時-PCR(real-time)。Josefsson等(Journal of Clinical Microbiology 37(3)490-496，(1999))報道了用型特異性的引物PCR擴增HPV16，18，31，33，3五型HPV的E1區(qū)DNA片斷，用不同熒光標記的型特異探針實時檢測這五種HPV亞型，與Swan等的方法不同，該法應(yīng)用了Real-time PCR原理。Tucker等(Molecular Diagnosis 6(1)39-47(2001))報道了用型特異性的引物和多重PCR擴增HPV DNAE6/E7連接區(qū)的保守區(qū)，用不同熒光標記的型特異探針實時檢測HPV。HART等(Journal of Clinical Microbiology，39(9)3204-3212(Vol.39，No.2001))報道用Scorpions熒光探針分三管檢測HPV6，11，16，18，31，33，39，45，51，56十種型別。
HPV基因檢測的世界及歐洲專利有1.Fluorescent multiplex hpv pcr assays using multiple fluorophores CA2457888，EP 1421200(2001)，WO03019143(2003)，US2005175987(2005)(real-time PCR)，采用三位點法檢測HPV的E6/E7基因和L1，采用四種taqman探針檢測HPV6，11，16，18，31，33，45等七種HPV型。
2.Virus detection method，primers therefor and screening kit.CA 2450164，WO 02103050(2002)(real-time PCR)每型采用一種Scorpion探針檢測HPV6，11，16，18四種HPV型。
上述國際專利和熒光PCR技術(shù)，但是這些方法只可同時檢測較少的HPV型，而且還沒有將TaqManMGB探針的實時熒光PCR檢測方法應(yīng)用于HPV DNA的檢測的報道和專利申請。
基于以上所述，盡管HPV DNA的檢測已發(fā)展了許多種技術(shù)，開發(fā)研制一種簡單、精確、重復(fù)性好的用于檢出多種型HPV感染且并區(qū)別出高危型HPV的方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
已知與宮頸癌高度相關(guān)的高危型HPV約有20個型，臨床診斷需要一種簡單、精確、重復(fù)性好的方法，能夠同時對一系列的多種HPV進行檢測，特別是檢出HPV感染且并區(qū)別出高危型HPV的方法。熒光實時PCR(Fluorescent real-time PCR)技術(shù)結(jié)合PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量等優(yōu)點，具有操作簡單、結(jié)果判斷直觀以及無污染等特點，在臨床診斷中已被廣泛用于多種病毒病原體DNA檢測。
本方法特別涉及一種利用多重PCR檢測方法，以及利用所述方法在單一管PCR反應(yīng)管中快速、平行地同時檢測多種常見的高危HPV基因型的熒光檢測試劑盒。本發(fā)明的主要目的是提供一種診斷HPV感染的基因型試劑盒，簡便地診斷HPV感染，準確地測定高危HPV的基因型。
一般PCR僅采用一對引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段。本發(fā)明則采用多重PCR法(multiplexPCR)即多重核酸擴增法，在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上的引物、各對引物針對各自特異的靶序列進行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。采用多重PCR的原因有多種優(yōu)勢多重PCR具有高效性系統(tǒng)性經(jīng)濟簡便性等特點，能在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種高危HPV型，可大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息，更貼近臨床檢驗需求。本發(fā)明中強調(diào)針對每個HPV型的寡核苷酸序列引物和探針與對應(yīng)的HPV型特異結(jié)合，反應(yīng)體系中關(guān)鍵是含一組探針、一組特異性正向引物和反向引物，分別針對18種高危HPV型，能與相應(yīng)的高危HPV型靶序列特異性結(jié)合。通過本法制備的HPV基因型檢測試劑盒即可簡便、準確的檢測HPV感染，鑒定感染的HPV屬于高?；蛐汀?br> 本發(fā)明的方法步驟包括(1)在聚合酶和一組針對HPV各型的特異性引物存在下PCR進行擴增靶序列，產(chǎn)生靶序列擴增產(chǎn)物，針對每個HPV型的引物序列對包含有一個首先與對應(yīng)HPV型的靶序列上游第一個結(jié)合部位結(jié)合的正向引物，一個與對應(yīng)HPV型靶序列的下游第二個結(jié)合部位結(jié)合的反向引物，正向引物和反向引物可以是本說明書序列表列明的序列。(2)一個針對對應(yīng)HPV型靶序列在正向引物和反向引物之間序列的TaqMan熒光標記探針；TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。本發(fā)明的方法可以采用普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。TaqManMGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高10℃左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。探針可以是本說明書序列表列明的序列。(3)在PCR反應(yīng)開始時，針對每個型HPV的引物寡核苷酸序列與臨床樣品中的PCR擴增的DNA片段特異性結(jié)合雜交，引物與靶序列特異性結(jié)合，Taq酶沿模板自5’端向3’端開始合成，此時未與靶序列結(jié)合的探針保持完整，熒光報告基團的熒光被熒光淬滅基團淬滅，不產(chǎn)生熒光信號；當(dāng)Taq酶合成雙鏈DNA沿DNA模板移動遇到探針時，將探針5′端剪切除，游離下來的熒光報告基團發(fā)出報告熒光；熒光的強度隨PCR循環(huán)次數(shù)增加而增強，且與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈比例增長。熒光探針可以是雙標記探針(double-labeled probe)、分子信標(molecular beacon)、能量傳遞熒光探針(Fluorescent resonance energy transfer)中的一種或一種以上，用于標記探針的熒光可以是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red 640、Texas Red中的一種或二種以上。探針的3’端可以是帶有DNA小溝復(fù)合物(MGB，Minor Groove Bingding)標記。采用一個或多個不同的熒光對一個或多個不同的探針進行標記。(4)熒光檢測儀器透過PCR管壁直接檢測到在特定波長下一個或多個不同熒光信號，熒光強度變化代表對應(yīng)HPV型的靶序列擴增產(chǎn)物的數(shù)量增加，在樣本中對應(yīng)HPV型呈陽性。
本發(fā)明的特征在于，采用一步法或兩步法將HPV DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴增樣品中病毒特異片段，同時進行HPV的定量或定性熒光檢測。所述提取的樣品為子宮頸部獲得的樣品。本專利是一種多重引物的PCR方法，由2對以上至自18對多重引物，針對18種HPV基因型，各產(chǎn)物通過熒光信號在一個樣品管中同時檢測2種以上至18種HPV型別的DNA(包含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82型)。
本發(fā)明的制備過程在下述步驟中詳細描述。本發(fā)明在以下實施例中作了進一步說明，但本發(fā)明的范圍并不受實施例的限制。特別是盡管實施例中制備的試劑盒帶有18對引物和一個簡并探針及其組合，但并不能理解為本發(fā)明就局限于探針的類型和數(shù)量，凡是使用HPV DNA衍生核苷酸序列的多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)熒光PCR檢測方法和檢測試劑盒以及任何使用所述DNA熒光PCR檢測試劑盒的類似方法及試劑盒均屬于本發(fā)明保護范圍。


圖1.HPV16型重組質(zhì)粒標準品梯度稀釋的熒光PCR擴增曲線，曲線從左到右對應(yīng)的起始拷貝數(shù)分別為(1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101)圖2.HPV16型重組質(zhì)粒標準品梯度稀釋的標準曲線，R2＝0.994，說明線性關(guān)系非常好；斜率＝-3.35，PCR擴增效率為98.8％(理想情況下斜率＝-3.32，PCR效率為100％)圖3.宮頸細胞樣本HPV的熒光PCR檢測曲線示意圖具體實施方式
實施例1引物和探針設(shè)計研究表明，HPV各型基因組的L1區(qū)序列之間，既有一定的同源性即HPV保守性序列，又具有一定的多態(tài)性即型特異性，根據(jù)型特異性序列可以設(shè)計型特異性引物。本實施例檢測18種高危HPV型的引物與探針設(shè)計原理是在HPV基因組的L1區(qū)(靶序列位置約為L1區(qū)bp800-bp1200)選擇相鄰的多態(tài)性序列設(shè)計特異性正向引物和反向引物，以及探針序列，在一個反應(yīng)管進行多重PCR，同時用針對18高危型HPV的通用TAQMAN-MGB探針檢測18種高危型HPV。模板變性溫度在92-97℃；引物退火溫度在50-65℃；DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈，延伸合成互補DNA鏈的溫度在56-65℃；進行擴增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)為30-45個。表1列明了靶序列擴增產(chǎn)物的位置和最大長度。正向引物可以是序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.90對應(yīng)18種HPV型的引物及其組合，反向引物可以是序列表SEQ ID NO.91-SEQ ID NO.180對應(yīng)18種HPV型的引物及其組合，探針可以是序列表中SEQ ID NO.181-SEQ ID NO.270對應(yīng)18種HPV型的探針序列及其組合。上述引物和探針也可以是本專利權(quán)力要求1所述正向引物及反向引物之間的適合序列作為引物和探針的序列，不僅限于序列表中列明的序列。
表1.HPV靶序列擴增產(chǎn)物所依據(jù)的基因庫編號和位置

實施例2樣品制備為檢測人類婦女子宮頸化驗標本的HPV感染，從所述樣品中提取出DNA，并純化。為測試樣品DNA量是否足夠，所述的純化DNA通過檢測人基因組特有的基因進行PCR擴增，選出那些顯示人基因組特有的基因DNA擴增的DNA樣品，用于下一步HPV DNA的分析。人基因組特有的基因可以選擇珠beta-珠蛋白基因和HMBS基因引物進行PCR擴增。
陽性對照質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒的制備從表1所列來源獲得的HPV序列，于本實驗室構(gòu)建的含有HPV L1區(qū)靶序列的重組質(zhì)粒DNA作為陽性對照標準品，使用PromegapGEM-T easy vector system連接試劑盒，將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體上，然后轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，構(gòu)建18種HPV型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)重組質(zhì)粒DNA作為陽性對照品標準品，以及構(gòu)建5種HPV型(HPV6、11、42、43、44)重組質(zhì)粒DNA作為陰性對照標準品。構(gòu)建的HPV重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定。另外，從下列細胞系分離純化的DNA作為陽性對照SiHa cell line(HPV 16)和Hila cell line。上述選擇出的樣品DNA使用序列表中的一組引物組進行PCR擴增。
實施例3優(yōu)化多重PCR熒光檢測反應(yīng)對引物和探針濃度進行優(yōu)化使得在一管PCR反應(yīng)中可以同時檢測18種高危型HPV，使用ABI PRISM7000對10-1000000個拷貝的18種高危型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)陽性對照質(zhì)粒評估Ct值和Rn值，隨引物和探針的變化來優(yōu)化引物和探針濃度，用5種低危型(HPV型6、11、42、43、44)陰性對照質(zhì)粒檢測特異性，即10-10000000個拷貝的18種高危型陽性對照質(zhì)粒可被檢測出，而陰性對照質(zhì)粒不能被檢測出。PCR反應(yīng)在40微升發(fā)應(yīng)混和液中進行，反應(yīng)混合液包含有1-2單位的TAQ聚合酶，20-200nM的針對各高危型HPV的引物，探針的濃度為0.02-0.6pM。
實施例4使用本試劑盒檢測臨床樣品中HPV感染實施例4-1使用本試劑盒檢測陽性對照質(zhì)粒和性對照質(zhì)粒使用本試劑盒檢測包括18種高危型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)照陽性對照質(zhì)粒和5種低危型(HPV型6、11、42、43、44)陰性對照質(zhì)粒，結(jié)果完全符合預(yù)期。對HPV16標準品具有良好的檢測動力學(xué)范圍和線性關(guān)系(10-1000000拷貝)(圖1-2)。
實施例4-2使用本試劑盒檢測臨床樣品中HPV感染為檢測本發(fā)明試劑盒診斷HPV感染的準確性和有效性，對102例臨床樣品進行PCR擴增和熒光檢測，以檢出HPV感染以及確定高危險型HPV感染。102例在子宮頸部獲得的樣品通過實施例2中所述方法制備DNA膜板，然后再用實施例3中所述的本發(fā)明優(yōu)化的DNA擴增和分析方法檢測HPV感染(部分檢測結(jié)果見圖3)，與DIGENE HC2方法的比較，并進行DNA序列分析鑒定HPV型別，以鑒定本發(fā)明的檢測方法臨床診斷的有效性(結(jié)果見表2)。
表2.采用本發(fā)明的試劑盒和對比臨床診斷和DIGENE HC2方法的結(jié)果DNA序列測定方法獲得的檢測/鑒定基因型結(jié)果比較。



表2中，與DigeneHC2試劑比較，本發(fā)明可檢測出DigeneHC2報告的13種高危HPV型以外的高危型HPV。對102例樣品的序列測定結(jié)果，與本試劑盒檢出結(jié)果比較，本發(fā)明準確率為95.1％。本發(fā)明的診斷人類乳頭狀病毒(HPV)感染的熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑盒，檢測過程的簡單、快速，能夠方便地檢測出多種基因型，比現(xiàn)有型特異性PCR和其它相關(guān)方法有利得多?？蛇M行完善更大規(guī)模病例研究。FDA(Food andDrug Administration)證實用于快速診斷HPV感染的Hybrid Capture試劑盒近來使用率上升。據(jù)報道對于檢測和區(qū)分高或低風(fēng)險HPV感染。其準確率為98％，本發(fā)明的分析方法與Hybrid Capture試劑盒相比具有競爭性的效率及額外鑒定基因型的優(yōu)點。以上所述顯示使用本發(fā)明的HPV熒光檢測試劑盒在診斷HPV感染方法在許多方面優(yōu)于傳統(tǒng)診斷HPV的方法.
以上已清楚解釋說明本發(fā)明所述一種用于診斷高危型人類乳頭狀病毒(HPV)感染的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)熒光檢測方法，以及利用該方法制成的試劑盒檢測患者體內(nèi)分離出的DNA樣品中HPV基因型，以診斷一組高危型HPV感染。本發(fā)明試劑盒是一種能夠簡便，準確檢測HPV感染以及鑒定HPV感染類型的工具，對于子宮頸癌的早期診斷，預(yù)防和治療很有作用。
序列表檢測高危HPV的引物和TAQMAN-MGB探針寡核苷酸序列表







權(quán)利要求
1.一種診斷人類乳頭狀病毒(HPV)感染的熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的方法，包括以下步驟(1)與HPV DNA互補的寡核苷酸序列用于PCR擴增臨床樣品中獲得DNA的引物；包含一組針對HPV各個型別的引物序列和聚合酶存在靶序列(目標基因片斷)的擴增產(chǎn)物，在這里，每一個型別的引物序列包含(a)一個能與一種HPV型基因?qū)?yīng)的靶序列上游第一個位點雜交的正向引物，(b)一個能與位于一種HPV型對應(yīng)的靶序列下游的第二個位點雜交的反向引物。正向引物和反向引物可以是本說明書序列表列明的序列。(2)用于檢測HPV的熒光標記一組寡核苷酸序列探針，該探針能與位于靶序列中上述第一和第二個位點雜交之間的HPV序列雜交。探針可以是本說明書序列表列明的序列。(3)對取得的樣品進行PCR擴增，其特征在于以HPV DNA作為模板，一個反應(yīng)體系中擴增一個或多個HPV DNA目標靶序列片段。(4)采用一個或多個不同的熒光對一個或多個不同的探針進行標記，通過檢測PCR反應(yīng)體系中一個或多個不同熒光信號的變化，確定樣品中是否感染HPV，以及HPV的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測，其特征在于所述用于復(fù)合檢測的熒光探針可以是雙標記探針(double-labeled probe)、分子信標(molecular beacon)、 能量傳遞熒光探針(Fluorescent resonance energytransfer)中的一種或一種以上，用于標記探針的熒光可以是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROXTAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red 640、Texas Red中的一種或二種以上。探針的3’端可以是帶有DNA小溝復(fù)合物(MGB，Minor Groove Bingding)標記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的HPV病毒熒光檢測，其特征在于，采用一步法或兩步法將HPV DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴增樣品中病毒特異片段，同時進行HPV的定量或定性熒光檢測。所述提取的樣品為子宮頸部獲得的樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3，本專利是一種多重引物的聚合酶鏈式反應(yīng)方法，由2對以上引物同時針對模板DNA鏈進行如下反應(yīng)(1)模板變性，其特征在于，模板變性溫度在92-97℃；(2)引物退火，其特征在于，引物退火溫度在50-65℃；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈，其特征在于，延伸合成互補DNA鏈的溫度在56-65℃；(4)按步驟(1)一(3)循環(huán)進行擴增反應(yīng)，其特征在于，循環(huán)進行擴增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)為30-45個。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈式反應(yīng)方法，其特征在于反應(yīng)中引物對為2-18對多重引物，針對18種HPV基因型，以及在HPV基因型檢測試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，各產(chǎn)物通過熒光信號在一個樣品管中同時檢測2種以上至18種HPV型別的DNA(包含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82型)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷高危型人類乳頭狀病毒(HPV)感染的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)熒光檢測方法，以及利用該方法制成的試劑盒檢測患者體內(nèi)分離出的DNA樣品中HPV基因型以診斷一組高危型HPV感染。屬于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒包括一個以熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，包含針對多種HPV型的正向引物、反向引物和熒光探針，在適合的PCR條件下可在一個反應(yīng)管中同時檢測HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82等18種HPV型的DNA。由于本發(fā)明的試劑盒可以簡便快速地在臨床樣品中診斷HPV感染，準確地檢測鑒別高危型HPV的基因型，所以本發(fā)明的基因型試劑盒可應(yīng)用于子宮頸癌的早期診斷。
文檔編號G01N21/76GK101017141SQ200610033618
公開日2007年8月15日 申請日期2006年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日
發(fā)明者楊夢甦, 黃明輝, 柏干榮, 黃鶴, 傅華陽 申請人:港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司